CN117045629B - 地骨皮甲素在治疗肾结石药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种地骨皮甲素在治疗肾结石药物中的用途，精胺类化合物天然产物地骨皮甲素可以预防/治疗果蝇和小鼠肾结石，因此可以用于治疗肾结石药物以及预防肾结石形成药物等相关领域，为治疗或预防草酸钙肾结石病提供一种新的药物和治疗思路，为预防和/或治疗和/或缓解猫狗等哺乳动物结石提供一种新的治疗药物。

Description

地骨皮甲素在治疗肾结石药物中的用途

技术领域

本发明属于治疗肾结石药物技术领域，具体来说涉及一种地骨皮甲素在治疗肾结石药物中的用途。

背景技术

肾结石是一种严重影响人体健康的临床常见病和多发病，肾结石主要以含钙结石为主，其中又以草酸钙结石最多，约占结石总数的80％左右，草酸是一种人体终末代谢产物，人体尿液中草酸的升高被认为是草酸钙结石发生的独立危险因素。草酸的累积导致草酸钙结晶的沉积。肾结石在世界范围内发病率都很高，并且由于糖尿病、肥胖人群不断增加，肾结石的发病率还有逐年增高的趋势，美国的统计数据表明在过去的15年里患病率增加了70％。在美国，肾结石是目前泌尿外科最昂贵的疾病。1992年-2009年期间，全世界因肾结石至急诊就诊的患者增加了91％，肾结石患者的生活质量也低于普遍通人群。肾结石易复发，并且通常是一种终身性的疾病，复发性肾结石预测着将来较差的临床结局，有研究显示在第2年、第5年、第10年和第15年时肾结石的复发率分别为11％、20％、31％和39％。随着人们生活方式、饮食结构的不断改变，肾结石的患病率和复发率呈明显上升，且趋于低龄化，积极治疗预防结石，降低疾病的发病率，有助于减少医疗支出提高患者生活质量。目前在临床上对草酸钙肾结石的治疗多为使用不同的手术类型碎石或取石，辅助使用止痛药和排石溶石类药物，存在手术次数多，费用昂贵，副作用大，术中术后可能给患者带来脓毒血症、感染性休克甚至死亡的可能等缺点。而目前临床治疗肾结石的药物仅有柠檬酸钾一种，急需开发更多疗效好的治疗肾结石的药物。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种地骨皮甲素在治疗肾结石药物中的用途。

本发明的目的是通过下述技术方案予以实现的。

地骨皮甲素在治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中的用途。

在上述技术方案中，所述地骨皮甲素在治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中起的作用为降低Dao mRNA的表达水平。

地骨皮在治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中的用途。

在上述技术方案中，当治疗肾结石药物/缓解肾结石药物为中药组合物时，地骨皮作为治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中的君药。

在上述技术方案中，所述地骨皮在治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中起的作用为降低Dao mRNA的表达水平。

地骨皮甲素及其药学上可接受的盐或酯在治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中的应用。

在上述技术方案中，所述地骨皮甲素及其药学上可接受的盐或酯在治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中起的作用为降低Dao mRNA的表达水平。

上述治疗肾结石药物/缓解肾结石药物在地骨皮甲素/地骨皮中加入一种或多种药学上可接受的载体；载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

地骨皮甲素/地骨皮可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明通过实验证明，精胺类化合物天然产物地骨皮甲素可以预防/治疗果蝇和小鼠肾结石，因此可以用于治疗肾结石药物以及预防肾结石形成药物等相关领域，为治疗或预防草酸钙肾结石病提供一种新的药物和治疗思路，为预防和/或治疗和/或缓解猫狗等哺乳动物结石提供一种新的治疗药物。

附图说明

图1为实施例1中40％醇洗脱的地骨皮洗脱物的色谱图；

图2a为明场下拍摄(第一行)、偏振光下拍摄(第二行)和明场下拍摄(第三行)的马氏管；

图2b为果蝇马氏管内结石程度；

图2c为明场下拍摄(第一行)和偏振光下拍摄(第二行)的果蝇马氏管；

图2d为果蝇马氏管内结石程度；

图2e为明场下拍摄(第一行、第三行)和明偏振光下拍摄(第二行、第四行)的果蝇马氏管；

图2f为果蝇马氏管内结石程度；

图2g为明场下拍摄(第一行)和偏振光下拍摄(第二行)的果蝇马氏管；

图2h为果蝇马氏管内结石程度；

图2i为果蝇中Daao1的mRNA表达水平；

图3为实施例3中空白对照组(对照组)、单独给药组(30mg/kg地骨皮甲素)、肾结石模型组(乙醛酸)和肾结石治疗组的小鼠最终体重与初始体重的比值(A)、血清肌酐含量(B)、血清尿素氮含量(C)、肾组织肾损伤指示蛋白Kim-1的mRNA含量(D)和Ngal的mRNA含量(E)；

图4为实施例3中空白对照组、单独给药组、肾结石模型组和肾结石治疗组的肾组织石蜡切片的偏振光(A-F)和偏振光面积的统计图(G)；

图5为实施例3中空白对照组、单独给药组、肾结石模型组和肾结石治疗组的VonKossa染色(A-F)和染色的统计图(G)；

图6为实施例3中空白对照组、单独给药组、肾结石模型组和肾结石治疗组的PAS染色(A-F)和肾损伤分数的统计图(G)；

图7为实施例3中空白对照组、单独给药组、肾结石模型组和肾结石治疗组肝脏中草酸代谢相关酶类中Dao、Agxt、Ldh、Grhpr的mRNA含量；

图8a为实施例4中空白培养基、草酸钠培养基、中药组方(包含地骨皮)的培养基和中药组方(不包含地骨皮)的培养基在明场下拍摄的果蝇马氏管(第一行)和在偏振光下拍摄的果蝇马氏管(第二行)；

图8b为实施例4中空白培养基、草酸钠培养基、中药组方(包含地骨皮)的培养基和中药组方(不包含地骨皮)的培养基的马氏管内结石程度(水平)。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

草酸钙肾结石是草酸累积导致的肾结石病；肾结石病动物模型采用草酸钠/乙醛酸制备，在实施例2的草酸钙肾结石疾病组中，喂食草酸钠导致外源草酸摄入过量，体内草酸过度累积，从而形成草酸钙结石。在实施例3的肾结石模型组中，外源性的乙醛酸在肝脏中代谢产生草酸，增加肾脏草酸含量形成草酸钙结晶。

下述实施例中，使用的地骨皮购自安国市弘发中药材饮片有限公司。

HPLC级的乙腈(ACN)和乙醇购自德国默克公司。

甲酸购自北京百灵威科技有限公司。

使用Milli-Q纯化系统对水进行纯化。

C18HD柱购自华谱科仪(北京)科技有限公司。

光电二极管阵列检测器(PDA)购自美国沃特世公司，HPLC-ESI/Q-TOF MS系统为安捷伦科技有限公司的1290系列LC单元和6540系列飞行时间质谱仪组成；

下述实施例中草酸钠为福晨(天津)化学试剂有限公司生产；所使用的阳性药柠檬酸钾为天津市江天化工技术股份有限公司生产；所使用的地骨皮甲素、地骨皮乙素、枸杞

素a、枸杞素b为成都普瑞法科技开发有限公司生产。

地骨皮甲素结构为：

下述实施例中所使用的小鼠是7周龄的SPF级C57BL/6J雄性小鼠，购自北京希诺因生物科技有限公司，生产许可证号SCXK(京)2022-0006；

乙醛酸购自Sigma-Aldrich公司，产品编号G10601，生产批号WXBD1645V；

柠檬酸购自北京索莱宝科技有限公司，产品编号C8610，生产批号425I041。

实施例1

(1)地骨皮水提物的制备

将地骨皮粉碎，称取150g，装入5L单口圆底烧瓶中，加入纯水1.5L。

第1次水提：用加热套使单口圆底烧瓶加热升温至130℃，之后降温至100℃煎煮1小时，趁热用200目滤布进行过滤，收集第一次提取液。

第2次水提：再向单口圆底烧瓶中加入纯水1.5L，用加热套使单口圆底烧瓶加热升温至130℃，之后降温至100℃煎煮1小时，趁热用200目滤布进行过滤，收集第二次提取液，将第一次提取液和第二次提取液合并，得到地骨皮水提物。

(2)使用SPE制备地骨皮水提物级分

首先用75mL纯水对SPE柱进行调节，然后将90mL地骨皮水提物装载在SPE柱上，分别使用50mL的纯水、20％乙醇水溶液或40％乙醇水溶液进行洗脱，收集各组组分，依次得到纯水、20％醇洗脱或40％醇洗脱的地骨皮洗脱物。其中，40％醇洗脱的地骨皮洗脱物旋转蒸发并冷冻干燥，用于进一步的活性测试。

(3)实验结果

对40％醇洗脱的地骨皮洗脱物组分进行化合物的定性，如图1所示，色谱图中响应较好的化合物经与文献一级级质谱数据(陈晓鹤,苏磊,蒋丽娟等.基于UPLC-LTQ-Orbitrap高分辨质谱的地骨皮化学成分分析[J].中国中药杂志,2019,44(20):4486-4494.DOI:10.19540/j.cnki.cjcmm.20190506.202.)对比，定性为地骨皮甲素、地骨皮乙素、枸杞素a和枸杞素b。

实施例2精胺类化合物天然产物地骨皮甲素抑制果蝇草酸钙肾结石的形成实验

实施例2-1

(1)果蝇的准备

所使用的果蝇是羽化后1-2日龄的Canton.S野生雌性果蝇。果蝇均来自山西大学Professor Jianzhen Zhang lab，按照标准方案进行饲养：果蝇在25℃培养箱中，相对湿度维持在55.3％，进行12小时光照/12小时黑暗交替循环，在标准培养基中果蝇进行自然交配和繁殖(标准培养基：1L纯水中加入50g玉米粉、10g琼脂、30g红糖、7.8g蔗糖和29.3g干酵母后煮沸，冷却后加入其0.3％(v/v)的丙酸和1.5％(v/v)的抗生素，抗生素和丙酸防止微生物增生和细菌的污染)，3天更换一次标准培养基，等待果蝇幼虫羽化成为成虫，选取羽化后1-2天的雌性果蝇进行实验。

(2)设置以下实验组：

a、空白对照组：取30只羽化1-2天后的雌性果蝇随机转移到空白培养基中，果蝇在空白培养基中喂养7天，每3天换一次空白培养基，测试时每个空白培养基随机选取20只果蝇，其中，空白培养基，包括：1.31％(w/v)蔗糖、6.67％(w/v)玉米糖浆、2.17％(w/v)干酵母、0.9％(w/v)琼脂、1％(v/v)抗生素、0.6％(v/v)丙酸和剩余的纯水。

b、草酸钙肾结石疾病组：草酸钙肾结石疾病组与空白对照组基本一致，唯一不同之处在于：将空白培养基替换成培养基，草酸钙肾结石疾病组所采用培养基包括：1.31％(w/v)蔗糖、6.67％(w/v)玉米糖浆、2.17％(w/v)干酵母、0.9％(w/v)琼脂、1％(v/v)抗生素、0.6％(v/v)丙酸、0.1％(w/v)草酸钠和剩余的纯水(使得培养基中草酸钠的最终含量为0.1％(w/v)，如100ml培养基中加入0.1g草酸钠。)。

c、药物治疗组：药物治疗组与空白对照组基本一致，唯一不同之处在于：将空白培养基替换成培养基，药物治疗组所采用培养基为蔗糖、玉米糖浆、干酵母、琼脂、抗生素、纯水、丙酸、草酸钠和“多胺化合物天然产物地骨皮素及其类似物的混合物”，培养基中包括：蔗糖为1.31％(w/v)，培养基中玉米糖浆为6.67％(w/v)，培养基中干酵母为2.17％(w/v)，培养基中琼脂为0.9％(w/v)，培养基中抗生素为1％(v/v)，培养基中丙酸为0.6％(v/v)，培养基中草酸钠为0.1％(w/v)，培养基中“多胺化合物天然产物地骨皮素及其类似物”的浓度如表1所示，剩余为纯水。具体配置方法为：取草酸钠粉末溶于水，取“多胺化合物天然产物地骨皮素及其类似物”溶于水，将其都加入空白培养基中。“多胺化合物天然产物地骨皮素及其类似物”为实施例1中获得的地骨皮水提物、实施例1中获得的柱分离得到的地骨皮洗脱物、地骨皮甲素、地骨皮乙素、枸杞素a或枸杞素b。

表1

d、阳性对照组：阳性对照组与空白对照组基本一致，唯一不同之处在于：将空白培养基替换成培养基，阳性对照组所采用培养基为向空白培养基中加入草酸钠和柠檬酸钾，加入草酸钠搅拌均匀后，取柠檬酸钾溶于水中后加入空白培养基中，阳性对照组所采用培养基包括：1.31％(w/v)蔗糖、6.67％(w/v)玉米糖浆、2.17％(w/v)干酵母、0.9％(w/v)琼脂、1％(v/v)抗生素、0.6％(v/v)丙酸、0.1％(w/v)草酸钠、2％(w/v)的柠檬酸钾和剩余的纯水。

(3)实验方法

为了全面、系统的测试地骨皮甲素及其他精胺类组分对果蝇草酸钙肾结石的治疗效果，采用了半定量的方法。将上述实验组处理7天的果蝇在二氧化碳操作台上麻醉，放入加入PBS(pH＝7.2)的解剖皿中，采用体视显微镜解剖果蝇的马氏管(相当于人类的肾)，在载玻片上用移液枪滴20微升的PBS，将马氏管放到载玻片上，盖上盖玻片。在偏振光显微镜下，对果蝇马氏管内草酸钙结晶的数量，大小进行分析。

将结石严重程度按照结石的数量和大小分成4个等级：无结石，指的是果蝇马氏管主段无结石累积；轻微结石，指的是果蝇马氏管主段出现小颗粒样的，不成型的碎结石；中等结石，指的是果蝇马氏管主段出现个别成块状的大结石，且单根马氏管块状结石数量小于等于8；严重结石，指的是果蝇马氏管主段出现大量块状大结石，单根马氏管块状结石数量大于8。解剖各实验组的果蝇并评估果蝇的草酸钙结石的严重程度进行统计，量化分析，每个实验组20只果蝇。

(4)实验结果

实验结果如图2a～2f所示，其中，“control”为空白对照组处理的果蝇实验结果，“NaOx”为草酸钙肾结石疾病组处理的果蝇实验结果，“NaOx+2％柠檬酸钾”为阳性对照组处理的果蝇实验结果；

结果显示，如图2a和图2b所示，在偏振光显微镜下看到，草酸钙肾结石疾病组果蝇马氏管内有大量块状的草酸钙结晶，表明成功建立了果蝇草酸钙肾结石模型。阳性对照组柠檬酸钾和草酸钠共处理后，果蝇马氏管内基本无严重块状结石，只存在颗粒状的小结石，表明阳性药柠檬酸钾成功缓解了果蝇草酸钙结石。图2b统计了各组果蝇马氏管内结石程度(每组20只)，柱状图显示了不同组之间的结石程度的差异。“NaOx+0.2g/ml地骨皮”处理后果蝇马氏管内基本无结石沉积，显示了地骨皮对草酸钙结石的治疗效果显著。

如图2c和图2d所示，经C18HD柱分离，相较于“NaOx+0.2mg/ml20％醇洗脱”和“NaOx+0.2mg/ml纯水洗脱”，“NaOx+0.2mg/ml40％醇洗脱”处理后，果蝇马氏管内结石程度明显减轻，经HPLC-ESI/Q-TOF MS系统鉴定，此组分为地骨皮精胺类组分，主要包括四种精胺类生物碱：地骨皮甲素、地骨皮乙素、枸杞素a和枸杞素b。

购买这四种化合物测试其对果蝇肾结石的治疗效果，如图2e和图2f所示,地骨皮甲素和地骨皮乙素相较于枸杞素a和枸杞素b，显示出较为显著的治疗效果，其中，地骨皮甲素的效果优于地骨皮乙素，在地骨皮甲素处理后，果蝇马氏管内基本无严重结石。图2f统计了各组果蝇马氏管内结石程度(每组20只)，柱状图显示了不同组之间的结石程度的差异。

空白对照组、草酸钙肾结石疾病组、药物治疗组中“NaOx+0.2g/ml地骨皮”和药物治疗组中“NaOx+5mg/ml地骨皮甲素”果蝇体内Daao1的mRNA表达水平如图2i所示。

实施例2-2

草酸在体内的过度累积是增加结石风险的重要原因。草酸的前体是乙醛酸，乙醛酸非常容易在乳酸脱氢酶的作用下氧化为草酸，人体内累积的大量草酸离子会与钙离子结合形成草酸钙结石。DAO编码D-氨基酸氧化酶，DAO表达水平的升高会促进甘氨酸转化为乙醛酸，进一步转化为草酸。因此减少DAO的表达对减少草酸累积，抑制结石形成有着重要的意义。在果蝇中，daao1编码D-氨基酸氧化酶，调控果蝇体内草酸代谢，利用Gal4/UAS系统在果蝇马氏管星状细胞(c724-gal4)中敲低daao1的表达，观察减少daao1表达对结石形成的影响。

分别在25℃饲养UAS-daao1 RNAi品系的果蝇和c724-gal4品系的果蝇。收集UAS-daao1RNAi品系未受精的处女蝇，与c724-gal4品系的雄性果蝇进行杂交，酵母转录因子基因GAL4受特定启动子控制，在果蝇中特定的组织中进行表达，可以激活另一个包含上游活化序列(UAS)的外源插入基因，进而启动反应元件UAS，最终实现对目的基因的调控。杂交后的果蝇在28℃饲养，每三天换一次果蝇罐，8-12天后，子一代F1出生，此时子1代F1同时携带c724-gal4和uas-daao1 rnai，成功在星状细胞c724中敲低daao1。

将子一代F1按照实施例2-1中空白对照组和草酸钙肾结石疾病组进行实验，子一代F1按照空白对照组获得的结果如图2g和图2h中“C724＞Daao1-i”所示，子一代F1按照草酸钙肾结石疾病组获得的结果如图2g和图2h中“NaOx+C724＞Daao1-i”所示；

将c724-gal4品系的果蝇按照实施例2-1中空白对照组和草酸钙肾结石疾病组进行实验，c724-gal4品系的果蝇按照空白对照组获得的结果如图2g中“C724-Gal4”所示，c724-gal4品系的果蝇按照草酸钙肾结石疾病组获得的结果如图2g中“NaOx+C724-Gal4”所示。

如图2g和图2h所示，在果蝇马氏管星状细胞中敲低Daao1后，喂食果蝇含草酸钠的培养基(NaOx+C724＞Daao1-i)，果蝇马氏管内不再产生大量结石，提示Daao1表达水平的降低会防止果蝇草酸钙结石的产生。图2h统计了各组果蝇马氏管内结石程度(每组20只)，柱状图显示了不同组之间的结石程度的差异。

再结合实施例2-1中的图2i可知，地骨皮甲素处理后，果蝇体内Daao1的mRNA表达水平明显下调。由此可知，地骨皮甲素通过降低Daao1的表达水平，从而调控草酸代谢达到治疗草酸钙肾结石的作用。

实施例3多胺化合物天然产物地骨皮甲素对肾结石模型小鼠的治疗实验

(1)实验模型小鼠的准备

C57BL/6J雄性小鼠严格按照饲养标准在实验室鼠房进行饲养，实验许可证号SYXK(津)2019-0001：实验室鼠房维持温度23±3℃，相对湿度55±5％，环境相对安静。小鼠购回后，在实验室鼠房进行适应性喂养一周，待小鼠情况稳定后，进行后续实验。

(2)实验分组与处理

a、空白对照组：取4只适应性喂养一周后的C57BL/6J雄性小鼠，正常饲养，分别在早晚间隔12小时腹腔注射生理盐水，剂量为每30g小鼠体重注射生理盐水的体积为200μL，作为图3～6中的“对照组”。

b、单独给药组：取4只适应性喂养一周后的C57BL/6J雄性小鼠，于建模前1天开始，每日腹腔注射地骨皮甲素生理盐水溶液，剂量为每30g小鼠体重注射地骨皮甲素生理盐水溶液的体积为200μL，间隔12小时后，腹腔注射与地骨皮甲素生理盐水溶液相同体积的生理盐水，持续7天，作为图3～6中的“30mg/kg地骨皮甲素”，其中，注射地骨皮甲素生理盐水溶液时，根据小鼠的体重确定注射地骨皮甲素生理盐水溶液中含有的地骨皮甲素的质量，小鼠每1kg体重所注射的地骨皮甲素生理盐水溶液中含有的地骨皮甲素为30mg。

c、肾结石模型组：取7只适应性喂养一周后的C57BL/6J雄性小鼠，每日腹腔注射乙醛酸生理盐水溶液，剂量为每30g小鼠体重注射乙醛酸生理盐水溶液的体积为200μL，间隔12小时再腹腔注射与乙醛酸生理盐水溶液相同体积的生理盐水，持续6天，作为图3～6中的“乙醛酸”，其中，注射乙醛酸生理盐水溶液时，根据小鼠的体重确定注射乙醛酸生理盐水溶液中含有的乙醛酸的质量，小鼠每1kg体重所注射乙醛酸生理盐水溶液中含有的乙醛酸为75mg。

d、肾结石治疗组：取21只适应性喂养一周后的C57BL/6J雄性小鼠，建模前一天分别开始给药，腹腔注射药物，注射后间隔12小时，腹腔注射乙醛酸生理盐水溶液，持续7天。其中，根据小鼠的体重确定注射乙醛酸生理盐水溶液中含有的乙醛酸的质量，小鼠每1kg体重所注射乙醛酸生理盐水溶液中含有的乙醛酸为75mg。21只小鼠均分为3组(每组7只)，3组小鼠所注射的药物如下：

第一组小鼠注射的药物：小鼠每1kg体重注射10mg地骨皮甲素，作为图3～6中的“乙醛酸+10mg/kg地骨皮甲素”；

第二组小鼠注射的药物：小鼠每1kg体重注射30mg地骨皮甲素，作为图3～6中的“乙醛酸+30mg/kg地骨皮甲素”；

第三组小鼠注射的药物：小鼠每1kg体重注射50mg柠檬酸(阳性药物)，作为图3～6中的“乙醛酸+50mg/kg柠檬酸”。

(3)实验方法

为全面检测地骨皮甲素对小鼠肾结石的治疗效果，分别检测了肾结石相关的血清指标和组织学指标。实验期间，每日记录小鼠体重变化。7天给药治疗后，进行眼球取血，收集血清样本。之后颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠肾脏组织样本。

在血清水平上，检测小鼠血清中肌酐和尿素氮的含量，以评估小鼠肾脏的滤过功能。之后提取肾脏组织的RNA样本，通过qPCR检测肾损伤指示蛋白Kim-1和NGAL的mRNA含量，以评估各组中肾脏的损伤水平。同时，制备小鼠肾脏组织的石蜡切片，通过偏振光成像和Von Kossa染色，观察小鼠肾脏中结石的分布情况，并通过PAS染色观察小鼠肾脏的损伤情况。并且提取肝组织的mRNA样本，通过qPCR检测草酸代谢相关酶类Dao、Agxt、Ldh、Grhpr的mRNA含量。

数据以平均值±SEM；*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001和****p<0.0001表示。

(4)实验结果

实验结果如图3所示，其中，图3中A、B、C、D、E分别为小鼠最终体重与初始体重的比值、血清肌酐含量、血清尿素氮含量、肾组织肾损伤指示蛋白Kim-1的mRNA含量和Ngal的mRNA含量。

图4为肾组织石蜡切片的偏振光(A-F)和偏振光面积的统计图(G)。图5为实施例3中空白对照组、单独给药组、肾结石模型组和肾结石治疗组的Von Kossa染色(A-F)和染色的统计图(G)。图6为实施例3中空白对照组、单独给药组、肾结石模型组和肾结石治疗组的PAS染色(A-F)和染色的统计图(G)。图7为实施例3中空白对照组、单独给药组、肾结石模型组和肾结石治疗组肝脏中草酸代谢相关酶类中Dao、Agxt、Ldh、Grhpr的mRNA含量。这些结果显示，在肾结石模型组中，小鼠状态萎靡，体重下降；血清肌酐和尿素氮水平升高，提示小鼠肾脏滤过能力受损；肾损伤指示蛋白Kim-1和Ngal的mRNA含量升高，提示小鼠肾脏出现损伤；肾组织石蜡切片的偏振光和Von Kossa染色结果显示小鼠肾脏中结石大量累积；肾组织石蜡切片的PAS染色结果显示小鼠肾脏出现肾小管扩张、刷状缘脱落等肾损伤病变。而腹腔注射地骨皮甲素进行治疗后，小鼠状态有所恢复。小鼠体重下降减少；血清肌酐和尿素氮的水平有所下降，肾脏滤过能力有所恢复；肾损伤指示蛋白Kim-1和Ngal的mRNA含量有所下降，肾损伤减轻；偏振光和Von Kossa染色的结果提示地骨皮甲素治疗后，小鼠肾脏中结石减少；PAS染色显示小鼠肾脏肾小管扩张程度减轻，肾损伤有所缓解。地骨皮甲素的治疗效果具有一定的剂量依赖，而且高剂量地骨皮甲素(乙醛酸+30mg/kg地骨皮甲素)的治疗效果达到阳性对照药治疗组(乙醛酸+50mg/kg柠檬酸)同等水平。从毒理角度分析，与对照组相比，单独给药组中单独注射地骨皮甲素组各生理指标无明显改变，提示地骨皮甲素在该剂量下，未出现药物毒性。并且，小鼠腹腔注射地骨皮甲素进行治疗后，Ldh和Dao的mRNA表达水平下降，抑制内源性草酸的生成；Grhpr和Agxt的mRNA表达水平升高，可促使内源性草酸转化为甘氨酸和乙醇酸，减少肾结石的发生。而阳性对照药处理组并未出现此变化。由此可知，地骨皮甲素和阳性药物柠檬酸对内源性草酸代谢相关酶类的mRNA表达水平表现出明显不同的调控作用，提示两者治疗肾结石的机制有所不同。而地骨皮甲素通过抑制内源性草酸的生成，抑制草酸性肾结石的发生与积累，此结论与在果蝇模型上得到的结论一致。

实施例4

将金钱草15g、大黄18g、白茅根14g、地骨皮2g、甘草13g、白术11g、石韦18g、泽泻12g、车前子23g、海金沙12g、郁金17g、木通6g、鱼腥草14g、麦冬17g、肾经草13g、连翘12g和扁蓄16g用纯水煎煮，每次加水800ml，每次煎煮2h，三次煎煮的药液浓缩至200ml，得到中药组方(包含地骨皮)药液。

将金钱草15g、大黄18g、白茅根14g、甘草13g、白术11g、石韦18g、泽泻12g、车前子23g、海金沙12g、郁金17g、木通6g、鱼腥草14g、麦冬17g、肾经草13g、连翘12g和扁蓄16g用纯水煎煮，每次加水800ml，每次煎煮2h，三次煎煮的药液浓缩至200ml，得到中药组方(不包含地骨皮)药液，储存在4℃备用。

取100ml中药组方(包含地骨皮)药液和100ml中药组方(不包含地骨皮)药液，分别加入2.17g干酵母、1.31g蔗糖、6.67g玉米糖浆和1g琼脂，微波加热沸腾2-3次后停止加热，冷却后加入其0.1％(w/v)草酸钠、600uL丙酸和1000uL抗生素，倒入小管中，分别得到中药组方(包含地骨皮)的培养基和中药组方(不包含地骨皮)的培养基。

在空白培养基(与实施例2中空白培养基相同)、草酸钠培养基(与实施例2中草酸钙肾结石疾病组中培养基相同)、中药组方(包含地骨皮)的培养基和中药组方(不包含地骨皮)的培养基中各放入1-2日龄的野生果蝇，在25℃恒温的培养箱中培养7天后解剖果蝇马氏管，在偏振光显微镜下观察果蝇马氏管内结石情况并进行统计，如图8a和图8b所示。空白培养基对应于图8a和图8b中的“Control”，草酸钠培养基对应于图8a和图8b中的“NaOx”，中药组方(包含地骨皮)的培养基对应于图8a中的“NaOx+组方(包含地骨皮)”和图8b中的“NaOx+中药组方(包含地骨皮)”，中药组方(不包含地骨皮)的培养基对应于图8a中的“NaOx+组方(不包含地骨皮)”和图8b中的“NaOx+中药组方(不包含地骨皮)”。

由图8a和图8b可知，野生品系Canton.S果蝇在喂食高浓度草酸钠7天后，果蝇马氏管(相当于人类肾脏)中存在大量大块结晶，表明果蝇草酸钙结石建模成功。经中药组方(包含地骨皮)药液治疗后，果蝇马氏管内结石程度明显减轻，可认定中药组方(包含地骨皮)对果蝇草酸钙结石有缓解/治疗作用。经中药组方(不包含地骨皮)药液处理后，果蝇马氏管内结石程度减轻，与中药组方(包含地骨皮)药液结石程度无差异，说明地骨皮不影响中药组方的治疗效力，地骨皮不是中药组方的主要起效成分，即地骨皮并非是中药组合物中的君药。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (2)

1.地骨皮甲素作为唯一活性成分在制备治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中的用途。

2.地骨皮甲素及其药学上可接受的盐或酯作为唯一活性成分在制备治疗肾结石药物/缓解肾结石药物中的应用。