CN113244208B - Hpa在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，涉及医药技术领域，由于本药品作为甲氧基衍生物，用来治疗NAFLD与目前临床上常用的治疗NAFLD的通用药物相比，具有以下优点：(1)疗效显著，特别是能保护肝细胞，减轻血清中炎症与氧化水平；(2)此药安全性高，无毒副作用；(3)比目前市场中常用的或已经报告过有效的药物价格要明显低廉，可以减轻病人的经济负担；(4)本药可结合治疗其它药物作为复方制剂；(5)本药在治疗NAFLD时能直接保护肝细胞，降低血液中氧化水平的同时也可以明显降低血液中炎性反应，提高机体的抗氧化能力。

Description

HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用

技术领域

本发明属于医疗技术领域，具体涉及HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用。

背景技术

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)是指排除其他的肝脏脂肪变性疾病，包括过度饮酒、使用脂肪变性药物或遗传性疾病等条件后，通过影像学或组织学诊断存在肝脏内甘油三酯异常聚集、炎症浸润为主要特征的疾病。NAFLD的临床范围很广，其疾病谱包括从没有炎症的单纯性脂肪肝(NAFL)，到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝硬化(NAFC)和肝细胞癌(HCC)，随着亚洲国家工业化程度的提高，以及人们生活方式和饮食结构的改变，NAFLD的患病率不断攀升，是日益增长的形成肝硬化和肝癌的原因之一，目前已成为全球公认的第一大慢性肝病，NAFLD其发病机制至今尚未完全阐明，大部分还停留在假说阶段。近年来，随着分子生物学的发展，对疾病产生的分子机制的研究也更加深入，越来越多的研究者们发现，氧化应激过程是疾病产生过程中的重要环节，当机体受到内外环境的有害因素刺激，细胞的氧自由基产生与消除过程严重失衡，产生过多的氧化自由基，伴随着活性氧(ROS)的大量产生，氧化损伤产物如丙二醛(MDA)累积增加，抗氧化防御体系(如谷胱甘肽(GSH)、超氧化物歧化酶(SOD)等)受到破坏，出现氧化应激状态，从而导致肝细胞损伤以及炎症的产生，进而导致肝纤维化的产生甚至最终可能发展为肝硬化、肝癌。因此，寻找以一种能够保护肝细胞，减轻氧化应激和炎症反应的药物来治疗NAFLD有着重要的意义。

茴香酸对羟基苯乙酯是(p-Hydroxyphenethylanisate，HPA)是从中药中提取的天然酚酸类化合物，体内动物模型也证明了摄入酚酸化合物后可抑制高脂肪膳食诱导的小鼠血脂异常、肝脂肪变性和氧化压力，此外，还发现饲喂酚酸后高脂模型小鼠肝脏多项指标趋于正常，可见酚酸在抑制肥胖的同时还具有保护肝脏的功效。

目前在NAFLD的治疗上并无特效药，对于NAFLD治疗主要采取一般治疗和药物治疗并行的方式，一般治疗方式包括适当休息、合理饮食、适量运动等，药物治疗主要涉及抗氧化剂、肝细胞保护剂、胰岛素增敏剂、调脂药、减肥药等，但这些药物既缺乏较理想的疗效，又都具有较多的副作用，导致临床用药有一定局限性，一些研究表明，在减肥手术后NAFLD患者代谢综合征、肝脂肪变性、肝小叶炎症、肝脏纤维化均有改善，且与体质量的大量减轻和胰岛素抵抗的降低有关，虽然以上方法都有治疗效果，但是生活方式的改变(如适当控制体质量)和代谢危险因素(如糖尿病和高脂血症)的改善仍然是治疗的基础，因此针对发病机制的多靶点联合治疗或许是NAFLD治疗的研究新方向，本发明应用HPA治疗NAFLD，相相较于临床中常用的药物，优势明显，主要表现在不仅可以保护肝细胞，同时可以明显的降低大鼠氧化应激和炎症反应，减轻了NAFLD大鼠的脂肪变性程度，具有多靶点治疗作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，以解决上述背景技术中提出的的问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，由如下的原料制成：茴香酸对羟基苯乙酯(HPA)和一种或多种药物上可接受的辅料，将药物制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液，以改善药物吸收效果或便于服用。

所述辅料包括药学领域常见的填充剂、稀释剂、粘合剂、吸收促进剂和稳定剂，还可以加入香味剂和甜味剂。

HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、选择48只大鼠，作为实验对象；

步骤二、48只大鼠随机分为空白对照(CON)组12只，模型(HFD)组l2只，HPA低、高剂量组每组12只；

步骤三、CON组给予基础饲料喂养，HFD组、HPA治疗组给予高脂高糖饲料喂养；

步骤四、喂养12w后，每组各取二只大鼠处死，收集肝脏HE染色检测肝脏病理学，收集血液检测肝功能，肝脏HE染色有明显脂肪空泡，同时检测肝功能指标AST和ALT。

步骤四中，NAFLD模型组大鼠与空白对照组相比，出现明显的肝小叶和肝索结构破坏，出现大量的脂肪空泡，细胞核受到一定的挤压紧贴细胞膜，在用HPA治疗后(HPA低、高剂量组分别给予HPA0.5和2.0mg/kg/d灌胃治疗)，肝脏病理学明显得到改善，其中HPA高剂量组的改善情况更显著。

步骤四中，NAFLD大鼠模型组在接受治疗8周后，各治疗组大鼠的血清肝功能(AST和ALT)、血脂和肝脂(HDL-C、LDL-C、TG和TC)、肝脏和血清炎性因子(IL-1、IL-6和TNF-α)水平明显得到改善。

步骤四中，NAFLD大鼠模型组在接受HPA治疗8周后，各治疗组大鼠的SOD、MDA、GSH、CAT相关的氧化和抗氧化能力明显的恢复到正常水平。

步骤四中，NAFLD大鼠模型组与空白对照组相比，模型组肝脏细胞中可以发现大量的蓝紫色凋亡细胞，在HPA组中，随着剂量的增加，蓝紫色凋亡细胞明显减少。

与现有技术相比，本发明提供了HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，具备以下有益效果：

与目前临床上常用的治疗脂肪肝药物相比，本发明的药物具有以下优点：

(1)本发明疗效显著，特别是能保护肝细胞，减轻血清中炎症与氧化水平；

(2)本发明安全性高，无毒副作用；

(3)本发明比目前市场中常用的或已经报告过有效的药物价格要明显低廉，可以减轻病人的经济负担；

(4)本发明可结合治疗其它药物作为复方制剂；

(5)本发明在治疗NAFLD时能直接保护肝细胞，降低血液中氧化水平的同时也可以明显降低血液中炎性反应，提高机体的抗氧化能力。

该装置中未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现，本发明结构科学合理，使用安全方便，为人们提供了很大的帮助。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1是本发明PHA治疗NAFLD大鼠后的大鼠肝脏病理学HE染色结果示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明提供HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用技术方案：HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，由如下的原料制成：茴香酸对羟基苯乙酯(HPA)和一种或多种药物上可接受的辅料，将药物制成胶囊或丸剂、粉剂、片剂、粒剂、口服液和注射液，以改善药物吸收效果或便于服用，辅料包括药学领域常见的填充剂、稀释剂、粘合剂、吸收促进剂和稳定剂，还可以加入香味剂和甜味剂。

本发明中，优选的，HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、选择48只大鼠，作为实验对象；

步骤二、48只大鼠随机分为空白对照(CON)组12只，模型(HFD)组l2只，HPA低、高剂量组每组12只；

步骤三、CON组给予基础饲料喂养，HFD组、HPA治疗组给予高脂高糖饲料喂养；

步骤四、喂养12w后，每组各取二只大鼠处死，收集肝脏HE染色检测肝脏病理学，收集血液检测肝功能，肝脏HE染色有明显脂肪空泡，同时检测肝功能指标AST和ALT。

本发明中，优选的，步骤四中，NAFLD模型组大鼠与空白对照组相比，出现明显的肝小叶和肝索结构破坏，出现大量的脂肪空泡，细胞核受到一定的挤压紧贴细胞膜，在用HPA治疗后(HPA低、高剂量组分别给予HPA0.5和2.0mg/kg/d灌胃治疗)，肝脏病理学明显得到改善，其中HPA高剂量组的改善情况更显著。

本发明中，优选的，步骤四中，NAFLD大鼠模型组在接受治疗8周后，各治疗组大鼠的血清肝功能(AST和ALT)、血脂和肝脂(HDL-C、LDL-C、TG和TC)、肝脏和血清炎性因子(IL-1、IL-6和TNF-α)水平明显得到改善。

本发明中，优选的，步骤四中，NAFLD大鼠模型组在接受HPA治疗8周后，各治疗组大鼠的SOD、MDA、GSH、CAT相关的氧化和抗氧化能力明显的恢复到正常水平。

本发明中，优选的，步骤四中，NAFLD大鼠模型组与空白对照组相比，模型组肝脏细胞中可以发现大量的蓝紫色凋亡细胞，在HPA组中，随着剂量的增加，蓝紫色凋亡细胞明显减少。

由此可以证明，HPA有抑制细胞凋亡的作用。由以上4个方向证明，HPA可以用于NAFLD的治疗且疗效相当显著。

实施例1：PHA治疗NAFLD大鼠后大鼠肝脏组织形态和病理学观察研究

实验中采用的实验动物为SD大鼠，大鼠均为雄性，体重为180-200g，由昆明医科大学实验动物中心提供，大鼠采用大笼12只，小笼6只隔离饲养，饲养为常规饲料，自由饮食和饮水；

实验药品茴香酸对羟基苯乙酯(HPA)为日本株式会社提供；高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)试剂盒；白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒；总超氧化物歧化酶(T-SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等相关Elisa试剂盒购于Bio-Swamp公司。原位末端标记法(TUNEL)法检测试剂盒，德国BoehringerMannheim公司提供；

48只大鼠随机分为空白对照(CON)组12只，模型(HFD)组l2只，HPA低、高剂量组每组12只。CON组给予基础饲料喂养，HFD组、HPA治疗组给予高脂高糖饲料喂养。喂养12w后，每组各取二只大鼠处死，收集肝脏HE染色检测肝脏病理学，收集血液检测肝功能，肝脏HE染色有明显脂肪空泡，同时肝功能指标AST和ALT明显升高判定为脂肪肝造模成功)证实模型建立成功后，造模成功后给予相应治疗，其中空白对照组和模型组给予1mL生理盐水灌胃治疗，HPA两个剂量组分别给予HPA0.5、2.0mg/kg/d灌胃治疗，治疗时将相应药物分散于1mL生理盐水中灌胃，治疗时间为8周；

收集肝脏组织，采用组织固定液固定24h-72h后，取出，脱水透明后，依次经石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水、苏木精伊红染色，透明及中性树脂封片，完成后采用荧光倒置显微镜收集图像，从图1中可看出：空白对照组大鼠肝小叶和肝索清晰可见，没有任何脂肪变性、坏死以及组织增生；而模型组则出现明显的肝小叶和肝索结构破坏，出现大量的脂肪空泡，细胞核受到一定的挤压紧贴细胞膜；与模型组相比，各治疗组均有一定程度的好转。提示：HPA治疗NAFLD大鼠可以改善大鼠肝脏病理学情况。

实施例2：HA治疗NAFLD大鼠后大鼠肝功能及脂代谢改善情况的研究

本实验中所采用的动物和实验药品和实施例1相同，AST、ALT、HDL-C、LDL-C、TG和TC等相关试剂盒购于Bio-Swamp公司；

实验中大鼠造模和治疗和实施例1中所采用的方法相同；

用相应试剂盒检测大鼠血清AST、ALT、HDL-C、LDL-C、TG和TC等6个指标；

与空白对照组相比，模型组血清AST和ALT，血清和肝脏HDL-C、LDL-C、TG、TC均明显升高，各治疗组相较于模型组上述指标均明显降低(AST：模型组69.28±8.94mmol/L，HPA低剂量治疗组74.48±9.08mmol/L，HPA高剂量治疗组76.21±7.14mmol/L，空白对照组69.28±8.94mmol/L；ALT：模型组34.14±6.61mmol/L，HPA低剂量治疗组43.25±6.07mmol/L，HPA高剂量治疗组44.56±5.91mmol/L，空白对照组34.14±6.61mmol/L；HDL-C：模型组0.89±0.17mmol/L，HPA低剂量治疗组0.41±0.12mmol/L，HPA高剂量治疗组0.40±0.07mmol/L；空白对照组0.89±0.17mmol/L；LDL-C：模型组0.86±0.11mmol/L，HPA低剂量治疗组0.41±0.12mmol/L，HPA高剂量治疗组0.40±0.07mmol/L，空白对照组0.36±0.02u/L；TG：模型组02.94±0.49mmol/L，HPA低剂量治疗组1.73±0.15mmol/L，HPA高剂量治疗组1.63±0.11mmol/L，空白对照组1.49±0.12mmol/L；TC：模型组0.72±0.15mmol/L，HPA低剂量治疗组0.41±0.09mmol/L，HPA高剂量治疗组0.42±0.07mmol/L，空白对照组0.31±0.06mmol/L)(p<0.05)，详见附表1、2；

组别/指标	剂量/(mg/kg)	AST(U/L)	ALT(U/L)
				空白对照组	-	69.28±8.94	34.14±6.61
模型组	-	158.26±31.01*	71.45±19.23*
				低剂量组	0.5	74.48±9.08**	43.25±6.07**
高剂量组	2	76.21±7.14**	44.56±5.91**

表1 HPA对NAFLD大鼠血清肝功能指标的影响(

n＝12)注：与空白对照组相比，*P＜0.05；与模型组相比，**P＜0.05。(下同)

表2HPA对NAFLD大鼠血清血脂指标的影响(

n＝12)

实施例3：HPA治疗NAFLD大鼠后大鼠血清中抗氧化能力含量的研究

本实验中所采用的动物和实验药品和实施例1相同，SOD、MDA、GSH、CAT等相关试剂盒购自南京生物工程研究所；

实验中大鼠造模和治疗和实施例1中所采用的方法相同；

用相应试剂盒检测大鼠血清SOD、MDA、GSH、CAT四个指标；

HPA治疗组与模型组相比，得到了明显的改善，经检验治疗后四个指标p<0.05，提示：HPA治疗NAFLD大鼠可以明显的提高大鼠抗氧化能力(SOD：模型组263.09±11.87U/mg，HPA低剂量治疗组459.98±37.84U/mg，HPA高剂量治疗组446.26±48.04U/mg，空白对照组407.36±57.61U/mg；MDA：模型组2.26±0.48nmol/mg，HPA低剂量治疗组1.62±0.21nmol/mg，HPA高剂量治疗组1.29±0.12nmol/mg，空白对照组1.08±0.23nmol/mg；GSH：模型组0.74±0.07mg/g，HPA低剂量治疗组0.81±0.30mg/g，HPA高剂量治疗组1.04±0.13mg/g，空白对照组0.89±0.25mg/g；CAT：模型组5.48±1.88U/mg，HPA低剂量治疗组10.79±3.01U/mg，HPA高剂量治疗组11.02±3.10U/mg，空白对照组19.6±4.8U/mg)，详见附表3；

表3HPA对NAFLD大鼠氧化应激指标的影响(

n＝12)

实施例4：HPA对NAFLD大鼠的炎性因子影响的研究。

实验中所采用的动物和实验药品和实施例1相同；

大鼠IL-1、IL-6、TNF-α等炎性因子的Elisa试剂盒购于Bio-Swamp公司；

实验中大鼠造模和治疗和实施例1中所采用的方法相同；

用相应试剂盒检测大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α3个指标。发现PHA治疗组与模型组相比，3个指标均有明显好转(IL-6：模型组106.39±14.87pg/mL，HPA低剂量治疗组52.68±7.24pg/mL，HPA高剂量治疗组52.26±8.14pg/mL，空白对照组47.36±6.61pg/mL；IL-1α：模型组1.16±0.28ng/mL，HPA低剂量治疗组0.62±0.11ng/mL，HPA高剂量治疗组0.44±0.12ng/mL，空白对照组0.41±0.07ng/mL；TNF-α：模型组1.44±0.27ng/mL，HPA低剂量治疗组0.81±0.30ng/mL，HPA高剂量治疗组0.79±0.13ng/mL，空白对照组0.69±0.15ng/mL)，提示HPA可以明显的降低NAFLD大鼠机体炎性反应，经检验治疗后3个组p值均小于0.05。详见附表4；

表4HPA对NAFLD大鼠血清炎性因子指标的影响(

n＝12)

由于HPA治疗NAFLD的应用属于首次发现，因此，无论是HPA作为单体药物来使用，还是利用HPA作为主要成分配合其它药物做成复方试剂的应用，均在本发明的保护范围内。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (3)

1.HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，其特征在于，所述药物由如下的原料制成：茴香酸对羟基苯乙酯即HPA和一种或多种药物上可接受的辅料，将所述药物制成胶囊、丸剂、粉剂、片剂、口服液、注射液；

所述治疗非酒精性脂肪性肝病的药物在治疗非酒精性脂肪性肝病即NAFLD时能直接保护肝细胞。

2.根据权利要求1所述的HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，其特征在于，所述辅料包括药学领域常见的填充剂、稀释剂、粘合剂、吸收促进剂和稳定剂。

3.根据权利要求2所述的HPA在制备治疗非酒精性脂肪性肝病药物中的应用，其特征在于，所述辅料还包括香味剂和甜味剂。

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