CN111920943B - 一种枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用 - Google Patents

一种枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用。所述枯草杆菌纤溶酶由枯草杆菌菌种发酵制得。作为活性组分的所述枯草杆菌纤溶酶单独或与其他药物组合应用于治疗慢性前列腺炎的药物中。本发明中枯草杆菌纤溶酶对慢性前列腺炎显示出良好的药效作用，能抑制炎性细胞的产生。

Description

一种枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用
技术领域
本发明涉及慢性前列腺炎治疗领域。更具体地说，本发明涉及一种枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用。
背景技术
前列腺炎是由于前列腺受到微生物等病原体感染或某些非感染因素刺激而发生的炎症反应，及由此造成的患者前列腺区域不适或疼痛、排尿异常、尿道分泌物等临床表现。1995年美国国立卫生研究院于提出针对前列腺炎分为Ⅰ型(急性细菌性前列腺炎)，起病急驟，病原体感染为主要因素，常见致病菌为大肠埃希菌、肺炎克雷白菌等，表现为发热为主的全身中毒症状，和下尿路刺激为主的局部症状；Ⅱ型(慢性细菌性前列腺炎)，病原体感染为主要因素，常见为葡萄球菌属和大肠埃希菌，病程较长，时间超过3个月，反复出现下尿路刺激症状，尿培养和前列腺液细菌培养阳性；Ⅲ型(慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征)，是最常见的前列腺炎类型，约占前列腺炎的90％以上。根据患者前列腺液或精液标本中是否存有白细胞，又可再分为ⅢA(炎症性CPPS)和ⅢB(非炎症性CPPS)2种亚型，2种类型各占50％。主要表现为盆底区域的疼痛或不适，病程至少在3个月以上，同时可伴有各种排尿异常和性生活方面的症状。Ⅳ型：无症状性前列腺炎，无临床症状，仅在前列腺组织切片、精液、前列腺液中发现炎症证据。目前，有研究认为氧化应激可能是前列腺炎(特别是Ⅲ型)发病的因素之一，大量临床研究发现患有前列腺炎患者的前列腺液或精液中甚至血浆中的异前列腺素(PGF2a)、一氧化氮(NO)等高于非前列腺炎组，而抗氧化物质，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、维生素等显著下降或活性降低。氧化应激就是指体内产生过多的活性氧或体内抗氧化和或清除剂水平的减退，导致二者之间的平衡被打破，从而引起炎症或组织损害。氧化应激主要通过自由基及活性氧(ROS)而发挥作用。
慢性前列腺炎是临床泌尿男科的多发及常见性疾病，在我国约占泌尿男科患者人数的40％。临床上常用于确诊慢性前列腺炎的指标有下尿路症状；病理检测前列腺上皮组织被破坏，腺管周围间质及腺腔内有炎性细胞浸润；前列腺组织中白细胞数大于10个/高倍视野，卵磷脂小体密度降低；前列腺液和血清中免疫球蛋白(Ig)G和IgA水平升高，前列腺组织中炎症细胞因子白细胞介素IL-6，IL-8，IL-1β及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平升高等。慢性前列腺炎疼痛是一种常见的内脏痛，并最终发展成为慢性神经病理状态，疼痛特点与牵涉痛相似。尽管慢性前列腺炎不会给生命构成威胁，然而却严重影响了病人的正常生活和工作，使患者的全面生活变得千分痛苦，对患者的精神健康影响更为严重。
如今慢性前列腺炎依然没有特效的治疗方法，中医治疗是通过阻止病情进展，以达到治愈的目的。西医治疗主要使用抗生素，α-受体拮抗剂，三环类抗抑郁药以及抗胆碱药等，但前列腺组织上皮的类脂质膜能阻碍部分药物进入前列腺腺泡，存在血-前列腺屏障，因此这种治疗通常只能起到改善症状的作用，治疗后病情容易复发以及产生耐药性等副作用。
发明内容
为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用。
根据本发明的一优选实施例，枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用，所述枯草杆菌纤溶酶由枯草杆菌QK菌种发酵制得。
根据本发明的一优选实施例，枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用，作为活性组分的所述枯草杆菌纤溶酶单独或与其他药物组合应用于治疗慢性前列腺炎的药物中。
根据本发明的一优选实施例，枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用，所述枯草杆菌纤溶酶可与医药学上可接受的辅料配合制成液体药剂、胶囊剂或者片剂。
根据本发明的一优选实施例，枯草杆菌纤溶酶在治疗慢性前列腺炎药物中的应用，所述枯草杆菌纤溶酶由枯草杆菌Bacillus subtilis QK02菌种发酵制得，该菌种己保存于国家典型培养物保藏中心，菌种编号为CCTCCNO：M203078。
本发明至少包括以下有益效果：综上可知，枯草杆菌纤溶酶对慢性前列腺炎显示出良好的药效作用，能抑制炎症细胞因子白细胞介素IL-6，IL-8，IL-1β及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平，降低过氧化物的氧化损伤，并减少炎性细胞的产生，从而对慢性前列炎起到良好的治愈效果。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明一实施例不同组别的大鼠的前列腺指数。
图2为本发明上述实施例不同组别的大鼠的前列腺组织中白细胞检测结果。
图3为本发明上述实施例不同组别的大鼠的血清IL-6、IL-8和TNF-α含量。
图4为本发明上述实施例不同组别的大鼠的前列腺组织中IL-1β、SOD和MDA含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变形。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
可以理解的是，术语“一”应理解为“至少一”或“一个或多个”，即在一个实施例中，一个元件的数量可以为一个，而在另外的实施例中，该元件的数量可以为多个，术语“一”不能理解为对数量的限制。
一、枯草杆菌纤溶酶的制备
枯草芽孢杆菌Subtilisin-QK原始种子批的原始种子从发酵的大豆中由武汉大学王业富教授实验室分离得到，该菌种己保存于国家典型培养物保藏中心，菌种编号为CCTCCNO：M203078。
1、胰蛋胨培养基的制备：取胰蛋白胨15.0g，植物蛋白胨5.0g，氯化钠5.0g，加水至1000ml，PH调至7.3，121℃灭菌15min备用。
2、枯草杆菌纤溶酶的发酵：取100ml胰蛋白胨培养基，加入2ml枯草杆菌Subtilisin-QK菌种种子液，25℃培养24h，即获得纤溶酶发酵液。
3、枯草杆菌纤溶酶酶粉的获得：枯草杆菌纤溶酶发酵液10000r/min，离心分离5min。取上层清液，用4mol/L至饱和的硫酸铵溶液将上层清液中的枯草杆菌纤溶酶逐步盐析纯化并冻干，即可得到枯草杆菌纤溶酶酶粉。
或者枯草杆菌纤溶酶可从本公司武汉真福医药股份有限公司采购。
表1枯草杆菌纤溶酶信息
名称： 纤溶酶QK粉；
批号： 20180624；
物理状态： 本品为土黄色，具有本品独特气味，无异味，
主要成分 纤溶酶QK粉；
活性： 111805IU/g；
保存条件： 常温；
稳定性： 保存条件下有效期内稳定；
质检单位： 武汉真福医药股份有限公司；
提供单位： 武汉真福医药股份有限公司；
生产单位： 武汉真福医药股份有限公司；
二、试验部分
实施例1
1、试剂与动物
180-200g成年雄性SD大鼠(采购自湖北省疾病预防控制中心)。饲养于通风良好且干净整洁的动物房内，提供干净饮水与词料；
枯草杆菌纤溶酶酶粉(上述方法分离自制，纯度＞95％，或采购本公司武汉真福医药股份有限公司)；
角叉菜胶(上海源叶生物科技有限公司)；
低倍显微镜(北京普瑞赛司仪器有限公司)；
2、动物分组
大鼠50只，共分成5组，每组10只；
模型组：10只，用生理盐水灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
高剂量组：10只，用生理盐水配制浓度10000IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
中剂量组：10只，用生理盐水配制浓度5000IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
低剂量组：10只，用生理盐水配制浓度2500IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
假手术组：10只，用生理盐水配制浓度40000IU/kg的汉防己甲素药液，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
3、制作前列腺炎模型
将大鼠麻醉，四肢固定在固定板上，剪除下腹两后肢之间的毛发，于无菌条件下沿腹中线切开腹壁，逐层打开下腹，暴露膀胱，用镊子轻轻提起膀胱及两侧精囊，前列腺体位于精囊底部，暴露附于精囊内侧的前列腺背叶，模型组、高剂量组、中剂量组以及低剂量组，分别向大鼠前列腺左右腹侧叶注射1％角叉菜胶。将前列腺、精囊和膀胱复位，缝合腹壁肌肉和皮肤，消毒，纱布包扎，放回鼠笼。
假手术组，向大鼠前列腺左右腹侧叶注射注射等量生理盐水。
模型组：10只，生理盐水灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
高剂量组：10只，用生理盐水配制浓度10000IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，手术前1小时1次、手术后每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
中剂量组：10只，用生理盐水配制浓度5000IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，手术前1小时1次、手术后每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
低剂量组：10只，用生理盐水配制浓度2500IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，手术前1小时1次、手术后每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
假手术组：10只，生理盐水灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续4周；
在最后一次灌胃1小时后麻醉大鼠，剖开腹腔，充分暴露两侧前列腺腺体。
4、指标测定方法
4.1解剖学观察
肉眼观察其外观形态；
4.2前列腺指数的测定
取出称其湿重，前列腺指数常作为CNP的炎症检测指标，通过记录每只大鼠的前列腺组织的总湿重以及自身体重。公式为:前列腺指数＝前列腺组织总湿重/大鼠体重(单位:mg/g)。
4.3白细胞检测
用电子天平称取每只大鼠前列腺左侧背叶相同重量的小块前列腺，放入试管内，按4μL/mg加无菌生理盐水，并充分剪碎，成为混悬液体，用微量移液枪准确吸取20μL，加入0.38mL白细胞稀释液的试管中，充分混匀，再滴入细胞计数板上，静置2～3min，待白细胞下沉；用低倍显微镜计数细胞计数板四角4个大方格内的白细胞总数。公式为:白细胞数/L＝4个大方格内的白细胞数/4×20×107。
4.4大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平检测
取前列腺组织制备匀浆，测定前列腺组织匀浆IL-1β、MDA及SOD酶活力单位水平；作心尖采血，测定血清IL-6、IL-8和TNF-α水平。
5、临床结果
5.1解剖学观察
假手术组：大鼠前列腺组织柔软，有光泽，富有弹性，与周围其他组织之间几乎没有粘连，在解剖过程中比较容易与其他组织分开；
模型组：前列腺组织显著增大，部分坏死，柔软程度较低，无弹性，与周围组织粘连十分严重，前列腺组织表面可见暗红色或灰白色片状结节；
低剂量组：前列腺组织明显增大，柔软程度下降，失去弹性，与周围组织粘连程度较重，部分前列腺组织表面可见暗红色或灰白色片状结节；
中剂量组：前列腺组织增大不太明显，柔软程度有下降，弹性减弱，与周围组织轻度粘连，部分前列腺组织有灰白色片状结节；
高剂量组：前列腺组织增大不太明显，柔软程度稍有下降，弹性良好，与周围组织几乎没有粘连，部分前列腺组织有少量灰白色片状结节。
5.2前列腺指数的测定
与模型组比较，假手术和高剂量组的大鼠前列腺指数均降低，假手术组和高剂量组前列腺指数分别为1.23和1.31，降低率分别39.3％和35.5％，具有显著差异(P＜0.01)；中剂量组的大鼠前列腺指数为1.70，降低率为16.3％，具有明显差异(P＜0.05)；低剂量组的大鼠前列腺指数为1.91，降低率为5.8％，差异不显著(图1)。
表2各个组大鼠的前列腺指数
注：与模型组相比，*p<0.05，**p<0.01
5.3白细胞检测
假手术组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组的大鼠前列腺组织白细胞总数(平均值±标准差)分别为(6.27±0.31、13.21±0.60、7.12±0.41、9.83±0.37、11.86±0.57、)×109/L。
与假手术组比较，经角叉菜胶诱导炎症，模型组中大鼠的白细胞总数增加，差异有显著性(P＜0.01)。
与模型组相比，高剂量组、中剂量组、低剂量组的大鼠前列腺组织白细胞总数均有所降低，但白细胞总数降低的程度不同，枯草杆菌酶QK高、中、低剂量组白细胞总数降低率分别为46.1％(P＜0.01)、25.6％(P＜0.05)和10.8％。
证明枯草杆菌纤溶酶可以有效降低白细胞数量。
5.4各组大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平
5.4.1TNF-α含量检测
给药4周后，假手术组、模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组的大鼠血清TNF-α含量(平均值±标准差)分别为(125.13±24.31、45.17±12.21、52.31±17.94、81.27±14.26、108.13±11.63)。
假手术组(125.13±24.31pg/ml)TNF-α水平相比模型组(45.17±12.21pg/ml)明显上升，差异显著(P<0.05)；
与模型组相比，高剂量组的血清TNF-α含量(52.31±17.94pg/ml)降低明显，差异极显著(P<0.01)；中、低剂量组TNF-α含量有下降，但是没有显著差异(P>0.05)。
5.4.2IL-6检测
给药4周后，各组大鼠血清IL-6水平，与假手术组相比(83.18±26.41pg/ml)，模型组血清IL-6(168.26±31.27pg/ml)显著升高，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，枯草杆菌酶QK高剂量组(86.38±19.31pg/ml)的血清IL-6水平明显下降，差异具有显著性(P<0.01)，枯草杆菌酶QK中剂量组(121.72±27.82pg/ml)低剂量组(148.26±24.62pg/ml)的血清IL-6水平有下降，但是差异不具有显著性(P>0.05)。
5.4.3IL-8检测
给药4周后，各组大鼠血清IL-8水平，与假手术组相比(71.23±19.82pg/ml)，模型组血清IL-8(173.6±28.93pg/ml)显著升高，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，枯草杆菌酶QK高剂量组(78.21±21.83pg/ml)的血清IL-8水平明显下降，差异具有显著性(P<0.01)，枯草杆菌酶QK中剂量组(113.6±21.76pg/ml)低剂量组(141.21±23.83pg/ml)的血清IL-8水平有下降，但是差异不具有显著性(P>0.05)。
表3大鼠血清IL-6、IL-8和TNF-α含量
与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01,(MEAN±SD，N＝10)
5.5各组大鼠前列腺组织IL-1β、SDO和MDA水平
5.5.1IL-1β检测
各组大鼠前列腺组织IL-1β水平，与假手术组相比(70.32±19.21pg/ml)，模型组前列腺组织IL-1β(159.12±29.51pg/ml)显著升高，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，枯草杆菌酶的高剂量组(73.24±21.52pg/ml)的前列腺组织IL-1β水平明显下降，差异具有显著性(P<0.01)，枯草杆菌酶的中剂量组(87.04±17.34pg/ml)、低剂量组98.71±23.81pg/ml)的前列腺组织IL-1β水平下降也较为明显，差异具有显著性(P<0.05)。
5.5.2MDA含量检测
各组大鼠前列腺组织MDA水平，与假手术组相比(24.17±8.63pg/ml)，模型组血清MDA(52.15±7.76pg/ml)显著升高，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，枯草杆菌酶的高剂量组(26.82±6.48pg/ml)的前列腺组织MDA水平明显下降，差异具有显著性(P<0.01)，中剂量组(31.32±7.39pg/ml)的前列腺组织MDA水平明显下降，差异具有显著性(P<0.05)，低剂量组(34.31±6.74pg/ml)的血清MDA水平下降较为明显，差异具有显著性(P<0.05)。
5.5.3SOD检测
各组大鼠前列腺组织SOD水平，与假手术组相比(193.18±36.41pg/ml)，模型组血清SOD(47.48±15.16pg/ml)显著下降，差异极显著(P<0.01)；与模型组相比，枯草杆菌酶的高剂量组(186.29±29.73pg/ml)前列腺组织SOD水平明显升高，差异具有显著性(P<0.01)，枯草杆菌酶的中剂量组(151.72±33.96pg/ml)前列腺组织SOD水平明显升高，差异具有显著性(P<0.05)，低剂量组(123.26±24.62pg/ml)的血清SOD水平升高也较为明显，具备差异显著性(P<0.05)。
表4大鼠前列腺组织IL-1β、SOD和MDA含量
与模型组比较，*p<0.05,**p<0.01,(MEAN±SD，N＝10)
实施例2
1、试剂与动物
180-200g成年雄性SD大鼠(采购自湖北省疾病预防控制中心)。饲养于通风良好且干净整洁的动物房内，提供干净饮水与词料；
枯草杆菌纤溶酶酶粉(上述方法分离自制，纯度＞95％，或采购本公司武汉真福医药股份有限公司)；
阿司匹林(云南白药集团大理药业有限责任公司)；
二甲苯(新乡市正鑫化工有限公司)
2、动物分组
大鼠30只，随机分成5组，每组10只；
模型组：10只，用生理盐水灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续7天；
高剂量组：10只，用生理盐水配制浓度40000IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续7天；
中剂量组：10只，用生理盐水配制浓度20000IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续7天；
低剂量组：10只，用生理盐水配制浓度10000IU/kg的枯草杆菌纤溶酶药液，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续7天；
药物组：10只，用生理盐水配制浓度20000IU/kg的阿司匹林，灌胃，每日1次，每次3mL/kg，连续7天；
3.1二甲苯所致小鼠耳肿胀试验
末次给药1h后，将每只小鼠右耳用二甲苯(0.03ml/只)涂抹，15min后处死，沿耳廓基线剪下两耳，用9mm直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片，分析天平称重，记录结果，以两耳片重量差作为肿胀程度，比较给药组与对照组间的差异，按下列公式计算抑制率。肿胀抑制率(％)＝(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度×100％。结果见表5。
由表5可见枯草杆菌纤溶酶能较好抑制二甲苯所致小鼠耳肿胀(P＜0.05)，并与阿司匹林抗炎效果相当。
表5枯草杆菌纤溶酶对二甲苯诱导小鼠耳廓肿胀的抑制结果
组别 耳肿胀/mg 抑制率/％
模型组 5.86±0.76
高剂量组 3.29±0.57 44.03
中剂量组 4.26±0.35 27.30
低剂量组 4.88±0.47 16.72
药物组 3.37±0.25 42.29
注：与对照组比较，*P＜0.05
结果表明，枯草杆菌纤溶酶具有抑制二甲苯致大鼠足跖肿胀的作用(P＜0.05)，并与阿司匹林抗炎效果相当。其剂量越大抑制作用越强。
3.2鸡蛋清所致小鼠耳肿胀试验
末次给药1h后，将每只小鼠右后足跖皮下注射15％鸡蛋清(0.08ml/只)，用容积法测量出3h后的肿胀度，比较给药组与对照组间的差异，按下列公式计算抑制率。肿胀抑制率(％)＝(对照组肿胀度-给药组肿胀度)/对照组肿胀度×100％。结果见表6。
表6枯草杆菌纤溶酶对鸡蛋清诱导小鼠耳廓肿胀的抑制结果
组别 耳肿胀/mg 抑制率/％
模型组 0.784±0.34
高剂量组 0.389±0.48 50.39
中剂量组 0.473±0.39 39.67
低剂量组 0.530±0.43 32.40
药物组 0.401±0.31 48.85
注：与对照组比较，*P＜0.05
由表6可见枯草杆菌纤溶酶能较好抑制鸡蛋清所致小鼠耳肿胀(P＜0.05)，并与阿司匹林抗炎效果相当。
综上可知，枯草杆菌纤溶酶对慢性前列腺炎显示出良好的药效作用，能抑制炎性细胞的产生。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。

Claims (3)

1.一种枯草杆菌纤溶酶在制备治疗慢性前列腺炎药物中的应用；
所述枯草杆菌纤溶酶由编号为CCTCCNO：M203078的枯草杆菌Subtilisin-QK菌种发酵制得，制备过程如下：
1）、胰蛋胨培养基的制备：取胰蛋白胨15.0 g，植物蛋白胨5.0 g，氯化钠5.0 g，加水至1000 ml，PH调至7.3，121 ℃灭菌15 min备用；
2）、枯草杆菌纤溶酶的发酵：取100 ml 胰蛋白胨培养基，加入2 ml 枯草杆菌Subtilisin-QK菌种种子液，25 ℃培养24 h，即获得纤溶酶发酵液；
3）、枯草杆菌纤溶酶的获得：枯草杆菌纤溶酶发酵液10000 r /min，离心分离5 min；取上层清液，用4 mol/L至饱和的硫酸铵溶液将上层清液中的枯草杆菌纤溶酶逐步盐析纯化并冻干，即可得到枯草杆菌纤溶酶。
2.根据权利要求1所述的枯草杆菌纤溶酶在制备治疗慢性前列腺炎药物中的应用，其特征在于，作为活性组分的所述枯草杆菌纤溶酶单独或与其他药物组合应用于治疗慢性前列腺炎的药物中。
3.根据权利要求1所述的枯草杆菌纤溶酶在制备治疗慢性前列腺炎药物中的应用，其特征在于，所述枯草杆菌纤溶酶可与医药学上可接受的辅料配合制成液体药剂、胶囊剂或者片剂。
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