CN111297886A - 龙胆多糖在制备预防或治疗肝损伤疾病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药技术领域，公开了龙胆（Gentiana scabra Bunge）中多糖类成分保肝活性的应用及其制备方法。龙胆多糖能够显著降低免疫性肝损伤小鼠的肝功能指标、炎症因子指标以及氧化应激指标，具有显著的保肝活性，在预防或治疗免疫性肝损伤疾病中具有广泛的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及龙胆多糖的提取精制及其在预防、治疗免疫性肝损伤疾病中的应用。
背景技术
自身免疫性肝炎主要是由于自身免疫系统异常而导致的一种肝脏疾病，是一种以肝脏急、慢性炎症，以淋巴细胞浸润、肝细胞坏死为主要表现的自身免疫性疾病。随着自身免疫性肝损伤病程的进展，急、慢性肝病若不及时治疗，则可能发展为肝纤维、肝功能衰竭、肝硬化等一系列难治性肝病，对人们的身体健康及生活质量造成严重的影响。
龙胆（Gentiana scabra Bunge）为龙胆科植物条叶龙胆、龙胆、三花龙胆或滇龙胆干燥根及根茎，史载于《神农本草经》具有清肝胆湿热、泻下焦热火之功。据报道其多糖成分具有抗肿瘤、免疫调节、降血脂、抗氧化等药理作用。
刀豆蛋白A（Concanavalin A,ConA）是一种强促有丝分裂的植物凝集素。ConA诱导的急性免疫性肝损伤模型是一种经典的辅助型T细胞介导的肝细胞损伤模型，它能够较好地模拟自身免疫性肝炎的发病机制及病理变化。本研究建立了ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤模型，以龙胆多糖干预后的小鼠肝功能指标、血清细胞因子及氧化应激指标评价龙胆多糖的保肝药效。
发明内容
本发明目的在于提供龙胆多糖的制备方法以及在自身免疫性肝损伤疾病中的应用。
基于上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
龙胆多糖在制备预防或治疗肝损伤疾病药物中的应用。
龙胆多糖的制备方法为：将龙胆药材粉碎，甲醇回流脱脂后进行80℃水提、80%乙醇醇沉，得到的粗多糖经sevege法除蛋白、弃去沉淀得到精制的龙胆多糖。
具体步骤为：
1.将龙胆药材粉碎、60℃下用甲醇回流脱脂。
2.脱脂后的龙胆多糖进行80℃水提，每次3小时，共提取2次，将提取液合并减压浓缩。
3.将浓缩后的提取液以80%乙醇醇沉，离心，弃去上清液。
4.将醇沉后的粗多糖以sevege法除蛋白,离心，弃去沉淀，共5次，直至无沉淀。
5.将除蛋白后的龙胆多糖以硫酸苯酚法检测多糖的含量。
龙胆多糖通过降低血清的中丙氨酸转氨酶（ALT）值与天冬氨酸转氨酶（AST）值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
龙胆多糖通过降低血清炎症因子（IL-6）值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
龙胆多糖通过升高肝脏的中氧化应激指标SOD值和MDA值、降低GSH-PX值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
龙胆多糖的剂量为每日2-3次，每次0.6-2.7g。
龙胆多糖的剂量为每日3次，每次1.5g。
龙胆多糖的制剂，其特征在于所述的龙胆多糖加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
一种药物组合物，龙胆多糖作为活性成分或者是药用载体。
为证实上述龙胆多糖的保肝活性，本发明采用了ConA诱导小鼠免疫性肝损伤模型，评价其对肝损伤的预防和治疗作用，实验结果表明：龙胆多糖能够显著降低肝功能指标、血清炎症因子以及改善氧化应激指标。
本发明的优点在于：
1.本方法能够快速高效去除蛋白质等杂质成分、短时间内获得较高含量的多糖活性成分。
2.龙胆多糖具有显著的治疗急性免疫性肝损伤疾病的效果，可用于研发低毒高效保肝药的制备。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案及实验结果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
所有图中NC为正常对照组、MC为模型对照组、PC为联苯双酯阳性对照组、GL为龙胆多糖低剂量组300mg/kg、GH为龙胆多糖高剂量组900mg/kg；与NC组相比，“#”表示P＜0.05，“##”表示P＜0.01，“###”表示 P<0.001；与MC组相比，“*”表示 P<0.05，“**”表示P＜0.01，“***”表示 P<0.001；
图1显示了龙胆多糖对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤模型肝功能指标（a:AST、b:ALT）的干预效果；
图2显示了龙胆多糖对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤模型血清炎症因子指标（IL-6）的干预效果；
图3显示了龙胆多糖对ConA诱导的小鼠免疫性肝损伤模型氧化应激指标（a:SOD、b:MDA、c:GSH-PX）的干预效果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的详细介绍，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明所作的任何变换，均属于本发明的保护范围。
龙胆多糖在制备预防或治疗肝损伤疾病药物中的应用。
龙胆多糖的制备方法为：将龙胆药材粉碎，甲醇回流脱脂后进行80℃水提、80%乙醇醇沉，得到的粗多糖经sevege法除蛋白、弃去沉淀得到精制的龙胆多糖。
具体步骤为：
1.将龙胆药材粉碎、60℃下用甲醇回流脱脂。
2.脱脂后的龙胆多糖进行80℃水提，每次3小时，共提取2次，将提取液合并减压浓缩。
3.将浓缩后的提取液以80%乙醇醇沉，离心，弃去上清液。
4.将醇沉后的粗多糖以sevege法除蛋白,离心，弃去沉淀，共5次，直至无沉淀。
5.将除蛋白后的龙胆多糖以硫酸苯酚法检测多糖的含量。
龙胆多糖通过降低血清的中丙氨酸转氨酶（ALT）值与天冬氨酸转氨酶（AST）值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
龙胆多糖通过降低血清炎症因子（IL-6）值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
龙胆多糖通过升高肝脏的中氧化应激指标SOD值和MDA值、降低GSH-PX值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
龙胆多糖的剂量为每日2-3次，每次0.6-2.7g。
龙胆多糖的剂量为每日3次，每次1.5g。
龙胆多糖的制剂，其特征在于所述的龙胆多糖加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
一种药物组合物，龙胆多糖作为活性成分或者是药用载体。
实施例1
龙胆粗多糖的制备：
将龙胆药材粉碎后，60℃下用甲醇回流脱脂3次。将脱脂后的龙胆药材以80℃进行热水煮提，每次提取3小时，共提取两次，合并提取液，减压浓缩。将浓缩后的浸膏以80%乙醇醇沉，离心，弃去上清液，得到龙胆粗多糖。
实施例2
龙胆多糖的精制：
将得到的龙胆多糖用蒸馏水重溶，以sevege法除蛋白，离心，弃去沉淀，共5次，直至离心再无沉淀。最后将除蛋白后的多糖减压浓缩，冷冻干燥，最终得到精制的龙胆多糖。
实施例3
龙胆多糖的保肝药效研究
龙胆多糖由实施例2制备而得。
1.动物分组、造模及给药方法
将ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、阳性组（联苯双酯150mg/kg）、龙胆多糖低剂量组（300mg/kg）、龙胆多糖高剂量组（900mg/kg），每组10只。灌胃给药，正常组及模型组给予生理盐水，其它组给予相应剂量药物，1天1次，连续7天。末次给药30min后，模型组及各给药组均静脉注射12mg/kgConA制备免疫性肝损伤模型，正常组静脉注射相等体积的生理盐水。禁食不禁水7h后，眼眶采血处死动物，收集肝脏。
2.血清中肝功能指标检测
眼球取血于1.5mL离心管中，常温离心4500r/min离心10min，留取上清液。按丙氨酸转氨酶（ALT）和天冬氨酸转氨酶（AST）试剂盒操作步骤处理，使用酶标仪测定血清中ALT、AST吸光度值（OD值）。通过查找标准曲线，根据OD值计算相应酶活力值。
实验结果见图1，与正常组相比，模型组AST、ALT值均显著升高，与模型组相比，阳性药及不同剂量的给药组AST、ALT均显著降低，且呈现剂量依赖性。结果表明龙胆多糖对免疫性肝损伤小鼠具有保护作用。
3.血清中炎症因子指标检测
采用ELISA法对血清中IL-6进行检测。按照IL-6试剂盒操作步骤处理，使用酶标仪测定血清中IL-6吸光度（OD）值，通过查找标准曲线进行计算。
实验结果见图2，与正常组相比模型组IL-6显著升高，与模型组相比，不同剂量给药组显著降低，提示龙胆多糖可以减轻肝损伤小鼠的炎症反应。
4.肝脏组织中氧化应激指标检测
将小鼠肝组织进行匀浆，按照肝组织重量：生理盐水=1:9制作10%组织匀浆液待测。按照SOD、MDA、GSH-PX试剂盒操作步骤处理，使用酶标仪测定肝组织中SOD、MDA、GSH-PX的吸光度值，通过相应的公式进行计算。
实验结果见图3，与正常组相比，模型组SOD、GSH-PX显著降低，与模型组相比，各给药组SOD、GSH-PX均显著升高；与正常组相比模型组MDA显著升高，与模型组相比，各给药组均显著降低，结果表明龙胆多糖可以改善肝损伤引起的氧化应激反应。
综上可以说明，龙胆多糖具有显著治疗免疫性肝损伤疾病的活性，且具有毒副作用小的特点，在预防或治疗免疫性肝损伤药物的研发中具有重要意义。
在本发明所述的小鼠急性免疫性肝损伤试验中，龙胆多糖的剂量为300-900mg/kg/d。换算为人（以成人体重60kg计算）剂量为1.8-5.4g/d。考虑到人的体重有不同，及各种其他病理情况，推荐剂量为每日2-3次，每次0.6-2.7g。最常用的剂量为每日3次，每次1.5g。
Claims (9)
1.龙胆多糖在制备预防或治疗肝损伤疾病药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，龙胆多糖的制备方法为：将龙胆药材粉碎，甲醇回流脱脂后进行80℃水提、80%乙醇醇沉，得到的粗多糖经sevege法除蛋白、弃去沉淀得到精制的龙胆多糖。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：龙胆多糖通过降低血清的中丙氨酸转氨酶（ALT）值与天冬氨酸转氨酶（AST）值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于：龙胆多糖通过降低血清炎症因子（IL-6）值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于：龙胆多糖通过升高肝脏的中氧化应激指标SOD值和MDA值、降低GSH-PX值来达到预防或治疗肝损伤疾病的作用。
6.如权利要求1所述的应用，其特征在于：龙胆多糖的剂量为每日2-3次，每次0.6-2.7g。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，龙胆多糖的剂量为每日3次，每次1.5g。
8.一种权利要求1-7任一所述的龙胆多糖的制剂，其特征在于所述的龙胆多糖加入药学上可接受的辅料制备成片剂、硬胶囊、软胶囊、散剂、丸剂、颗粒剂。
9.一种药物组合物，其特征是包含权利要求1-8所述的龙胆多糖作为活性成分或者是药用载体。
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 孙建之等: "龙胆酒制前后保肝作用研究", 《中华中医药学刊》 * |
| 张北雪等: "酒龙胆中总多糖和总环烯醚萜苷保肝作用的研究", 《中南药学》 * |
| 王金宏: "龙胆中植物多糖保肝、降血脂及免疫调节作用的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 * |
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