CN115463201B

CN115463201B - 一种具有预防肠道炎癌转化的中药组合物及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115463201B
Application number: CN202210884054.3A
Authority: CN
Inventors: 陈玉根; 蒋峰; 王琼; 丁洋; 冯泽宇; 段正兰; 部繁; 卢志华; 袁晓敏
Original assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Current assignee: Jiangsu Provincial Hospital of Chinese Medicine
Priority date: 2022-07-26
Filing date: 2022-07-26
Publication date: 2023-06-13
Anticipated expiration: 2042-07-26
Also published as: CN115463201A

Abstract

本发明公开了一种具有预防肠道炎癌转化的中药组合物及其制备方法，它是由乌梅2～8份、黄连2～8份、干姜2～5份、黄柏1～3份、当归1～2份制成。本发明在中医经典名方乌梅丸现有药味基础上进行了精简优化，在中医经典名方黄连干姜汤基础上进行剂量比例的优化。研究结果表明,组成黄连干姜汤的五味中药是乌梅丸预防肠道炎癌转化的核心处方，乌梅丸中上述五味核心中药的传统剂量比例是最优配伍比例，由此优化后的中药组合物能够有效增加肠炎小鼠体重和结肠长度，改善结肠病理状况，疗效优于现有乌梅丸，且避免了乌梅丸有毒中药的长期运用；并且精简后的中药组合物能够有效预防肠道炎癌转化，减轻肠道炎症、减少肠腔肿瘤数目、缩小肿瘤体积，不含毒性中药原料，安全性更好。

Description

一种具有预防肠道炎癌转化的中药组合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，具体涉及一种具有预防肠道炎癌转化的中药组合物,属于中医药技术领域。

背景技术

慢性炎症与结直肠癌的发病密切相关，被认为是肿瘤发生的始动因素之一，炎症性肠病(IBD)导致患者死亡原因中，结肠炎相关肠癌(colitis-associated CRC,CAC)约占10％-15％。肠道慢性炎症环境为基因突变创造条件，促进肿瘤的发生；持续的DNA损伤诱导炎症，使基因突变的上皮细胞更易于发生转化。“炎症-不典型增生-癌变”是CAC发生的基本路径，控制“炎癌转化”对预防CAC 意义重大。

已有专家推荐将抗炎药纳入到预防CAC的化学药物中。被推荐的抗炎药包括 5-氨基水杨酸(5-ASA)、硫唑嘌呤、熊去氧胆酸(UDCA)等。5-ASA是临床上治疗炎症性肠病(IBD)的一线用药，但其对于部分IBD患者中的化学预防作用仍然有限。并且长时间使用5-ASA，除了会出现常见的胃肠道反应如(腹痛、恶心和腹泻)，还会增加使用者患肾脏疾病的风险。因此，寻找安全有效的替代药物，对于CAC的防治仍然具有重要意义。

现有技术的乌梅丸能够通过调节肠道菌群来减轻CAC的发展。但乌梅丸中有附子、细辛等有一定毒性的药物，作为长期预防性用药存在安全隐患；因此，乌梅丸预防CAC的药物组成需要优化，需要寻求其核心处方加以优化。网络药理学研究发现，经典名方黄连干姜汤中五味中药(乌梅、黄连、干姜、黄柏、当归) 是乌梅丸发挥治疗肠道炎症的核心中药。现有研究提示黄连干姜汤能够治疗肠道炎症，但能否预防肠道炎癌转化尚无研究报道。

目前尚未有乌梅丸原有药味基础上进行优化来预防肠道炎癌转化作用的相关报道。并且中药剂量配伍比例对疗效发挥有重要影响，中医有“传药不传量”之说，探讨乌梅丸优化方预防炎癌转化疗效最佳剂量配伍亦尚无研究和报道。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种在乌梅丸的基础上优化中药原料组成和剂量配比及其制备方法，筛选出不良反应低，具有预防肠道炎癌转化,抑制肠道息肉微创治疗后再发的中药组合物。

技术方案：为解决上述技术问题,本发明采取的技术方案如下：

一种具有预防肠道炎癌转化的中药组合物，它由以下重量份数的原料制成：

乌梅2～8份、黄连2～8份、干姜2～5份、黄柏1～3份、当归1～2 份。

作为优选方案，以上所述的具有预防肠道炎癌转化的中药组合物，它由以下重量份数/比例的原料制成：

乌梅8份、黄连8份、干姜5份、黄柏3份、当归2份。

本发明提供的具有预防肠道炎癌转化的中药组合物的制备方法：其包括以下步骤：

取乌梅2～8份、黄连2～8份、干姜2～5份、黄柏1～3份、当归1～2 份，加水没过药材，浸泡20-30分钟，煎煮提取2次，合并煎煮提取液，浓缩既得。

本发明中药组合物中，乌梅涩肠止泻、止血，黄连、黄柏清泄湿热；干姜温脏祛寒，当归补养气血；全方寒热并用，邪正兼顾，共奏清热解毒，调肠止泻之功，尤其适用于炎症性肠病及CAC的早期防治。

有益效果：本发明和现有技术相比具有以下优点：

(1)本发明在乌梅丸治疗肠炎的基础上，基于网络药理学研究，并通过大量的动物实验筛选，深入研究，采用液相质谱技术与网络药理学精简乌梅丸的药味组成,实验结果表明,优化后的中药组合物具有增加肠炎小鼠体重和结肠长度，改善结肠病理状况，疗效优于现有乌梅丸；并且精简后的中药组合物能够有效预防肠道炎癌转化，减轻肠道炎症、减少肠腔肿瘤数目、缩小肿瘤体积。临床上可以用于制备预防肠道炎癌转化的药物。

(2)本发明中药组合物可以制备预防肠道炎癌转化药物中的应用，所述的肠道炎癌转化包括溃疡性结肠炎或局限性肠炎(病因)、肠道炎性息肉、腺瘤、粘膜增生转变成结肠癌或直肠癌(过程)。

附图说明

图1为药物-有效成分-疾病靶点网络图。

图2为乌梅丸及乌梅丸优化方对IL-10敲除小鼠体重的影响。各给药组与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

图3为乌梅丸及乌梅丸优化方对IL-10敲除小鼠结肠长度、重量及肠重指数的影响。A：结肠长度；B：结肠长度比较；C：结肠重量；D：结肠重量指数。各给药组与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

图4为乌梅丸及乌梅丸优化方对IL-10敲除小鼠结肠组织病理的影响。

图5为乌梅丸优化方对CAC小鼠的体重的影响。各给药组与模型组比较： *P<0.05，**P<0.01。

图6为乌梅丸优化方对CAC小鼠的结肠长度和脾脏重量的影响。各给药组与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

图7为乌梅丸优化方对CAC小鼠的肠道肿瘤数量和体积的影响。各给药组与模型组比较：*P<0.05，**P<0.01。

图8为乌梅丸优化方对CAC小鼠结肠组织病理和Ki67蛋白的影响。

图9为实施例4中的造模、给药和取材的时间图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1乌梅丸的制备

1、乌梅丸的制备方法：取乌梅8g、黄连8g、黄柏3g、制附片3g、干姜5g、细辛3g、桂枝3g、川椒2g、党参3g、当归2g，加适量水没过药材浸泡30分钟，然后加10倍量的水煎煮提取2次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并二次煎煮提取液，浓缩至200ml，即得。

实施例2乌梅丸优化方

1、一种具有预防肠道炎癌转化的中药组合物(简称：乌梅丸优化方)，它由以下重量份数的原料制成：

乌梅8g、黄连8g、干姜5g、黄柏3g、当归2g。

2、具有预防肠道炎癌转化的中药组合物的制备方法：

取乌梅8g、黄连8g、干姜5g、黄柏3g、当归2g，加适量水没过药材浸泡 30分钟，然后加10倍量的水煎煮提取2次，第一次1.5小时，第二次1小时，合并二次煎煮提取液，浓缩至200ml，即得。

实施例3基于液相色谱和网络药理学优化乌梅丸

1、液相色谱(HPLC)测定乌梅丸有效成分

取实施例1的乌梅丸提取物，加入等体积甲醇震荡、离心(12000rpm× 10min)，上清用0.45μM微孔滤膜过滤，收集滤液4℃保存。实验前，根据需要对滤液进行梯度稀释(50％甲醇)，12000rpm×10min离心后，0.45μM微孔滤膜过滤，收集滤液进样分析。选择乌梅丸中11个代表性化合物：黄柏碱、药根碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀、小檗碱、6-姜酚、羟基-α-山椒素、细辛脂素、柠檬酸、阿魏酸配制混合标准品溶液，梯度稀释后制备标准曲线，按“液相色谱条件”及“质谱条件”进样分析。

液相色谱条件

正离子

Poroshell SB-C18色谱柱(3.0mm×100mm,2.7μm,Agilent)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈：甲醇＝1:1(B)，梯度洗脱(Table 1)；流速：450μL·min^-1；柱温：40℃；进样量：5μL。梯度洗脱方式如下表1：

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	72	28
2.5	65	35
			3.5	25	75
5.5	25	75
			6.5	72	28
11	72	28

负离子

ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1mm×150mm,5μm,Agilent)；流动相：0.1％甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(Table 2)；流速：250μL·min^-1；柱温： 40℃；进样量：5μL。梯度洗脱方式如下表2：

表2梯度洗脱方式

时间(min)	A(％)	B(％)
			0	98	2
1.5	98	2
			4	8	92
6	8	92
			7	98	2
12	98	2

质谱条件

离子源：ESI；喷雾电压(IonSpray Voltage/IS)5500V(正)/-4500V(负)，辅助气1(Ion Source Gas 1，N2)50psi，辅助气2(Ion Source Gas 2，N2)55psi，辅助气加热温度(Temperature/TEM)500℃，气帘气(Curtain Gas/CUR)10psi；碰撞气(Collision Gas/CAD，N2)6psi。

选用多重离子反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)，各分析物的质谱参数如表3：

表3多反应模式的质谱参数

根据HPLC结果，对乌梅丸的主要成分进行了分析，结果如表4：

表4乌梅丸主要成分及含量

No.	成分	含量(mg/g)
			1	黄柏碱	0.442
2	药根碱	3.047
			3	黄连碱	8.830
4	表小檗碱	3.862
			5	巴马汀	7.533
6	小檗碱	37.63
			7	6-姜酚	0.264
8	羟基-α-山椒素	0.247
			9	细辛脂素	0.054
10	柠檬酸	97.86
			11	阿魏酸	0.176

2、根据药物主要有效成分通过网络药理学优化乌梅丸

HPLC检测出乌梅丸的11个主要有效成分与结肠炎相关肠癌(CAC)相关疾病基因进行网络药理分析，如图1发现乌梅丸治疗CAC的有效成分来源于乌梅、黄连、黄柏、当归、干姜。

实施例3乌梅丸及乌梅丸优化方对IL-10基因敲除小鼠自发肠炎的治疗作用研究

1、实验动物

选取6-8周龄IL-10基因敲除C57BL/6小鼠(上海禾昱生物科技有限公司)。饲养于南京中医药大学大学附属医院基础药理实验室(江苏，南京)。许可证号： SYXK(苏)2012-0047。小鼠于SPF房间喂养，在此期间不限制食物和饮水，温度控制在23±1℃，湿度控制在50±5％，光照系统设定为12小时/天。

2、实验方法

2.1给药方法

将IL-10基因敲除C57BL/6小鼠随机分为4组：模型组(Model)、实施例 1乌梅丸组(WMW)、实施例2乌梅丸优化方组(WMW5)、醋酸泼尼松组(PA)，每组8只，共32只。小鼠适应性喂养7天后开始给药，给药方式：上述所有药物均为1次/天，乌梅丸(6g/kg)、乌梅丸优化方(4g/kg)和泼尼松(2.5mg/kg)：口服灌胃。

2.2疾病活动指数(DAI)评估

疾病活动性指数的计算方法是：出现以下的每一项分别评分为1分：皱褶的皮毛，潜血测试卡上确定的潜血，直肠脱垂<1mm和软便。腹泻或严重直肠脱垂 >1mm的小鼠另外加1分。

2.3实验动物的处死及样本收集保存

实验结束后，迅速将小鼠实施安乐死，剖腹取结肠标本，测量并记录结肠长度、结肠重量，并计算肠重指数。沿肠管纵轴剖开，截取1段长约1-3cm结肠组织，置于4％多聚甲醛中固定用于病理及免疫组化检测，24小时后进行常规石蜡包埋，切片，随后进行免疫组化染色和HE染色。

肠重指数＝结肠重量(g)/结肠长度(cm)×100％

2.4数据统计与分析

采用GrapPad Prism 8统计软件处理分析所有数据，计量资料以均数±标准误(Mean±SEM)表示。P<0.05表示有统计学差异。

3.实验结果

3.1乌梅丸及乌梅丸优化方对IL-10敲除小鼠DAI的影响

造模过程中，模型组小鼠体重无明显增长，进食量减少，毛发粗糙晦暗，大便由黏便逐渐变为稀便且可见肉眼血便，严重者直肠脱出肛门外。三个给药组显著降低肠炎小鼠DAI评分，其中乌梅丸优化方对DAI评分的降低效果最好 (P<0.01)，乌梅丸组和醋酸泼尼松组降低DAI评分的效果相当(P<0.05)。实验结果如图2所示。

3.2乌梅丸及乌梅丸优化方对IL-10敲除小鼠的结肠长度、结肠重量和结肠指数的影响

IL-10敲除小鼠会自发肠炎导致结肠长度明显缩短、结肠重量显著增加，肠重指数显著增加。与模型组相比，乌梅丸组能明显抑制结肠缩短(P<0.05)，但是对结肠重量和结肠重量指数增加的抑制作用不明显；而乌梅丸优化方可以显著抑制结肠缩短(P<0.05)和抑制结肠重量(P<0.01)和肠重指数的增加(P<0.001)；醋酸泼尼松也显著增加了结肠长度(P<0.01)和抑制结肠指数的增加(P<0.01)，但是对结肠重量的改善不明显。实验结果如图3所示。

3.3乌梅丸及乌梅丸优化方对IL-10敲除小鼠结肠组织病理学及病理学评分的影响

IL-10敲除小鼠自发肠炎会导致结肠组织中性粒细胞浸润、隐窝水肿、隐窝损伤、杯状细胞减少、肠上皮增生。如图4所示，模型组免疫细胞浸润增加、隐窝水肿，隐窝结构遭到破坏。与模型组相比，乌梅丸组、乌梅丸优化方组、醋酸泼尼松组小鼠结肠组织免疫细胞浸润显著减少，隐窝水肿减轻，隐窝结构破坏不明显。

实施例4乌梅丸优化方对AOM-DSS诱导的小鼠结肠肿瘤预防和治疗作用研究 1、实验动物

选6-8周龄C57BL/6小鼠(浙江斯贝福生物科技有限公司)，小鼠于SPF房间适应性喂养一周，在此期间自由饮食饮水，温度控制在23±1℃，湿度控制在50±5％，光照系统设定为12小时/天。

2、实验方法

2.1动物分组、造模与给药

将小鼠随机分4组，即空白组、模型组(CAC)、乌梅丸优化方组(WMW5)、乌梅丸原方组(WMW),每组各15只。给予单次小剂量偶氮氧甲烷(AOM 10mg/kg) 腹腔注射，一周后联合三个循环DSS喂饲(2％DSS自由饮水1周+正常饮水2 周为一个循环)，建立AOM/DSS诱导的CAC小鼠模型。第一循环给予DSS后，即第4周开始给予乌梅丸优化方(4g/kg)和乌梅丸(6g/kg)每日灌胃给药，至第13周结束，获取标本。

2.2药物干预期间观察指标及标本采集

每周1次记录小鼠体重变化,至第13周实验结束，对小鼠实施安乐死。摘取小鼠脾脏称重后，截取肛门至盲肠端的结肠肠段，测量结肠长度并称重；将肠管沿纵轴剖开，PBS冲洗肠内容物，计算肿瘤个数及大小。

2.3数据统计与分析

3.实验结果

3.1乌梅丸优化方可以显著提高CAC小鼠的体重

如图5所示，与空白组相比，CAC组小鼠体重显著降低(P<0.01)；乌梅丸优化方与乌梅丸原方在后期均显著提升了CAC小鼠的体重(P<0.05)。

3.2乌梅丸优化方可以显著增加CAC小鼠的结肠长度，降低小鼠脾脏重量

与空白组相比，CAC小鼠的结肠长度明显缩短(P<0.01)，与CAC组相比，乌梅丸优化方与乌梅丸原方均能明显抑制结肠缩短(P<0.01)，(P<0.05)；与空白组相比，CAC小鼠的脾脏重量显著增加(P<0.01)，说明小鼠的免疫功能亢进，疾病程度严重；而乌梅丸优化方与乌梅丸原方均能明显降低脾脏重量(P<0.01)，表明小鼠的免疫功能趋于平稳，疾病程度减轻。并且经过对比，乌梅丸优化方优于乌梅丸原方。实验结果如图6所示。

3.3乌梅丸优化方可以显著减少肠道肿瘤数量和体积

实验结果如图7所示。AOM/DSS造模引起小鼠肠腔肿瘤数目增长和直径变大，与CAC组相比，乌梅丸优化方与乌梅丸原方均能明显减少结肠肿瘤数量；显著减小肠腔肿瘤的直径大小。并且经过对比，乌梅丸优化方优于乌梅丸原方。 3.4乌梅丸优化方可以显著减轻肠道炎症和肿瘤增殖

如图8所示，空白组小鼠结肠黏膜、腺体结构完整，隐窝正常，未见炎性细胞浸润。模型组出现结肠黏膜损伤，隐窝消失，腺体变形扭曲和减少，并且存在大量炎症细胞浸润等现象。乌梅丸优化方组结肠黏膜轻度损伤，腺体减少或变形，隐窝有部分炎症细胞浸润。与空白组相比，模型组Ki67的蛋白表达量较空白组明显升高，说明模型组小鼠结肠肿瘤增殖明显，经乌梅丸优化方与乌梅丸原方干预后，Ki67的表达量均下降，说明乌梅丸优化方与乌梅丸原方一样可以抑制肿瘤细胞的增殖，从而减少肿瘤的发生。

本发明依据上述方法研究表明，乌梅丸优化方能够替代甚至优于乌梅丸治疗肠炎，可以起到良好地预防肠道炎癌转化的作用；并且乌梅丸优化方与乌梅丸一样能够有效地减轻肠道炎症，抑制肠道肿瘤数量与体积的增长。同时，相较于乌梅丸原方，乌梅丸优化方去除了附子、细辛等有一定毒性的药物；作为预防结肠炎癌转化的长期性药品，更具安全性。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种预防肠道炎癌转化的中药组合物，其特征在于，它由以下重量份数的原料制成：

乌梅 2～8份、黄连 2～8份、干姜2～5份、黄柏1～3份、当归 1～2份。

2.根据权利要求1所述的预防肠道炎癌转化的中药组合物，其特征在于，它由以下重量份数的原料制成：

乌梅8份、黄连8份、干姜5份、黄柏3份、当归2份。

3.权利要求1或2所述的预防肠道炎癌转化的中药组合物的制备方法：其特征在于，包括以下步骤：

按重量份数取乌梅、黄连、干姜、黄柏、当归，加水没过药材，浸泡20-30分钟，煎煮提取2次，合并煎煮提取液，浓缩，即得。

4.权利要求1或2所述的中药组合物在制备预防肠道炎癌转化药物中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的肠道炎癌转化包括溃疡性结肠炎或局限性肠炎、肠道炎性息肉、腺瘤、粘膜增生转变成结肠癌或直肠癌。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，将中药组合物的提取物和药学上可接受的载体制备成颗粒剂、片剂、胶囊剂或口服液制剂。