CN106913610B - 三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途 - Google Patents

三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及治理风湿关节炎药物技术领域，公开了三叶青总黄酮在治疗风湿关节炎药物中的用途，药物是治理风湿关节炎的药物，三叶青总黄酮的制备工艺：取10‑30kg三叶青块茎粗粉，加入体积百分比为65‑75％的乙醇回流提取3次，合并提取液减压回收乙醇，静置过夜后过滤，滤液用石油醚萃取3次脱脂后，过聚酰胺柱，依次用水、体积百分比为90‑95％乙醇洗脱，将体积百分比为90‑95％的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干，即得三叶青总黄酮。现有治疗风湿性关节炎较好的中药有雷公藤多苷，但雷公藤多苷治具有很多毒副作用，如对女性卵巢和男性精子损伤较大，限制了临床的应用。本发明中治疗风湿关节炎的三叶青总黄酮，治疗风湿性关节炎效果好，无毒副作用。

Description

三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途
技术领域
本发明涉及治理风湿关节炎药物技术领域，尤其涉及了三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途。
背景技术
风湿性关节炎是一种常见的急性或慢性结缔组织炎症，可反复发作并累及心脏。临床以关节和肌肉游走性酸楚、重著、疼痛为特征，属变态反应性疾病，是风湿热的主要表现之一，多以急性发热及关节疼痛起病。风湿性关节炎可侵犯心脏，引起风湿性心脏病，并有发热、皮下结节和皮疹等表现。风湿性关节炎是一种复杂的疾病，且病因多种多样而又易发作。西医认为该病的病因是一种以关节和关节周围组织的非感染性炎症为主的全身性疾病，很多学者认为与遗传因素、自身免疫反应有关，但确切的病因病理至今尚未明确。中医认为该病属中医“痹证”“痿症”等病范畴。多因感受风寒湿邪，气血痹阻，或体虚失养，邪气痹阻，筋骨劳伤，气滞血瘀而致。目前西医上对风湿性关节病的治疗主要采用非甾体类抗炎药及免疫抑制剂进行治疗，严重者需加用激素类药物进行治疗，但这些药物的副作用较大，价格昂贵且治疗效果也不显著，治愈后容易反复发作，使患者长期反复遭受病痛的折磨。中医以其特有的成本低廉，安全无副作用等优点而成为治疗风湿性关节炎的研究热点。目前市场上治疗风湿性关节炎的中药也比较多，但普遍存在疗效不显著，治疗周期长，治疗后易反复发作等缺点。因而市场上现在急需一种能标本兼治、疗效好、安全无副作用的治疗风湿关节炎的药物。
发明内容
本发明针对现有技术的缺点，提供了一种三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决：
三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，药物是治理风湿关节炎的药物，三叶青总黄酮的制备工艺：取10-30kg三叶青块茎粗粉，加入体积百分比为65-75%的乙醇回流提取 3次，合并提取液减压回收乙醇，静置过夜后过滤，滤液用石油醚萃取 3次脱脂后，过聚酰胺柱，依次用水、体积百分比为90-95%乙醇洗脱，将体积百分比为90-95%的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干，即得三叶青总黄酮。
作为优选，取20kg三叶青块茎粗粉。
作为优选，加入体积百分比为70%的乙醇回流提取 3次。
作为优选，过聚酰胺柱，依次用水、95%乙醇洗脱，将体积百分比为95%的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干。
作为优选，包括以下步骤，
A. 大鼠类风湿关节炎模型建立：建立胶原诱导性关节炎动物模型：先将l0 mg牛II型胶原完全溶于浓度为0.05 mol/L的乙酸中，配制成2mg/mL的牛II型胶原溶液，再将2mg/mL的牛II型胶原溶液与完全弗氏佐剂充分混匀，配制成浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液，每只大鼠尾根部皮下注射相同体积的浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液，体积为0.1-0.4mL；
7天后用浓度为2 mg/mL的牛II型胶原溶液与不完全弗氏佐剂用同样方法配制成1mg/mL牛II型胶原溶液，以每只大鼠尾根部皮下注射相同体积的1mg/mL牛II型胶原溶液，1mg/mL牛II型胶原溶液的体积为0.05-0.3mL，再次免疫；
B. 一周后，选取造摸成功的大鼠，给予三叶青总黄酮。
作为优选，步骤A中大鼠类风湿关节炎模型建立：建立胶原诱导性关节炎动物模型：先将l0 mg牛II型胶原完全溶于5 mL浓度为0.05 mol/L的乙酸中，配制成2mg/mL的牛II型胶原溶液，再将5mL的2mg/mL的牛II型胶原溶液与5 mL完全弗氏佐剂充分混匀，配制成1mg/mL的牛II型胶原溶液，每只大鼠尾根部皮下注射0.2 mL的浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液；
7天后用5mL浓度为2 mg/mL的牛II型胶原溶液与5mL不完全弗氏佐剂用同样方法配制成1mg/mL牛II型胶原溶液，以每只大鼠尾根部皮下注射0.1mL的1mg/mL牛II型胶原溶液，再次免疫。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：现有治疗风湿性关节炎较好的中药有雷公藤多苷，但雷公藤多苷治具有很多毒副作用，如对女性卵巢和男性精子损伤较大，限制了临床的应用。本发明中治疗风湿关节炎的三叶青总黄酮，治疗风湿性关节炎效果好，无毒副作用。
附图说明
图1是三叶青总黄酮对大鼠关节炎评分的影响结果图。
图2是关节病理HE染色图谱。其中，a为正常组，b为CIA组，c为米氟米特组，d为三叶青总黄酮低剂量组，e为三叶青总黄酮高剂量组。
图3 是关键蛋白表达图谱。
具体实施方式
下面结合附图与实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，药物是治理风湿关节炎的药物，三叶青总黄酮的制备工艺：取20kg三叶青块茎粗粉，加入体积百分比为70%的乙醇回流提取 3次，合并提取液减压回收乙醇，静置过夜后过滤，滤液用石油醚萃取 3次脱脂后，过聚酰胺柱，依次用水、体积百分比为95%乙醇洗脱，将体积百分比为95%的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干，即得三叶青总黄酮。
以上提到的三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，包括以下步骤，
A. 大鼠类风湿关节炎模型建立：建立胶原诱导性关节炎动物模型：先将l0 mg牛II型胶原完全溶于浓度为0.05 mol/L的乙酸中，配制成2mg/mL的牛II型胶原溶液，再将2mg/mL的牛II型胶原溶液与完全弗氏佐剂充分混匀，配制成浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液，每只大鼠尾根部皮下注射相同体积的浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液，体积为0.1-0.4mL；
7天后用浓度为2 mg/mL的牛II型胶原溶液与不完全弗氏佐剂用同样方法配制成1mg/mL牛II型胶原溶液，以每只大鼠尾根部皮下注射相同体积的1mg/mL牛II型胶原溶液，1mg/mL牛II型胶原溶液的体积为0.05-0.3mL，再次免疫；
B. 一周后，选取造摸成功的大鼠，给予三叶青总黄酮，根据给予三叶青总黄酮的量分成三个组：低剂量组（60mg/Kg）、中剂量组（120mg/Kg）、高剂量组（240mg/Kg）。
1. 三叶青总黄酮对CIA大鼠关节炎症评分的影响：
如图1所示中比较了模型组与来氟米特及三叶青总黄酮处理组大鼠关节炎情况，可得在饲养30天时，药物处理组大鼠关节炎症状明显缓解，且三叶青总黄酮组大鼠的关节炎评分明显低于来氟米特组大鼠。说明三叶青总黄酮对关节炎的缓解作用要好于来氟米特。
2.三叶青总黄酮对CIA大鼠CIA大鼠踝关节组织病理变化的影响（如图2所示）：
HE 染色显示，对照组大鼠后足踝关节结构正常，各关节软骨表面光滑，软骨基质和软骨细胞无进行性变，未见血管翳和关节周围软骨异常；与正常组比较，模型组可见关节腔内明显的炎性细胞浸润，滑膜组织内伴有淋巴细胞浸润，骨中伴有炎性细胞的浸润侵蚀，踝关节各关节软骨的基质及软骨细胞出现不同程度的退行性病变，严重处软骨剥脱，关节软骨表面不平整，出现血管翳；三叶青总黄酮高剂量处理组及来氟米特组大鼠关节结构较模型组有所改善，炎症细胞侵润及血管翳等均少于模型组大鼠。
3. 三叶青总黄酮对CIA大鼠血清细胞因子的影响
表1 三叶青总黄酮对大鼠血清细胞因子表达的影响
Group TNF-α(pg/mL) IL-1β(pg/mL) IL-17A(pg/mL) IL-6(pg/mL)
Control 10.8555±2.4905 16.8695±3.2737 3.2240±0.1523 3.9670±0.2348
CIA 75.3678±10.9804<sup>#</sup> 95.3790±2.1336<sup>#</sup> 26.7776±1.0014<sup>#</sup> 56.8692±2.1459<sup>#</sup>
Leflunomide 35.3762±4.6735<sup>**</sup> 65.4896±1.2649<sup>**</sup> 10.2602±1.2995<sup>**</sup> 19.3040±2.5477<sup>**</sup>
RTTFs-L 68.5734±1.5156 74.3854±1.0393** 19.0574±0.4494** 36.5006±0.7894<sup>**</sup>
RTTFs-M 52.7870±2.5398<sup>**</sup> 69.5042±1.7437** 14.7426±0.7698<sup>**</sup> 28.0910±1.5089<sup>**</sup>
RTTFs-H 29.9212±1.7572** 60.5046±2.6771<sup>**</sup> 8.6672±0.5809<sup>**</sup> 16.1818±1.1387**
注：##P < 0.01 vs.Control；*P<0.05, **P< 0.01 vs. CIA.
由表1中结果可知，与正常对照组相比，模型组大鼠血清细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A）表达量显著增加，与模型组大鼠细胞相比，来氟米特及三叶青总黄酮处理组明显抑制血清细胞因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17A）的表达，且三叶青总黄酮的剂量越大对血清细胞因子表达的抑制越明显。
4. 三叶青总黄酮对大鼠滑膜中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的影响
表2 三叶青总黄酮对大鼠滑膜组织中相关蛋白表达的影响
Control CIA Leflunomide RTTFs-L RTTFs-M RTTFs-H
JAK2 13614.60±349.39 42696.40±359.34<sup>##</sup> 18432.60±386.73<sup>**</sup> 27420.20±374.87** 26493.00±270.55** 18609.80±384.63**
p-JAK2 6134.60±1341.11 22403.00±136.79<sup>##</sup> 7654.00±34.31<sup>**</sup> 14591.20±362.85<sup>**</sup> 14338.00±335.99<sup>**</sup> 6433.60±25.55<sup>**</sup>
STAT3 17598.40±359.47 43651.80±232.28<sup>##</sup> 20150.20±201.26<sup>**</sup> 30353.2±315.08<sup>**</sup> 28329.6±243.96<sup>**</sup> 19478.20±372.70<sup>**</sup>
p-STAT3 2340.40±19.43 9233.80±29.07<sup>##</sup> 4863.40±42.42<sup>**</sup> 6953.90±1329.39<sup>**</sup> 5831.80±38.98<sup>**</sup> 5044.00±36.20<sup>**</sup>
注：##P < 0.01 vs.Control；*P<0.05, **P< 0.01 vs. CIA.
由图3和表2中数据可得，与正常对照组相比，模型组显著增加了JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白的表达，与模型组相比较，三叶青总黄酮处理组抑制了JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3的表达，且随着剂量的增加，抑制作用越明显。说明三叶青总黄酮高剂量对大鼠脾脏细胞中JAK2、p-JAK2、STAT3表达的抑制作用十分显著。
实施例2
三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，药物是治理风湿关节炎的药物，三叶青总黄酮的制备工艺：取10kg三叶青块茎粗粉，加入体积百分比为65%的乙醇回流提取 3次，合并提取液减压回收乙醇，静置过夜后过滤，滤液用石油醚萃取 3次脱脂后，过聚酰胺柱，依次用水、体积百分比为90%乙醇洗脱，将体积百分比为90%的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干，即得三叶青总黄酮。
以上提到的三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，包括以下步骤，
A. 大鼠类风湿关节炎模型建立：建立胶原诱导性关节炎动物模型：先将l0 mg牛II型胶原完全溶于浓度为0.05 mol/L的乙酸中，配制成2mg/mL的牛II型胶原溶液，再将2mg/mL的牛II型胶原溶液与完全弗氏佐剂充分混匀，配制成浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液，每只大鼠尾根部皮下注射相同体积的浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液，体积为0.1-0.4mL；
7天后用浓度为2 mg/mL的牛II型胶原溶液与不完全弗氏佐剂用同样方法配制成1mg/mL牛II型胶原溶液，以每只大鼠尾根部皮下注射相同体积的1mg/mL牛II型胶原溶液，1mg/mL牛II型胶原溶液的体积为0.05-0.3mL，再次免疫；
B. 一周后，选取造摸成功的大鼠，给予三叶青总黄酮。
实施例3
三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，药物是治理风湿关节炎的药物，三叶青总黄酮的制备工艺：取30kg三叶青块茎粗粉，加入体积百分比为75%的乙醇回流提取 3次，合并提取液减压回收乙醇，静置过夜后过滤，滤液用石油醚萃取 3次脱脂后，过聚酰胺柱，依次用水、体积百分比为92%乙醇洗脱，将体积百分比为92%的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干，即得三叶青总黄酮。
以上提到的三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，包括以下步骤，
A. 大鼠类风湿关节炎模型建立：建立胶原诱导性关节炎动物模型：先将l0 mg牛II型胶原完全溶于5 mL浓度为0.05 mol/L的乙酸中，配制成2mg/mL的牛II型胶原溶液，再将5mL的2mg/mL的牛II型胶原溶液与5 mL完全弗氏佐剂充分混匀，配制成1mg/mL的牛II型胶原溶液，每只大鼠尾根部皮下注射0.2 mL的浓度为1mg/mL的牛II型胶原溶液；
7天后用5mL浓度为2 mg/mL的牛II型胶原溶液与5mL不完全弗氏佐剂用同样方法配制成1mg/mL牛II型胶原溶液，以每只大鼠尾根部皮下注射0.1mL的1mg/mL牛II型胶原溶液，再次免疫；
B. 一周后，选取造摸成功的大鼠，给予三叶青总黄酮，根据给予三叶青总黄酮的量分成三个组：低剂量组（60mg/Kg）、中剂量组（120mg/Kg）、高剂量组（240mg/Kg）。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (2)

1.三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，其特征在于：药物是治理风湿关节炎的药物，三叶青总黄酮的制备工艺：取10-30kg三叶青块茎粗粉，加入体积百分比为65-75%的乙醇回流提取 3次，合并提取液减压回收乙醇，静置过夜后过滤，滤液用石油醚萃取 3次脱脂后，过聚酰胺柱，依次用水、体积百分比为90-95%乙醇洗脱，将体积百分比为90-95%的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干，即得三叶青总黄酮；加入体积百分比为70%的乙醇回流提取 3次；过聚酰胺柱，依次用水、95%乙醇洗脱，将体积百分比为95%的乙醇洗脱液减压回收乙醇至干。
2.根据权利要求1所述的三叶青总黄酮在制备治疗风湿关节炎药物中的用途，其特征在于：取20kg三叶青块茎粗粉。
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