CN113908169B - 一种药物组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物及其用途，药物组合物由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与烟酰胺单核苷酸NMN/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+或其药学上可接受的盐组成。EGCG和NMN/NAD+或其药学上可接受的盐联合使用具有显著的协同增效作用，两者联合用药比EGCG或NMN/NAD+或其药学上可接受的盐单独给药具有更好的疗效，可以显著抑制巨噬细胞炎症反应，改善肺部炎症及肺组织损伤。本发明也涉及该药物组合物或包含所述药物组合物的药物制剂在制备预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症性疾病中的应用，特别是在制备预防和/或治疗外周炎症所致的脓毒血症、炎性肺损伤、支气管哮喘等疾病中的应用，具有广阔的应用前景。

Description

一种药物组合物及其用途
技术领域
本发明属于医药技术，特别是涉及表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和烟酰胺单核苷酸NMN的药物组合物在治疗巨噬细胞相关炎症性疾病包括脓毒症及其诱导的炎性肺损伤中的应用。
背景技术
烟酰胺单核苷酸(β-Nicotinamide Mononucleotide,NMN；CAS登记号:1094-61-7)是一种人体内固有的物质，属维生物B族衍生物，常见于日常食物中，如花椰菜、西红柿、生牛肉中。NMN在人体内作为NAD+前体，其生物活性主要通过NAD+实现，NAD+是烟酰胺腺嘌呤双核苷酸，即辅酶I，是一种传递质子的辅酶，参与人体内上千种生物催化反应，如糖酵解、糖异生、呼吸链及三羧酸循环等，涵盖供能、DNA修复(PARPs介导)、NADP(H)合成多方面作用，具有抗氧化、抗衰老的功效。也有文献报道，NMN在治疗糖尿病、心脏保护、抗阿尔兹海默病领域也发挥作用。
表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate,EGCG；CAS登记号:989-51-5)是从绿茶茶叶中分离的一种茶多酚类成分。据文献报道，EGCG具有抗氧化、抗衰老、抗癌、抗病毒、抑菌降脂的功效，在高血压、肥胖/胰岛素抵抗、多发性硬化症等多领域开展了Ⅱ/Ⅲ期临床研究。
脓毒症(Sepsis)是由细菌等病原微生物侵入机体引起的危急重症，临床表现为全身炎症反应综合征，并伴有脓毒血症和器官血流灌注不足等并发症。脓毒症会导致感染性休克、急性肺损伤(ALI)/急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、多器官衰竭、乃至死亡。流行病学调查发现，每年有1800万患者遭受脓毒症的困扰，患病人数还以每年1.5％～8％的速度持续增加。目前认为，致病微生物感染机体造成的炎症反应失控及免疫紊乱是脓毒症发病的主要原因。脓毒症感染时，内毒素等刺激免疫细胞产生大量炎性介质，促使炎性反应细胞尤其是巨噬细胞在组织中募集活化，进一步产生细胞因子、趋化因子、氧自由基等，形成瀑布样级联反应，导致器官受损甚至衰竭，最终造成病人死亡。
急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)是临床常见的严重疾病，ALI常常发展为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，后者显著特征是肺水肿、肺顺应性降低、急性低氧呼吸衰竭，最终导致死亡。据统计，北美每年约有15万名ARDS患者，尽管由于机械通气等辅助医疗设备，病死率已有明显下降，但仍有40％-70％病患死于ARDS，若伴有脓毒症等并发症则高达90％，而脓毒症是ALI/ARDS的最常见的引发因素。ALI的病理生理机制常被认为与肺部炎症失调有关，其病理特点是预炎因子产生增加，炎细胞浸润增多，肺泡上皮细胞凋亡。因此，调控炎症应答，改善病理状态是脓毒症诱导的急性肺损伤治疗的重要方向，也是药物研发的热点。
Figure GDA0003402943400000021
发明内容
本发明的目的是提供一种药物组合物，由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG联用烟酰胺单核苷酸NMN/NAD+或其药学上可接受的盐，在治疗巨噬细胞炎症相关疾病的药物中的应用，特别是制备治疗细菌内毒素所致脓毒症及其诱导的急性肺损伤药物增效中的应用。
本发明的技术方案是：
一种药物组合物，所述药物组合物由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与烟酰胺单核苷酸NMN/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD+或其药学上可接受的盐组成；所述EGCG与NMN/NAD+或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:10至1:100。
在一些实施例中，所述EGCG与NMN/NAD+或其药学上可接受的盐的摩尔比为1:35。
其中，所述EGCG和NMN的化学结构式如下：
Figure GDA0003402943400000022
第二方面，提供一种药物制剂，其中含有治疗有效量的上述的药物组合物及药学上可接受的载体、佐剂或媒剂。
在一些实施例中，所述药物制剂的剂型为经肺或经鼻的吸入雾化剂、定量气雾剂或干粉吸入剂。
第三方面，提供所述的药物组合物、所述的药物制剂在制备预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症性疾病的药物中的应用。
在一些实施例中，所述巨噬细胞相关的炎症性疾病包括外周炎症所致的脓毒血症、炎性肺损伤、支气管哮喘、呼吸系统相关疾病。
所述化合物表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和NMN/NAD+或其药学上可接受的盐联用具有协同增效的作用，能够显著性地加强EGCG抑制巨噬细胞炎症因子TNF-α的表达释放，增强EGCG下调巨噬细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS等基因表达水平的作用。
所述化合物表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG和NMN/NAD+或其药学上可接受的盐联用能够缓解脂多糖所致脓毒症诱导的急性肺损伤，而且联用相较于EGCG或NMN单独使用能更好地改善病理状况，降低外周和肺组织TNF-α的表达释放和相关炎症因子的基因表达水平。
本发明中，在给予哺乳动物上述化合物及其药学上可接受的盐，以及这些化合物的溶剂化物(这里统称为“治疗药物”)时，可以单独使用，或者最好是按照规范的制药方法将其与适于药用的载体或稀释剂配合后使用。给药方式可以经各种途径，包括口服、非胃肠道给药或局部给药。这里所指的非胃肠道给药包括但并不限于静脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射和透皮给药。
本发明的优点在于：
1.本发明发现了天然产物表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG联合烟酰胺单核苷酸NMN/NAD+或其药学上可接受的盐给药缓解脓毒症及其诱导的急性肺损伤的制药应用；
2.本发明首次发现了表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG联合烟酰胺单核苷酸NMN/NAD+或其药学上可接受的盐使用能增强EGCG或NMN/NAD+或其药学上可接受的盐单独使用抑制巨噬细胞炎症的作用并且在有效剂量下均无明显毒性；
3.本发明首次发现了表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG联合NMN/NAD+或其药学上可接受的盐给药具有缓解小鼠脓毒症及其造成的肺损伤的作用，并相较于EGCG或NNM单独使用具有更好的治疗效果，预示着EGCG和NMN联用具有较好地治疗脓毒症等巨噬细胞炎症相关疾病的临床应用前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能更清楚地了解本发明的技术手段，并可依照说明书内容予以实施，以下以本发明的实例并配合详细附图进行说明。
附图说明
图1是EGCG、NMN以及两者联合用药对脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症因子TNF-α表达释放的影响。
图2是EGCG、NMN以及两者联合用药对脂多糖刺激的RAW264.7巨噬细胞中炎症基因mRNA表达水平的影响。
图3是EGCG、NMN及两者联合用药对脓毒症小鼠体重、肺脏器系数的影响。
图4是EGCG、NMN及两者联合用药对脓毒症小鼠肺组织病理的影响。
图5是EGCG、NMN及两者联合用药对脓毒症小鼠血清、肺组织中炎症因子TNF-α表达的影响；
图6是EGCG、NMN及两者联合用药对脓毒症小鼠肺组织中炎症基因mRNA表达水平的影响。
具体实施方式
为了进一步阐明本发明，下面给出一系列实施例，这些实施例完全是例证性的，它们仅用来对本发明具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
下面结合具体实施例对本申请做出详细说明。NMN/NAD+或其药学上可接受的盐在实施例中选取NMN为例。
药物：本实验所用EGCG和NMN均易溶于生理盐水，普及性和可操作性强，给药途径可以多样，包括并不限于静脉、腹腔、口服、经鼻吸入、雾化等方式给药。试剂：脂多糖(LPS)购置于碧云天生物技术有限公司，其他试剂为市售的分析纯试剂。细胞：RAW264.7巨噬细胞系购置于中国典型培养物保藏中心。试剂盒：TNF-α的ELISA试剂盒购置于深圳达科为生物技术有限公司，RNA提取试剂盒购置于诺唯赞生物科技有限公司，引物购自金唯智生物科技有限公司。
实施例1
一种药物组合物，由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与烟酰胺单核苷酸NMN组成；所述EGCG与NMN的摩尔比为1:10。
实施例2
一种药物组合物，由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与烟酰胺单核苷酸NMN组成；所述EGCG与NMN的摩尔比为1:35。
实施例3
一种药物组合物，由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与烟酰胺单核苷酸NMN组成；所述EGCG与NMN的摩尔比为1:100。
实施例4
一种药物制剂，由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与烟酰胺单核苷酸NMN和载体组成；所述EGCG与NMN的摩尔比为1:35。
实施例5
巨噬细胞中炎症因子表达测定：取EGCG(5、10μM)、NMN(500μM)以及两者联用预处理RAW264.7巨噬细胞，3h后加入脂多糖LPS(100ng/mL)作用2h后，依据商品化试剂盒操作说明ELISA技术检测细胞上清中炎症因子TNF-α的表达释放。试验结果如表1和图1所示，其中***P<0.001,vs Control；###P<0.001,vs LPS；$P<0.05,$$P<0.01,$$$P<0.001(GraphPadPrism 8.0,Bonferroni’s test)，由此可见脂多糖明显造成巨噬细胞RAW264.7中炎症因子TNF-α的表达上调，EGCG和NMN联合使用可以增加EGCG的抗炎活性，更好地抑制巨噬细胞中炎症因子TNF-α的表达释放，有效剂量为(10μM EGCG+500μM NMN)。
表1
组别 TNF-α占Model组百分比(％) CCK-8占Model组百分比(％)
Control 18.22±2.75 97.59±2.37
Model <![CDATA[100±0.6<sup>***</sup>]]> 100±0.05
EGCG(5μM) <![CDATA[73.14±1.86<sup>#</sup>]]> 99.05±1.01
EGCG(10μM) <![CDATA[71.02±4.37<sup>##</sup>]]> 94.78±0.86
NMN(500μM) 94.79±3.32 102.91±0.53
EGCG(5μM)+NMN(500μM) <![CDATA[66.34±2.4<sup>##,$$</sup>]]> 98.55±1.31
EGCG(10μM)+NMN(500μM) <![CDATA[52.54±2.51<sup>###,$$$</sup>]]> 96.34±1.96
实施例6
巨噬细胞中炎症相关基因表达水平测定：取EGCG(5、10μM)、NMN(500μM)以及两者联用预处理RAW264.7细胞，3h后加入脂多糖LPS(100ng/mL)作用2h后，依据RNA提取试剂盒操作说明，利用RT-PCR技术检测细胞中炎症相关基因的表达。试验结果如表2和图2所示，其中***P<0.001,vs Control；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,vs LPS；$P<0.05,$$P<0.01,$$$P<0.001(GraphPad Prism 8.0,Bonferroni’s test)，可见脂多糖明显造成巨噬细胞RAW264.7中炎症相关基因TNF-α、IL-1β、IL-6、Cox-2、iNOS的基因表达上调，而EGCG和NMN联合用药组相较于单给药组更能有效地抑制炎症基因的表达，即EGCG和NMN联合使用能增加EGCG的抗炎活性，有效剂量为(5μM EGCG+500μM NMN或10μM EGCG+500μM NMN)。
表2
组别 TNF-α变化倍数 IL-1β变化倍数 IL-6变化倍数 COX-2变化倍数 iNOS变化倍数
Control 1±0.1 1±0.14 1±0.2 1±0.28 1±0.13
Model <![CDATA[11.44±0.32<sup>***</sup>]]> <![CDATA[19.72±1.32<sup>***</sup>]]> <![CDATA[27.22±3.22<sup>**</sup>]]> <![CDATA[9.85±0.69<sup>***</sup>]]> <![CDATA[1.9±0.15<sup>***</sup>]]>
EGCG(5μM) 8.8±0.68 <![CDATA[13.25±1.4<sup>##</sup>]]> 22.28±2.13 8.94±2 <![CDATA[1.34±0.08<sup>#</sup>]]>
EGCG(10μM) <![CDATA[7.89±0.98<sup>#</sup>]]> <![CDATA[9.05±0.21<sup>###</sup>]]> <![CDATA[13.7±2.15<sup>##</sup>]]> 5.69±0.6 <![CDATA[1.36±0.05<sup>#</sup>]]>
NMN(500μM) 10.87±0.23 18.53±1.25 26.55±2.46 9.93±0.68 1.58±0.07
EGCG(5μM)+NMN(500μM) <![CDATA[6.22±0.87<sup>##,$$</sup>]]> <![CDATA[16.37±1.22<sup>$$</sup>]]> <![CDATA[11.74±1.14<sup>##,$$</sup>]]> 11.68±1.13 <![CDATA[1.17±0.1<sup>##,$</sup>]]>
EGCG(10μM)+NMN(500μM) <![CDATA[3.28±0.32<sup>###,$$$</sup>]]> <![CDATA[5.59±0.24<sup>###,$$$</sup>]]> <![CDATA[6.27±1.07<sup>###,$$$</sup>]]> <![CDATA[4.12±0.84<sup>#,$$</sup>]]> <![CDATA[1.05±0.06<sup>###,$$</sup>]]>
实施例7
动物给药分组：实验动物为ICR♂小鼠，随机地将实验小鼠按体重分为对照组、模型组、给药组；对照组、模型组腹腔注射生理盐水，给药组(5mg/kg Dexamethasone、20mg/kgEGCG、500mg/kg NMN、20mg/kg EGCG+500mg/kg NMN，均溶于生理盐水)腹腔注射，各组均连续给药3天，末次给药2h后除对照组腹腔注射等体积生理盐水，其余各组腹腔注射LPS(10mg/kg)。
结果统计：
体重、肺脏器系数：第一天称重随机分组，连续3天给药前称重，统计小鼠生长状况。在第3天给药后2h腹腔注射LPS，6h后解剖小鼠取肺脏器并称重，如表3和图3，其中***P<0.001,vs Control；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001，vs LPS；$$P<0.01,$$$P<0.001(GraphPadPrism 8.0,t tests)。
表3
组别 体重(Day1) 体重(Day2) 体重(Day3) 肺脏系数(％) 肺泡细胞占比面积(％)
G1:Control 25.53±0.72 25.9±0.89 26.73±0.73 0.576±0.017 26.54±1.58
G2:Model 25.21±0.68 26.11±0.81 26.59±0.58 <![CDATA[0.658±0.028<sup>***</sup>]]> <![CDATA[43.02±1.39<sup>***</sup>]]>
G3:Dexamethasone 5mg/kg 25.22±0.72 25.84±0.81 26.19±0.63 <![CDATA[0.602±0.037<sup>##</sup>]]> <![CDATA[33.72±1.3<sup>###</sup><!-- 5 -->]]>
G4:EGCG 20mg/kg 25.26±0.7 25.6±0.81 26.21±0.63 <![CDATA[0.618±0.039<sup>#</sup>]]> <![CDATA[35.72±2.21<sup>##</sup>]]>
G5:NMN 500mg/kg 25.27±0.73 25.52±0.83 26.11±0.61 0.636±0.037 42.02±1.5
G6:EGCG 20mg/kg+NMN500mg/kg 25.32±0.73 25.67±0.78 25.94±0.65 <![CDATA[0.585±0.038<sup>###,$$$</sup>]]> <![CDATA[28.06±0.96<sup>###,$$$</sup>]]>
肺病理、血清和肺组织炎症因子测定：在第3天腹腔注射LPS的6h后，眼眶收集全血，离心制备血清，-80℃冻存。一部分小鼠用PBS灌流和多聚甲醛固定肺脏右叶，另一部分小鼠解剖后取肺脏，液氮冷冻储存。固定的肺脏经脱水、石蜡包埋切片后进行苏木素-伊红(Hematoxylin-Eosin,H&E)染色，组织病理结果见图4，统计结果见表3，其中***P<0.001,vsControl；#P<0.05,###P<0.001,vs LPS；$P<0.05,$$$P<0.001(GraphPad Prism 8.0,Bonferroni’s test)。
液氮保存的肺脏组织冰上切取部分组织，匀浆离心取上清，定蛋白并调齐总蛋白浓度，将血清和肺组织匀浆上清用商品化TNF-αELISA试剂盒测试，血清、肺组织炎症因子TNF-α影响结果见表4和图5，其中***P<0.001,vs Control；#P<0.05,###P<0.001,vs LPS；$P<0.05,$$$P<0.001(GraphPad Prism 8.0,Bonferroni’s test)。
表4
组别 血清中TNF-α含量(％ofModel) 肺组织匀浆中TNF-α含量(％ofModel)
G1:Control 24.41±0.49 36.41±2.37
G2:Model <![CDATA[100±4.12<sup>***</sup>]]> <![CDATA[100±9.27<sup>***</sup>]]>
G3:Dexamethasone 5mg/kg <![CDATA[40.09±2.26<sup>###</sup>]]> <![CDATA[61.77±4.08<sup>###</sup>]]>
G4:EGCG 20mg/kg <![CDATA[53.57±2.7<sup>###</sup>]]> <![CDATA[75.83±4.14<sup>#</sup>]]>
G5:NMN 500mg/kg <![CDATA[61.93±3.11<sup>###</sup>]]> 80.01±4.02
G6:EGCG 20mg/kg+NMN500mg/kg <![CDATA[35.9±2.76<sup>###,$$$</sup>]]> <![CDATA[65.2±4.1<sup>###,$</sup>]]>
肺组织炎症相关基因表达水平测定：取少量冻存的肺组织，充分研磨，依据RNA提取试剂盒操作说明，利用RT-PCR技术检测肺组织中炎症相关基因的表达。实验结果如表5和图6所示，其中***P<0.001,vs Control；#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001,vs LPS；$P<0.05,$$P<0.01,$$$P<0.001(Graphpad 8.0,Bonferroni’s test)。
表5
组别 TNF-α变化倍数 IL-1β变化倍数 IL-6变化倍数 iNOS变化倍数
G1:Control 1±0.24 1±0.3 1±0.17 1±0.22
G2:Model <![CDATA[21.84±2.19<sup>***</sup>]]> <![CDATA[31.66±4.41<sup>***</sup>]]> <![CDATA[48.1±5.97<sup>***</sup>]]> <![CDATA[14.18±0.72<sup>***</sup>]]>
G3:Dexamethasone 5mg/kg <![CDATA[11.68±1.44<sup>###</sup>]]> <![CDATA[16.22±2.49<sup>###</sup>]]> <![CDATA[15.28±2.26<sup>###</sup>]]> <![CDATA[3.19±0.5<sup>###</sup>]]>
G4:EGCG 20mg/kg <![CDATA[16.11±1.6<sup>#</sup>]]> 24.5±1.98 41.44±3.48 <![CDATA[10.53±0.96<sup>#</sup>]]>
G5:NMN 500mg/kg 20.22±1.18 30.99±2.77 <![CDATA[35.1±2.9<sup>#</sup>]]> 13.66±1.3
G6:EGCG 20mg/kg+NMN 500mg/kg <![CDATA[12.28±0.98<sup>###,$</sup>]]> <![CDATA[16.15±1.8<sup>###,$$</sup>]]> <![CDATA[16.76±2.27<sup>###,$$$</sup>]]> <![CDATA[8.09±1.17<sup>###,$</sup>]]>
综上可见，各药物组给药后小鼠体重无明显变化，腹腔注射脂多糖6h后，小鼠肺脏脏器系数显著上调，血清和肺组织中的TNF-α明显增多，肺组织明显受损，肺组织中相关炎症基因表达水平显著上升；EGCG联合NMN给药组相较于EGCG或NMN单用组，能显著下调肺脏系数作用，明显降低血清和肺组织中的TNF-α的表达释放，降低肺组织中相关炎症基因的表达，并对肺部病理损伤有更加显著的改善作用。这些实验结果表明，EGCG联合NMN给药具有比EGCG或NMN单给药显示出更好地改善脓毒症及其急性肺损伤的预防或治疗效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物由表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG与烟酰胺单核苷酸NMN组成；所述EGCG与NMN的摩尔比为1:25至1:50。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述EGCG与NMN的摩尔比为1:35。
3.权利要求1-2任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症的药物中的应用。
4.权利要求1-2任一项所述的药物组合物在制备预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症所致的脓毒血症、炎性肺损伤的药物中的应用。
5.一种预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症的药物制剂，其中含有治疗有效量的权利要求1-2任一项所述的药物组合物及药学上可接受的载体、佐剂或媒剂。
6.根据权利要求5所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为经肺或经鼻的吸入雾化剂、定量气雾剂或干粉吸入剂。
7.权利要求5或6所述的药物制剂在制备预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症的药物中的应用。
8.权利要求5或6所述的药物制剂在制备预防和/或治疗巨噬细胞相关的炎症所致的脓毒血症、炎性肺损伤的药物中的应用。
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