CN113956310B - 三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法 - Google Patents

三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法 Download PDF

Info

Publication number
CN113956310B
CN113956310B CN202111502347.2A CN202111502347A CN113956310B CN 113956310 B CN113956310 B CN 113956310B CN 202111502347 A CN202111502347 A CN 202111502347A CN 113956310 B CN113956310 B CN 113956310B
Authority
CN
China
Prior art keywords
fraction
phase
ethanol
drying
extracting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202111502347.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113956310A (zh
Inventor
孙崇鲁
彭昕
李士敏
袁莉霞
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang Medical College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang Medical College filed Critical Zhejiang Medical College
Priority to CN202111502347.2A priority Critical patent/CN113956310B/zh
Publication of CN113956310A publication Critical patent/CN113956310A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113956310B publication Critical patent/CN113956310B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H17/00—Compounds containing heterocyclic radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H17/04—Heterocyclic radicals containing only oxygen as ring hetero atoms
    • C07H17/06—Benzopyran radicals
    • C07H17/065—Benzo[b]pyrans
    • C07H17/07—Benzo[b]pyran-4-ones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives
    • C07H1/06—Separation; Purification
    • C07H1/08—Separation; Purification from natural products

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Plant Substances (AREA)

Abstract

本发明提供一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，包括步骤：S1样品提取：乙醇回流提取得三叶青地上部分粗提物；S2总黄酮提取：粗提物经大孔吸附树脂层析柱吸附得中提物；S3初分离：采用聚酰胺柱对中提物分离纯化，采用UV检测器进行检测，分别收集有吸收的组分物质，减压浓缩，真空干燥得馏分‑Ⅰ、馏分‑Ⅱ和馏分‑Ⅲ；S4终分离：馏分‑Ⅰ、馏分‑Ⅱ和馏分‑Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱分离纯化，采用UV检测器进行检测，分别收集有吸收的组分物质，减压浓缩，真空干燥得多种黄酮化合物单体，本发明所述三叶青地上部分黄酮碳苷单体分离提取方法操作简单、生产周期短，便于工业化规模生产，且分离效果好，产品纯度高。

Description

三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法
技术领域
本发明涉及中草药分离提纯方法，具体涉及一种从三叶青地上部分分离提取得到6种黄酮碳苷单体的方法。
背景技术
三叶青(Tetrastigma hemsleyanum)为葡萄科崖爬藤属植物，学名三叶崖爬藤，又名角乌蔹莓、石老鼠、金钱吊葫芦等，是我国著名的食药用植物，主要分布在我国长江流域的浙江、福建、江西、广西和云南等省。民间常用于小儿高热惊厥、咽痛、肝炎、痛疮、毒蛇咬伤、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病的治疗。现代药理学研究表明，三叶青的根块提取物具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、保肝护肝和风湿性疼痛等多种功能，在中药市场上已被用作治疗药物。迄今为止，本领域的研究大多集中在其根的化学成分和生物活性方面，对于三叶青地上部分的研究却鲜见报道，关于其健康功能性成分的信息也很少。然而，在民间医学中，三叶青地上部分的提取物早已被用于治疗肝炎、类风湿性关节炎、病毒性脑膜炎等疾病，因此，对三叶青地上部分的提取物及其提取技术进行研究具有十分重要的意义。
目前从三叶青地上部分中初分离总黄酮的方法主要有两大类。一类是采用溶剂萃取的方法进行初分离，此法得到的是三叶青地上部分总黄酮的粗品，不但收率不高，还有有机溶剂残留会影响产品质量；另一类是采用大孔吸附树脂来分离，其依赖传统的吸附一解吸工艺，操作过程无法跟踪检测，且此方法同样只能得到三叶青地上部分总黄酮粗品，无法得到黄酮碳苷单体。
另外，目前已公开的技术中，三叶青地上部分中黄酮类单体物质的分离主要涉及到采用正相硅胶柱层析，凝胶柱层析，反相制备HPLC分离的方法，其中正相硅胶柱层析由于对普类物质吸附强而使分离效果拖尾严重，分离效果不佳，凝胶柱层析和反相制备HPLC分离由于要用到昂贵的色谱级溶剂和分离量小无法用于规模化分离。
为解决上述技术问题，特提出本申请。
发明内容
本发明设计出一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，以实现对三叶青地上部分黄酮碳苷单体进行有效分离的目的。
为解决上述问题，本发明公开了一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，包括步骤：
S1，样品提取：利用乙醇对三叶青地上部分进行回流提取，获得三叶青地上部分粗提物；
S2，总黄酮的提取：粗提物加纯化水悬浮后，加入到大孔吸附树脂层析柱里进行吸附，之后分别用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液干燥，得中提物；
S3，黄酮类化合物单体的初分离：采用聚酰胺柱对步骤S2所得中提物进行分离纯化，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物；
S4，黄酮类化合物单体的终分离：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得多种黄酮化合物单体。
进一步的，所述步骤S1中样品提取过程包括：
S11，三叶青地上部分预处理：将三叶青地上部分粉碎后，得三叶青地上部分粗粉；
S12，乙醇回流提取：称取一定量的三叶青地上部分粗粉，置于提取罐中进行乙醇回流提取，其中，乙醇回流提取条件为：采用50～70％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1：10～15g/mL，提取温度为60～80℃，提取时间为2～3h；重复上述乙醇回流提取三次，过滤后，合并滤液，得提取液；
S13，减压浓缩：提取液在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至无醇度后，获得粗提物。
进一步的，所述步骤S2中总黄酮的提取过程包括：将步骤S1得到的粗提物加纯化水配置成总黄酮含量为2.0～5.0mg/mL的混悬液，并调节混悬液的pH值为4.0～6.0；将混悬液离心，取上清液，以3.0～4.0BV/h的上样流速上样于大孔吸附树脂柱上；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1:8～1:15，且上柱量中，三叶青地上部分粗粉与树脂量的比例为3:1～1:1；吸附完毕后静置过夜，然后按1.0～4.0BV/h的洗脱速度进行洗脱，先用蒸馏水洗至无混浊后，再用3～6BV浓度为50％的乙醇洗脱，收集0.5～2.0BV区间的洗脱液，之后将所述洗脱液旋干至无醇度，得浸膏，将所述浸膏置于50℃减压干燥至干，得中提物。
进一步的，所述大孔吸附树脂柱为AB-8或D101型大孔吸附树脂层析柱。
进一步的，所述步骤S3中黄酮类化合物单体的初分离过程包括：将步骤S2得到的中提物干法上样于聚酰胺柱，分别用体积百分比为10％，30％，50％，70％，95％的乙醇进行梯度洗脱，同时采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物。
进一步的，所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程的条件如下：以聚酰胺为填料的自填装内径为35mm，柱长为200mm，粒度为75～150μm，添料量为60g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：4g/次；梯度洗脱条件：0-5min：B相0；5-20min：B相10％；20-40min：B相30％；40-60min：B相50％；60-80min：B相70％；80-100min：B相95％。
进一步的，所述馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别为所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的混合组分。
进一步的，所述步骤S4中黄酮类化合物单体的终分离过程包括：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，分别用10％，10～80％，80～100％乙醇进行梯度洗脱，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体。
进一步的，所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程的条件如下：以C18为填料的自填装内径为30mm，柱长为100mm，粒度为15μm，添料量为20g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：甲醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：1g/次；梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-20min：B相10％；20-60min：B相10％-80％；60-75min：B相80％-100％；75-85min：B相100％；按照该条件多次重复进样。
进一步的，所述orientin和isoorientin分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅰ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-2和vicenin-2分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅱ使用10％乙醇洗脱液和80～100％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-1和vicenin-1分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅲ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分。
本申请所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法首先利用乙醇回流提取法得到待纯化分离的样品，之后通过大孔吸附树脂柱层析法对样品中的总黄酮进行了提出和富集，在此基础上，通过聚酰胺快速制备色谱和高效液相色谱对黄酮类化合物单体进行了初分离，之后经过反相中压快速制备色谱将得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ进一步分离纯化，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体。整个分离提取过程操作简单、生产周期短，便于工业化规模生产，且分离效果好，产品纯度高。
附图说明
图1为本发明所述黄酮碳苷单体的分离提取方法的流程图；
图2为本发明所述黄酮碳苷单体orientin的氢谱图；
图3为本发明所述黄酮碳苷单体orientin的碳谱图；
图4为本发明所述黄酮碳苷单体Isoorientin的氢谱图；
图5为本发明所述黄酮碳苷单体Isoorientin的碳谱图；
图6为本发明所述黄酮碳苷单体Lucenin-2的氢谱图；
图7为本发明所述黄酮碳苷单体Lucenin-2的碳谱图；
图8为本发明所述黄酮碳苷单体Vicenin-2的氢谱图；
图9为本发明所述黄酮碳苷单体Vicenin-2的碳谱图；
图10为本发明所述黄酮碳苷单体Lucenin-1的氢谱图；
图11为本发明所述黄酮碳苷单体Lucenin-1的碳谱图；
图12为本发明所述黄酮碳苷单体Vicenin-1的氢谱图；
图13为本发明所述黄酮碳苷单体Vicenin-1的碳谱图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细的说明。
如图1所示，本发明提供了一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，包括步骤：
S1，样品提取：利用乙醇对三叶青地上部分进行回流提取，获得三叶青地上部分粗提物；
S2，总黄酮的提取：粗提物加纯化水悬浮后，加入到大孔吸附树脂层析柱里进行吸附，之后分别用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液干燥，得中提物；
S3，黄酮类化合物单体的初分离：采用聚酰胺柱对步骤S2所得中提物进行分离纯化，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物；
S4，黄酮类化合物单体的终分离：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得多种黄酮化合物单体。
具体的，所述步骤S1中样品提取过程具体包括：
S11，三叶青地上部分预处理：将三叶青地上部分粉碎后，得三叶青地上部分粗粉；
S12，乙醇回流提取：称取一定量的三叶青地上部分粗粉，置于提取罐中进行乙醇回流提取，其中，乙醇回流提取条件为：采用50～70％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1：10～15g/mL，提取温度为60～80℃，提取时间为2～3h；重复上述乙醇回流提取三次，过滤后，合并滤液，得提取液；
S13，减压浓缩：提取液在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至无醇度后，获得粗提物。
进一步的，所述步骤S2中总黄酮的提取过程包括：将步骤S1得到的粗提物加纯化水配置成总黄酮含量为2.0～5.0mg/mL的混悬液，并调节混悬液的pH值为4.0～6.0；将混悬液离心，取上清液，以3.0～4.0BV/h的上样流速上样于大孔吸附树脂柱上；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1:8～1:15，且上柱量中，三叶青地上部分粗粉与树脂量的比例为3:1～1:1；吸附完毕后静置过夜，然后按1.0～4.0BV/h的洗脱速度进行洗脱，先用蒸馏水洗至无混浊后，再用3～6BV浓度为50％的乙醇洗脱，收集0.5～2.0BV区间(即40％～50％乙醇溶液洗脱至0.5倍柱体积时开始收集，一直到2倍柱体积为止)的洗脱液，之后将所述洗脱液旋干至无醇度，得浸膏，将所述浸膏置于50℃减压干燥至干，得中提物。
优选的，所述大孔吸附树脂柱为AB-8或D101型大孔吸附树脂层析柱。
进一步的，所述步骤S3中黄酮类化合物单体的初分离过程包括：将步骤S2得到的中提物干法上样于聚酰胺柱，分别用10％，30％，50％，70％，95％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，同时采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物。
具体的，所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程的条件如下：以聚酰胺为填料的自填装内径为35mm，柱长为200mm，粒度为75～150μm，添料量为60g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：4g/次；梯度洗脱条件：0-5min：B相0；5-20min：B相10％；20-40min：B相30％；40-60min：B相50％；60-80min：B相70％；80-100min：B相95％。由于三叶青地上部分黄酮碳苷单体的结构类似，采用常见的方法难以区分，本申请通过采用聚酰胺快速制备色谱纯化法实现了成分复杂的中提物的初步分离，不但简单快速、易于操作，且分离效果佳。
更进一步的，所述馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别为所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的混合组分。
进一步的，所述步骤S4中黄酮类化合物单体的终分离过程包括：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，分别用10％，10～80％，80～100％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体。
具体的，所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程的条件如下：以C18为填料的自填装内径为30mm，柱长为100mm，粒度为15μm，添料量为20g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：甲醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：1g/次；梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-20min：B相10％；20-60min：B相10％-80％；60-75min：B相80％-100％；75-85min：B相100％；按照该条件多次重复进样。
更进一步的，所述orientin和isoorientin分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅰ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-2和vicenin-2分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅱ使用10％乙醇洗脱液和80～100％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-1和vicenin-1分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅲ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分，且所述黄酮碳苷单体化合物orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1的纯度均大于95％。
进一步的，附图2～13是本申请所分离得到的orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮碳苷单体化合物的氢谱和碳谱检测结果。
本申请所述三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法首先利用乙醇回流提取法得到待纯化分离的样品，之后通过大孔吸附树脂柱层析法对样品中的总黄酮进行了提出和富集，在此基础上，通过聚酰胺快速制备色谱和高效液相色谱对黄酮类化合物单体进行了初分离，之后经过反相中压快速制备色谱将得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ进一步分离纯化，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体。整个分离提取过程操作简单、生产周期短，便于工业化规模生产，且分离效果好，产品纯度高。
以下通过具体的实施例对上述三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法进行详细说明：
实施例1
一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，包括步骤：
S1，样品提取：将三叶青地上部分粉碎后，得三叶青地上部分粗粉；称取2Kg三叶青地上部分粗粉，置于50L提取罐中，提取条件为：70％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1：15g/mL，提取温度为80℃，提取时间为3h，然后重复乙醇回流提取三次，过滤，合并滤液，得提取液；提取液在-0.05～-0.1MPa真空中，40℃浓缩至无醇度后，获得粗提物；
S2，总黄酮的提取：将步骤S1得到的粗提物加纯化水配置成总黄酮含量为2.0mg/mL的混悬液，并调节混悬液的pH值为4.0；将混悬液离心，取上清液，以3.0BV/h的上样流速上样于大孔吸附树脂柱上；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1:10，且上柱量中，三叶青地上部分粗粉与树脂量的比例为3:1；吸附完毕后静置过夜，然后按1.0BV/h的洗脱速度进行洗脱，先用蒸馏水洗至无混浊后，再用3BV浓度为50％的乙醇洗脱，收集0.5～2.0BV区间的洗脱液，之后将所述洗脱液旋干至无醇度，得浸膏，将所述浸膏置于50℃减压干燥至干，得中提物；
S3，黄酮类化合物单体的初分离：将步骤S2得到的中提物干法上样于聚酰胺柱，分别用10％，30％，50％，70％，95％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，同时采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物；其中，聚酰胺柱分离纯化过程的条件如下：以聚酰胺为填料的自填装内径为35mm，柱长为200mm，粒度为75～150μm，添料量为60g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：4g/次；梯度洗脱条件：0-5min：B相0；5-20min：B相10％；20-40min：B相30％；40-60min：B相50％；60-80min：B相70％；80-100min：B相95％，所述馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别为所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的混合组分；
S4，黄酮类化合物单体的终分离：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，分别用10％，10～80％，80～100％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体，其中，反相中压快速制备色谱分离纯化过程的条件为：以C18为填料的自填装内径为30mm，柱长为100mm，粒度为15μm，添料量为20g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：甲醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：1g/次；梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-20min：B相10％；20-60min：B相10％-80％；60-75min：B相80％-100％；75-85min：B相100％；按照该条件多次重复进样，所述orientin和isoorientin分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅰ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-2和vicenin-2分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅱ使用10％乙醇洗脱液和80～100％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-1和vicenin-1分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅲ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分。
实施例2
一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，包括步骤：
S1，样品提取：将三叶青地上部分粉碎后，得三叶青地上部分粗粉；称取2Kg三叶青地上部分粗粉，置于50L提取罐中，提取条件为：50％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1：10g/mL，提取温度为60℃，提取时间为2h，然后重复乙醇回流提取三次，过滤，合并滤液，得提取液；提取液在-0.05～-0.1MPa真空中，80℃浓缩至无醇度后，获得粗提物；
S2，总黄酮的提取：将步骤S1得到的粗提物加纯化水配置成总黄酮含量为4.0mg/mL的混悬液，并调节混悬液的pH值为5.0；将混悬液离心，取上清液，以4.0BV/h的上样流速上样于大孔吸附树脂柱上；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1:8，且上柱量中，三叶青地上部分粗粉与树脂量的比例为2:1；吸附完毕后静置过夜，然后按3.0BV/h的洗脱速度进行洗脱，先用蒸馏水洗至无混浊后，再用5BV浓度为50％的乙醇洗脱，收集0.5～2.0BV区间的洗脱液，之后将所述洗脱液旋干至无醇度，得浸膏，将所述浸膏置于50℃减压干燥至干，得中提物；
S3，黄酮类化合物单体的初分离：将步骤S2得到的中提物干法上样于聚酰胺柱，分别用10％，30％，50％，70％，95％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，同时采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物；其中，聚酰胺柱分离纯化过程的条件如下：以聚酰胺为填料的自填装内径为35mm，柱长为200mm，粒度为75～150μm，添料量为60g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：4g/次；梯度洗脱条件：0-5min：B相0；5-20min：B相10％；20-40min：B相30％；40-60min：B相50％；60-80min：B相70％；80-100min：B相95％，所述馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别为所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的混合组分；
S4，黄酮类化合物单体的终分离：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，分别用10％，10～80％，80～100％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体，其中，反相中压快速制备色谱分离纯化过程的条件为：以C18为填料的自填装内径为30mm，柱长为100mm，粒度为15μm，添料量为20g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：甲醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：1g/次；梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-20min：B相10％；20-60min：B相10％-80％；60-75min：B相80％-100％；75-85min：B相100％；按照该条件多次重复进样，所述orientin和isoorientin分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅰ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-2和vicenin-2分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅱ使用10％乙醇洗脱液和80～100％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-1和vicenin-1分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅲ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分。
实施例3
一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，包括步骤：
S1，样品提取：将三叶青地上部分粉碎后，得三叶青地上部分粗粉；称取2Kg三叶青地上部分粗粉，置于50L提取罐中，提取条件为：60％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1：12g/mL，提取温度为70℃，提取时间为2.2h，然后重复乙醇回流提取三次，过滤，合并滤液，得提取液；提取液在-0.05～-0.1MPa真空中，50℃浓缩至无醇度后，获得粗提物；
S2，总黄酮的提取：将步骤S1得到的粗提物加纯化水配置成总黄酮含量为5.0mg/mL的混悬液，并调节混悬液的pH值为6.0；将混悬液离心，取上清液，以4.0BV/h的上样流速上样于大孔吸附树脂柱上；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1:15，且上柱量中，三叶青地上部分粗粉与树脂量的比例为1:1；吸附完毕后静置过夜，然后按4.0BV/h的洗脱速度进行洗脱，先用蒸馏水洗至无混浊后，再用6BV浓度为50％的乙醇洗脱，收集0.5～2.0BV区间的洗脱液，之后将所述洗脱液旋干至无醇度，得浸膏，将所述浸膏置于50℃减压干燥至干，得中提物；
S3，黄酮类化合物单体的初分离：将步骤S2得到的中提物干法上样于聚酰胺柱，分别用10％，30％，50％，70％，95％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，同时采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物；其中，聚酰胺柱分离纯化过程的条件如下：以聚酰胺为填料的自填装内径为35mm，柱长为200mm，粒度为75～150μm，添料量为60g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：4g/次；梯度洗脱条件：0-5min：B相0；5-20min：B相10％；20-40min：B相30％；40-60min：B相50％；60-80min：B相70％；80-100min：B相95％，所述馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别为所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的混合组分；
S4，黄酮类化合物单体的终分离：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，分别用10％，10～80％，80～100％(体积百分比)乙醇进行梯度洗脱，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体，其中，反相中压快速制备色谱分离纯化过程的条件为：以C18为填料的自填装内径为30mm，柱长为100mm，粒度为15μm，添料量为20g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：甲醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：1g/次；梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-20min：B相10％；20-60min：B相10％-80％；60-75min：B相80％-100％；75-85min：B相100％；按照该条件多次重复进样，所述orientin和isoorientin分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅰ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-2和vicenin-2分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅱ使用10％乙醇洗脱液和80～100％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-1和vicenin-1分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅲ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分。
虽然本发明披露如上，但本发明并非限定于此。在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。任何本领域技术人员，在不脱离本发明的精神和范围内，均可作各种更动与修改，因此本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。

Claims (8)

1.一种三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，包括步骤：
S1，样品提取：利用乙醇对三叶青地上部分进行回流提取，获得三叶青地上部分粗提物；
S2，总黄酮的提取：粗提物加纯化水悬浮后，加入到大孔吸附树脂层析柱里进行吸附，之后分别用水和乙醇洗脱，收集洗脱液，将洗脱液干燥，得中提物；
S3，黄酮类化合物单体的初分离：采用聚酰胺柱对步骤S2所得中提物进行分离纯化，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物；
S4，黄酮类化合物单体的终分离：将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得多种黄酮化合物单体;
其中，所述步骤S3中黄酮类化合物单体的初分离过程包括：
将步骤S2得到的中提物干法上样于聚酰胺柱，分别用体积百分比为10％，30％，50％，70％，95％的乙醇进行梯度洗脱，同时采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ三组混合物；
所述步骤S4中黄酮类化合物单体的终分离过程包括：
将步骤S3得到的馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别用反相中压快速制备色谱进一步分离纯化，分别用10％，10～80％，80～100％乙醇进行梯度洗脱，并采用UV检测器在220nm和254nm进行检测，分别收集有吸收的组分物质，之后采用高效液相色谱法对各馏分收集物进行分析检测，减压浓缩，真空干燥，获得orientin、isoorientin、lucenin-2、vicenin-2、lucenin-1和vicenin-1共6种黄酮化合物单体。
2.根据权利要求1所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，所述步骤S1中样品提取过程包括：
S11，三叶青地上部分预处理：将三叶青地上部分粉碎后，得三叶青地上部分粗粉；
S12，乙醇回流提取：称取一定量的三叶青地上部分粗粉，置于提取罐中进行乙醇回流提取，其中，乙醇回流提取条件为：采用50～70％乙醇水溶液为提取溶剂，料液比为1：10～15g/mL，提取温度为60～80℃，提取时间为2～3h；重复上述乙醇回流提取三次，过滤后，合并滤液，得提取液；
S13，减压浓缩：提取液在-0.05～-0.1MPa真空中，40～80℃浓缩至无醇度后，获得粗提物。
3.根据权利要求1所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，所述步骤S2中总黄酮的提取过程包括：
将步骤S1得到的粗提物加纯化水配置成总黄酮含量为2.0～5.0mg/mL的混悬液，并调节混悬液的pH值为4.0～6.0；将混悬液离心，取上清液，以3.0～4.0BV/h的上样流速上样于大孔吸附树脂柱上；所述大孔吸附树脂柱的径高比为1:8～1:15，且上柱量中，三叶青地上部分粗粉与树脂量的比例为3:1～1:1；吸附完毕后静置过夜，然后按1.0～4.0BV/h的洗脱速度进行洗脱，先用蒸馏水洗至无混浊后，再用3～6BV浓度为50％的乙醇洗脱，收集0.5～2.0BV区间的洗脱液，之后将所述洗脱液旋干至无醇度，得浸膏，将所述浸膏置于50℃减压干燥至干，得中提物。
4.根据权利要求3所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂柱为AB-8或D101型大孔吸附树脂层析柱。
5.根据权利要求1所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程的条件如下：
以聚酰胺为填料的自填装内径为35mm，柱长为200mm，粒度为75～150μm，添料量为60g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：乙醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：4g/次；梯度洗脱条件：0-5min：B相0；5-20min：B相10％；20-40min：B相30％；40-60min：B相50％；60-80min：B相70％；80-100min：B相95％。
6.根据权利要求1所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，所述馏分-Ⅰ、馏分-Ⅱ和馏分-Ⅲ分别为所述步骤S3中聚酰胺柱分离纯化过程使用30％乙醇洗脱液、50％乙醇洗脱液和70％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的混合组分。
7.根据权利要求1所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程的条件如下：
以C18为填料的自填装内径为30mm，柱长为100mm，粒度为15μm，添料量为20g的色谱柱；流动相：A相：水；B相：甲醇；流速：30mL/min；压力上限：200psi；干法上样量：1g/次；梯度洗脱条件：0-10min：B相0；10-20min：B相10％；20-60min：B相10％-80％；60-75min：B相80％-100％；75-85min：B相100％；按照该条件多次重复进样。
8.根据权利要求1所述的三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法，其特征在于，所述orientin和isoorientin分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅰ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-2和vicenin-2分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅱ使用10％乙醇洗脱液和80～100％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分；所述lucenin-1和vicenin-1分别为所述步骤S4中反相中压快速制备色谱分离纯化过程馏分-Ⅲ使用10％乙醇洗脱液和10～80％乙醇洗脱液洗脱、减压浓缩，真空干燥后得到的组分。
CN202111502347.2A 2021-12-10 2021-12-10 三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法 Active CN113956310B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111502347.2A CN113956310B (zh) 2021-12-10 2021-12-10 三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202111502347.2A CN113956310B (zh) 2021-12-10 2021-12-10 三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113956310A CN113956310A (zh) 2022-01-21
CN113956310B true CN113956310B (zh) 2023-03-24

Family

ID=79473179

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111502347.2A Active CN113956310B (zh) 2021-12-10 2021-12-10 三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113956310B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104435401B (zh) * 2014-11-13 2018-06-08 福建中医药大学 三叶青地上部分总黄酮的提纯方法
CN106913610B (zh) * 2017-03-28 2020-11-03 曹岗 三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途
CN110818668B (zh) * 2019-11-06 2021-04-27 江西省科学院应用化学研究所 从平卧菊三七茎中分离纯化高纯度黄酮苷类化合物的方法
CN112684096B (zh) * 2021-01-29 2023-04-28 浙江省立同德医院 一种基于聚酰胺薄层色谱鉴别三叶青药材的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN113956310A (zh) 2022-01-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ni et al. Column chromatographic extraction and preparation of cordycepin from Cordyceps militaris waster medium
CN103833803B (zh) 超声波提取和树脂纯化多穗柯叶中甜味剂的方法
CN102976909B (zh) 一种从生姜中提取纯化6-姜酚的方法
CN104435401A (zh) 三叶青地上部分总黄酮的提纯方法
CN102219814A (zh) 一种从杜仲籽粕中提取桃叶珊瑚苷的方法
CN110526952B (zh) 一种粗糙凤尾蕨中提取黄酮苷的制备方法
CN101289480A (zh) 一种甘草苷的分离制备方法
CN108689849B (zh) 山楂叶粗提物中同时分离黄酮类和绿原酸类化合物的方法
CN113956310B (zh) 三叶青地上部分黄酮碳苷单体的分离提取方法
CN106674312A (zh) 高纯度单体獐牙菜苷系列成分的分离纯化方法
CN104072456A (zh) 一种高纯度丹酚酸b的制备方法
CN101496845B (zh) 一种白花蛇舌草提取物及其分离制备方法
CN108440619B (zh) 山茱萸提取物制备马钱子苷的方法
CN102250183B (zh) 一种以人参花蕾为原材料制备高纯度人参皂苷Re的方法
CN102389456A (zh) 一种提取蓝萼香茶菜总二萜或蓝萼甲素的方法
CN107556275B (zh) 一种白术内酯ⅱ的制备方法
CN108558970B (zh) 山茱萸提取物同时制备高纯度莫诺苷和马钱子苷的方法
CN110240585B (zh) 一种沉香四醇的制备方法
CN108341845B (zh) 山茱萸提取物制备莫诺苷的方法
CN103110689A (zh) 一种从黄芪中提取黄芪皂苷的新方法
CN112851673A (zh) 钩藤中四种生物碱组分的富集纯化方法
CN108623649B (zh) 一种从三七叶总皂苷中分离纯化三七皂苷Fc的方法
CN111233629A (zh) 一种从中药材白术中制备化合物bz-92的方法
CN111388608A (zh) 一种凤尾竹提取物及其制备方法和应用
CN102391181A (zh) 一种从银扁担中提取紫堇块茎碱的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant