CN115708823B

CN115708823B - 熊竹素在制备预防和/或治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用

Info

Publication number: CN115708823B
Application number: CN202211294275.1A
Authority: CN
Inventors: 林慧庆; 李宁; 李光; 刘言
Original assignee: Wuhan University WHU
Current assignee: Wuhan University WHU
Priority date: 2022-10-21
Filing date: 2022-10-21
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-10-21
Also published as: CN115708823A

Abstract

本发明公开了熊竹素在制备预防和/或治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用，属于生物医药技术领域。本发明通过构建体内外模型进行实验研究，结果显示熊竹素对脓毒症肺损伤具有良好的保护作用，且副作用小，可用于制备脓毒症肺损伤的保护性药物。本发明提供了熊竹素在制备脓毒症肺损伤保护性药物中新的用途，减轻组织损伤、发挥抗炎、抑制肺上皮细胞凋亡及降低氧化应激方面效果显著、副作用小，具有良好的应用前景。

Description

熊竹素在制备预防和/或治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及熊竹素在制备预防和/或治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用。

背景技术

脓毒血症(sepsis)是由一系列不良免疫反应引起的一种致死性炎症综合征，每年威胁全球数百万人的生命健康。若在早期不能得到及时控制，脓毒血症可发展为全身性炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，最终将导致包括肺、心、肝、肾等在内的多器官功能障碍(multiple organ dysfunction，MOD)。肺作为脓毒症病情进展中最易侵及的器官之一，在早期即可出现明显的病理损伤，主要表现为肺泡毛细血管通透性增加，肺泡内炎性渗出增多，肺泡上皮细胞死亡，促炎因子释放，氧化应激过度，肺组织呈现病理性损伤。临床表现为常规吸氧难以纠正的低氧血症，最终可进展为急性呼吸窘迫综合征甚至死亡。在当前的医学研究中，用细菌内毒素诱导动物脓毒症急性肺损伤模型具有造模稳定、简便易行、应用广泛的特点，是研究脓毒症肺损伤发病机制及药物制备强有力的工具，为治疗这种威胁生命的危急综合征提供了极为重要的研究载体。

熊竹素(Kumatakenin，KUM)别名华良姜素，是一种从丁香中分离得到的黄酮类单体化合物，具有强效的抗癌、免疫调节、抑制血管新生和抗高血压相关心肌重构等药理作用。国内外学者目前已经对熊竹素的的抗癌作用展开了大量研究。例如，熊竹素可通过诱导卵巢癌细胞凋亡和抑制肿瘤细胞相关巨噬细胞的激活表现出抗癌活性。专利号CN114557996A公开了熊竹素熊竹素在在制备预防和治疗高血压心肌重构药物中的应用。专利号CN103239438A公开了熊竹素在制备抑制血管异常新生药物中的应用。

尽管目前的文献报道了熊竹素的多重药理活性，但其在肺损伤，特别是脓毒症肺损伤的防治作用，尚未见国内外报道。

发明内容

本发明的目的是提供熊竹素在制备预防和/或治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明公开了熊竹素在预防和治疗脓毒症肺损伤药物研究中的临床应用价值，提出熊竹素对脓毒症肺损伤具有良好的保护作用，改善肺病理性损伤，具有显著的抗炎、抗凋亡及抗氧化效果，副作用小。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供熊竹素在制备预防和/或治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用，所述熊竹素的分子式是C₁₇H₁₄O₆，结构式如下式I所示：

优选的是，所述脓毒症肺损伤为肺病理性损伤；所述肺病理性损伤包括肺水肿、肺组织炎症及肺泡壁的完整性损害。

优选的是，所述脓毒症肺损伤包括脂多糖诱导的脓毒症肺损伤。

优选的是，所述熊竹素作为所述药物的唯一活性成分。

优选的是，所述药物还包括药学上可接受的载体或者助剂。

优选的是，所述药物的剂型包括片剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液、悬浮液或注射液。

本发明公开了以下技术效果：

本发明公开了熊竹素在制备脓毒症肺损伤保护性药物中的用途，并分别进行动物和细胞实验，动物实验以C57BL/6J野生型小鼠实验对象，通过单次腹腔注射LPS(10mg/kg)模拟脓毒症肺损伤模型，熊竹素悬液连续7天灌胃给药，从而显示其在脓毒症肺损伤保护方面的应用，结果显示，与对照组相比，熊竹素给药造模组可显著改善脓毒症小鼠肺功能、提高小鼠动脉氧饱和度、减轻肺组织病理性损伤、下调支气管肺泡灌洗液的细胞和蛋白含量、降低肺组织的炎症细胞因子表达、抑制氧化应激和凋亡水平。

细胞实验以MLE-12肺上皮细胞系为实验对象，经LPS(100μg/mL)刺激构建体外脓毒症肺损伤模型，探究熊竹素对肺上皮细胞的药理作用。结果显示，与LPS刺激组相比，熊竹素给药组可显著上调肺上皮细胞活力、降低细胞氧化应激反应和活性氧的水平、抑制细胞凋亡水平。因此，熊竹素可以发挥肺保护作用，用于制备脓毒症肺损伤的保护性药物，疗效好，毒副作用低，具有一定的前景价值。

上述可见，本发明公开了熊竹素在改善组织损伤、发挥抗炎作用、抗凋亡及降低氧化应激方面效果显著，并且副作用小，为脓毒症肺损伤的保护作用提供了更多有针对性治疗药物的可能。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为小鼠肺功能和动脉血气的检测结果，其中，A为肺潮气量，B为肺通气量，C为肺顺应性，D为呼吸系统阻力(Rrs)，E为弹性(Ers)，F为组织阻尼(Gits)，G为动脉血气中氧分压(PaO₂)水平，H为动脉血气中二氧化碳(PaCO₂)水平，I为动脉血气中HCO₃ ^-水平；

图2为小鼠肺组织损伤和生存曲线结果，其中，A为小鼠肺组织H&E染色，B为小鼠肺损伤评分，C为小鼠肺湿干重比，D为小鼠肺组织中MPO活性，E为小鼠肺泡灌洗液中总蛋白，F为小鼠肺泡灌洗液中总细胞数量，G为致死LPS剂量下(15mg/kg)，小鼠7天的生存曲线；

图3为小鼠肺组织炎症、氧化应激及凋亡相关检测结果，其中，A为小鼠肺组织中白细胞介素-1β(IL-1β)mRNA水平，B为小鼠肺组织中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)mRNA水平，C为小鼠肺组织中硫氧还蛋白1(TXN-1)mRNA表达水平，D为小鼠肺组织中过氧化还原酶1(PRDX1)mRNA表达水平，E、F为凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的蛋白表达水平及定量；

图4为MLE-12肺上皮细胞的细胞活力、氧化应激和凋亡的检测结果，其中，A为不同浓度的熊竹素刺激MLE-12肺上皮细胞6小时后，细胞活力的水平，B为LPS刺激的同时给予熊竹素孵育，MLE-12肺上皮细胞的活力，C为MLE-12肺上皮细胞活性氧(ROS)荧光染色定量的结果，D、E为凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的蛋白表达水平及定量。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，实施例中方法如无特殊说明均采用常规方法，使用试剂如无特殊说明，均为常规市售试剂或采用常规方法配置的试剂。该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

给药方式：动物实验(实施例1～3)所用熊竹素溶于含有10％DMSO、40％PEG300、5％Tween-80和45％生理盐水的助溶剂中，每天分别以20mg/kg和60mg/kg的剂量给予小鼠灌胃，连续一周；细胞实验(实施例4)所用熊竹素溶于DMSO，与LPS同时加入RPMI Medium1640培养基中，熊竹素的终浓度分别为0，10μM，20μM，30μM，40μM和50μM。

实施例1对小鼠肺功能和动脉血气的检测

1.动物饲养：C57BL/6J野生型雄性小鼠购自北京维通利华实验送物技术有限公司。按规定将小鼠置于武汉大学人民医院实验动物中心的小鼠饲养系统(SPF级)的隔离室进行检疫，在购入当天和次日称重、记录并用油性记号笔做标记，经过1周观察后移入饲养室，在1周的适应期后展开实验。每6只小鼠一笼，定期更换经严格灭菌操作的标准鼠饲料和常温饮用水。

2.动物实验分为4组：正常对照组(Sham组)、模型组(LPS组)、熊竹素低剂量治疗组(LPS+KUM 20mg/kg)和熊竹素高剂量治疗组(LPS+KUM 60mg/kg)。

熊竹素低剂量治疗组和熊竹素高剂量治疗组小鼠灌胃熊竹素悬液(20mg/kg或60mg/kg)；正常对照组和模型组灌胃生理盐水，每天1次，持续1周。

3.大肠杆菌中提取血清型为O55：B5的LPS稀释在生理盐水中，以10mg/kg的剂量取0.5mL注射于模型组、熊竹素低剂量治疗组和熊竹素高剂量治疗组小鼠左下腹腔内。

12小时后进行小鼠肺功能检测和动脉血气分析。使用2％的戊巴比妥钠(50mg/kg)溶液以腹腔注射的方式麻醉小鼠。待小鼠麻醉成功后，剃去小鼠胸前毛发，消毒并剪开皮肤，分离暴露气管。于两个气管软骨环之间将气管剪开，插入气管插管后使用棉线固定，并连接肺功能仪辅助呼吸机与气管插管接头进行气道压力检测。沿腹正中线剪开皮肤约2cm。逐层打开腹腔，持皮肤拉钩将腹壁拉向左右两侧，充分暴露腹腔。0.9％NaCl溶液湿润的纱布推移肠管并打开腹膜，充分暴露腹主动脉，抽取0.2mL新鲜动脉血。使用血气分析仪测定小鼠血PaO₂，PaCO₂和HCO₃ ^-。

肺功能结果显示：LPS组小鼠肺潮气量，肺通气量和肺顺应性明显降低；熊竹素低剂量治疗组和熊竹素高剂量治疗组小鼠肺潮气量，肺通气量和肺顺应性明显降低较LPS组明显升高(如图1中A-F)；动脉血气分析结果显示，LPS组小鼠动脉血PaO₂降低，PaCO₂和HCO₃ ^-升高；熊竹素低剂量治疗组和熊竹素高剂量治疗组小鼠动脉血中PaO₂较LPS组升高，PaCO₂和HCO₃ ^-降低(如图1中G-I)。且在以上结果中，均提示熊竹素高剂量组较低剂量组的肺保护作用更为明显(*P＜0.05vs.Sham组，#P＜0.05vs.LPS组)。

实施例2对小鼠肺组织损伤和生存曲线

留取实施例1中小鼠肺组织于甲醛组织固定液中，进行石蜡包埋，切片，H&E染色。

结果如图2中A-B所示，与Sham相比，LPS组可导致肺泡内大量炎性物质渗出，肺泡壁完整性破坏，损伤评分明显升高，而熊竹素低剂量治疗组和熊竹素高剂量治疗组可显著改善上述肺损伤；如图2中C，与对照组相比，LPS组较Sham组小鼠肺湿/干重比例显著增加，而熊竹素给药可显著降低肺湿/干重比；采用Elisa试剂盒评价肺组织MPO活性；如图2中D所示，与Sham组相比，LPS组MPO活性显著升高，而熊竹素给药组可显著下调小鼠肺组织MPO活性；此外，LPS组小鼠肺泡灌洗液中总细胞和总蛋白水平较Sham组明显升高，熊竹素给药可显著降低LPS小鼠肺泡灌洗液中总细胞和总蛋白水平(如图2中E-F)；7天生存分析显示，在熊竹素连续7天灌胃后，通过腹腔注射的方式给予小鼠致死剂量的LPS，LPS组小鼠在第4天时死亡率为100％，而熊竹素给药可显著提高小鼠生存率(如图2中G所示)。且在以上结果中，均提示熊竹素高剂量组较低剂量组的肺保护作用更为明显(*P＜0.05vs.Sham组，#P＜0.05vs.LPS组)。

在脓毒症肺损伤中，肺功能破坏、肺组织内促炎因子表达显著增加、大量炎细胞浸，引起组织内环境的破坏，细胞形态及结构受损，肺水肿加剧。本实施例表明熊竹素显著减轻了LPS诱导的小鼠肺病理性损伤，改善了肺病理损伤，减轻了肺水肿和肺渗出，同时显著提高了小鼠7天生存率，由此提供了熊竹素在制备肺损伤保护性药物中的用途。

实施例3对小鼠肺组织炎症、氧化应激和凋亡相关检测

采用RT-PCR技术分别检测各组小鼠肺组织中促炎症相关基因IL-1β和MCP-1mRNA表达水平。

结果如图3中A-B所示，与Sham组相比，LPS组小鼠肺组织IL-1β和MCP-1显著上调，而熊竹素给药组可抑制脓毒症小鼠肺组织中IL-1β和MCP-1的mRNA表达；此外，RT-PCR检测结果也表明LPS组小鼠肺组织Txn-1和Prdx1的mRNA水平明显下调，表明LPS组小鼠肺组织中氧化应激明显增加；相反，熊竹素给药可显著上调Txn-1和Prdx1的mRNA水平(图3中C-D)，提示熊竹素具有抗氧化应激的潜力；Western blot结果如图3中E-F所示，与Sham组相比，LPS组小鼠肺组织中Bax与Bcl-2的比值明显升高，但熊竹素给药明显抑制了脓毒症小鼠肺组织Bax和Bcl-2的比值，提示熊竹素具有抗凋亡的潜力(*P＜0.05vs.Sham组，^#P＜0.05vs.LPS组)。

在急性肺损伤中，常伴随着肺上皮细胞中过度激活的氧化应激反应，引起肺组织氧化/抗氧化平衡失调，大量活性氧的产生使肺上皮细胞凋亡，同时可诱发肺组织炎症，二者相互促进，进一步加重肺损伤。本实施例通过检测肺组织中炎症，氧化应激和凋亡的标志基因或蛋白，表明熊竹素可增强组织抗炎症、抗氧化能力及抗凋亡作用。

实施例4对LPS刺激的MLE-12肺上皮细胞的影响

1.细胞培养：MLE-12肺上皮细胞用含10％胎牛血清的RPMI Medium 1640培养基，在37℃恒温5％CO₂无菌培养箱中培养，于六孔板中设置细胞分组。首先使用0～50μM浓度梯度熊竹素刺激MLE-12肺上皮细胞，观察熊竹素对肺上皮细胞的活力影响。随后在LPS(100μg/mL)刺激的同时，加入0～50μM熊竹素，6小时后观察不同浓度熊竹素对LPS刺激下肺上皮细胞的保护作用。正常对照组(PBS组)、模型组(LPS组)、熊竹素治疗组(LPS+KUM 40μM)。

2.将MLE-12肺上皮细胞分为正常对照组(PBS组)、模型组(LPS组)、熊竹素治疗组(LPS+KUM 40μM)，对模型组和熊竹素治疗组MLE-12肺上皮细胞给予LPS(100μg/mL)刺激6小时，检测ROS和凋亡相关蛋白BAX及Bcl-2的蛋白表达水平。

结果表明：在LPS刺激前，浓度为0～50μM的熊竹素对MLE-12肺上皮细胞的细胞活力无明显影响(图4中A)；在LPS(100μg/mL)刺激下，浓度为20～50μM的熊竹素对MLE-12肺上皮细胞活力的改善作用具有浓度依赖性(图4中B)；ROS探针染色定量结果显示，40μM的熊竹素可明显减轻LPS诱导的肺上皮细胞ROS增加(图4中C)。Western blot表明，40μM的熊竹素可明显降低LPS诱导的肺上皮细胞中Bax与Bcl-2蛋白的比值(图4中D-E)(*P＜0.05vs.Sham组，#P＜0.05vs.LPS组)。

正常生理状态下，肺上皮细胞维持着氧化-抗氧化稳态，同时细胞维持着生理状态的细胞凋亡；发生急性肺损伤时，LPS可诱发肺上皮细胞氧化应激剧增，抑制了抗氧化酶活性，造成氧化产物增加，最终破化肺上皮细胞的氧化-抗氧化平衡，进一步使细胞功能受损甚至出现凋亡。本实施例氧化应激和细胞凋亡水平检测结果表明熊竹素可减轻LPS刺激的MLE-12肺上皮细胞氧化应激和细胞凋亡。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.熊竹素作为唯一活性成分在制备治疗脓毒症肺损伤的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述脓毒症肺损伤为肺水肿、肺组织炎症及肺泡壁的完整性损害。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型选自片剂、粉剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液或注射液。