CN103570654A - 一种紫草酸的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从丹参中大量制备紫草酸单体(98％)的方法，属于中药活性组分的分离纯化技术领域。该方法按照以下步骤进行：首先，采用水或者乙醇溶液提取丹参药材中的丹酚酸B、紫草酸等组分；第二，调节提取液pH至碱性，使丹参提取液中的丹酚酸B水解，生成紫草酸，增加其中紫草酸的含量；最后，采用大孔吸附树脂分离纯化紫草酸，得到纯度超过98％的紫草酸溶液，溶液进一步经过干燥得到紫草酸单体粉末。最终紫草酸的纯度超过98％，得率超过1％(以丹参干药材计算)。该工艺操作简单，易于放大，适用于紫草酸的大量工业制备。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药活性组分的分离纯化方法，尤其涉及一种从丹参中分离纯化紫草酸的方法。
背景技术
丹参是一种临床常用的中药，广泛应用于心脑血管疾病、肝病、肾病、神经系统疾病和肿瘤的预防与治疗。由于中药的传统的使用方法以水煎煮为主，所以丹参中水溶性活性组分吸引了大家的广泛关注。丹参中水溶性活性组分包括丹酚酸B、紫草酸、迷迭香酸、丹参素等(附图1)。
紫草酸是丹参中主要的活性组分之一，文献报道，其具有抗氧化、抗炎、抗HIV活性，可以应用于心脑血管疾病、肝病、肾病、神经系统疾病的治疗和预防作用。另外，紫草酸具有抗HIV病毒整合酶的活性，是一种无毒的HIV病毒抑制剂，可以用于抗AIDS药物的构效关系、结构修饰寻找活性更高化合物等研究。
紫草酸具有极强的水溶性，加上丹参水溶性组分结构相似，性质相近，其纯品的分离纯化及其困难，目前尚没有其纯品的大量制备方法报道。中国专利CN102993143报道了一种采用制备高效液相色谱制备紫草酸单体的方法，可以制备纯度达98％的紫草酸样品。然而，高效液相色谱法只适用于少量样品的制备，且其制备成本高，难以放大至工业生产，无法满足紫草酸做为药物开发的需求。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种简单、高效、成本低廉、环境友好的紫草酸制备方法，用来满足紫草酸的新药开发研究，尤其是做为注射制剂原料药的生产工艺。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种简单、高效、成本低廉、环境友好的紫草酸制备方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种制备紫草酸的方法，包括以下步骤：
步骤一、制备丹参提取液
向丹参药材中加入提取剂，经过加热提取后，提取液经过滤浓缩，得丹参提取液，所述提取剂为水、甲醇水溶液或乙醇水溶液；
步骤二、制备紫草酸粗品溶液
将丹参提取液调节至pH10-14，在10-50℃范围内搅拌反应2-10小时，得到紫草酸粗品溶液；
步骤三、大孔吸附树脂分离纯化紫草酸
调节紫草酸粗品溶液至pH6-10，经过大孔吸附树脂柱吸附后，采用水洗脱，分步收集洗脱液，HPLC检测，合并纯度超过98％的紫草酸溶液。
步骤四、浓缩干燥
纯度超过98％的紫草酸溶液经过浓缩干燥，得到紫草酸粉末。
优选的，步骤一提取溶剂为水时，提取温度为80-100℃。
提取溶剂为乙醇或甲醇溶液时，提取温度为50-70℃。提取液的固液分离，采用过滤、离心或者抽滤的方法。优选提取剂为体积分数40-70％的乙醇水溶液。
优选的，步骤二中pH调节，选用盐酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等常见的非氧化性酸、碱。
优选地，步骤二中还包括将所得的紫草酸粗品溶液调pH为2-4，减压浓缩至粗品溶液原体积的10-10％。更优选的，所得的紫草酸粗品溶液调pH为2-3，减压浓缩温度为40-60℃。将紫草酸粗品溶液减压浓缩，有利于在后续分离纯化步骤中获得较好的分离度，但是申请人发现，直接将紫草酸粗品溶液进行减压浓缩处理，浓缩后的紫草酸粗品溶液中，杂质含量有很大提高且紫草酸含量有所下降，而将pH调为2-4后，再进行减压浓缩，则紫草酸粗品溶液中的杂质含量没有明显的变化，紫草酸的含量也没有明显的变化。
优选的，步骤三中的大孔吸附树脂，选用聚苯乙烯-聚乙烯苯为骨架的树脂，吸附后采用水洗脱树脂。更优选的，所述大孔吸附树脂型号为Hz816、XAD-4或者大孔吸附树脂微球1号。
优选的，步骤三中pH调节至6-8，选用盐酸、醋酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙等常见的非氧化性酸、碱。申请人发现，步骤三中对pH的调节，对与本发明中制备高纯度的紫草酸非常重要，如果浓缩液上柱pH低于6或者高于8，则紫草酸的收率会显著降低。
优选的，步骤三中树脂柱的高径比为3-15：1。
优选的，步骤三中水洗脱体积为柱体积的3-10倍。
步骤四中纯度超过98％的紫草酸样品溶液，经过浓缩干燥，得到紫草酸粉末。浓缩方法可以是常压、低压真空浓缩、喷雾干燥法、冷冻干燥法中单一的方法或者是这几种方法的混合。
进一步地，本发明步骤二中，采用两步法制备紫草酸粗品溶液，步骤如下：
a)将丹参提取液pH调节至12-14，30-50℃搅拌反应1-2小时；
b)步骤a)中所得溶液pH调节至10-11在10-30℃范围内搅拌反应2-5小时，
得到紫草酸粗品溶液。
优选地，步骤a)中将丹参提取液pH调节至13，35-40℃搅拌反应1-2小时。
优选地，步骤b)中将a)中所得溶液pH调节至10.5在10-25℃范围内搅拌反
应2-5小时。
申请人在实验过程中偶然的发现，上述两步调节pH分段加热的方法，能够显著增加紫草酸粗品溶液中的紫草酸含量，与仅调节一次pH至10-14反应2-10小时相比，所得的紫草酸粗品溶液中的紫草酸含量能够提高30-50％，且紫草酸粗品溶液中杂质含量明显减少，非常有利于后续的分离纯化。
本发明克服了已有紫草酸纯化方法中产物纯度低、产量小、生产工艺复杂、生产成本高等缺点，最终紫草酸的纯度超过98％，得率超过1％(以丹参干药材计算)。
本发明采用的HPLC检测条件为：安捷伦高效液相色谱仪(HP1100)，采用C18色谱柱，流动相组成为(乙腈：1％甲酸水溶液＝30：70)，流动相流速0.8mL／min，检测波长286nm，进样体积5μL。
附图说明
图1是实施例1中丹参水提取物的HPLC图谱；1为丹酚酸B，2为紫草酸，3为迷迭香酸。
图2是实施例1中经碱处理后的丹参提取液的HPLC图谱；1为丹酚酸B，2为紫草酸，4为原紫草酸，5为丹参素。
图3是实施例1中制备的紫草酸的HPLC图谱，紫草酸纯度99.3％。
图4是实施例1制备的紫草酸和紫草酸对照品共进样的HPLC图谱。
图5是实施例20中经碱处理后的丹参提取液的HPLC图谱；1为丹酚酸B，2为紫草酸，4为原紫草酸，5为丹参素。
图6是实施例20制备的紫草酸和紫草酸对照品共进样的HPLC图谱。
本发明中紫草酸对照品购自上海同田生物技术有限公司，其他试剂及材料均可从市售渠道购买获得。
具体实施方式
实施例1
步骤一、取丹参药材100g，加入1L70％的乙醇水溶液，70℃提取1小时，过滤，滤渣以相同的方法再提取一次，合并两次滤液。
步骤二、以氢氧化钠调节滤液至pH12，于室温下搅拌5小时，得紫草酸粗品溶液，HPLC检测图谱如图2所示。将提取液调节pH至2，旋转蒸发仪50℃减压浓缩至原体积的10-30％mL。将pH调至2能够降低样品中的杂质含量。
步骤三、500mL大孔吸附树脂微球1号(上海华震科技有限公司)，装柱，高径比5：1。调节浓缩液至pH6.5，过柱吸附，8倍柱体积水洗脱树脂柱，分步收集，HPLC检测。
步骤四、合并紫草酸纯度超过98％的样品溶液，冷冻干燥，得纯度99.3％的紫草酸1.82g。
实施例2
将实施例1步骤一中提取丹参药材的溶剂换为水，其余同实施例1，最终得到纯度98.2％的紫草酸1.21g。
实施例3
将实施例1步骤一中提取丹参药材的溶剂换为10％的乙醇，其余同实施例1，最终得到98.5％的紫草酸1.41g
实施例4
将实施例1步骤一中提取丹参药材的溶剂换为90％的乙醇，其余同实施例1，最终得到99.0％的紫草酸1.55g。
实施例5
将实施例1步骤一中提取丹参药材的溶剂换为10％的甲醇，其余同实施例1，最终得到98.3％的紫草酸1.05g。
实施例6
将实施例1步骤一中提取丹参药材的溶剂换为90％的甲醇，其余同实施例1，最终得到98.8％的紫草酸1.33g。
实施例7
将实施例1步骤一中提取丹参药材的温度换为50℃，其余同实施例1，最终得到98.5％的紫草酸1.28g。
实施例8
将实施例1步骤二中丹参提取液pH换为pH10，其余同实施例1，最终得到98.9％的紫草酸1.03g。
实施例9
将实施例1步骤二中丹参提取液pH换为pH14，其余同实施例1，最终得到99.3％的紫草酸1.43g
实施例10
将实施例1步骤二中丹参提取液碱促反应时间换为2小时，其余同实施例1，最终得到99.0％的紫草酸1.02g。
实施例11
将实施例1步骤二中丹参提取液碱促反应时间换为10小时，其余同实施例1，最终得到98.8％的紫草酸1.72g。
实施例12
将实施例1步骤二中丹参提取液碱促反应温度换为10℃，其余同实施例1，最终得到99.1％的紫草酸1.15g。
实施例13
将实施例1步骤二中丹参提取液碱促反应温度换为50℃，其余同实施例1，最终得到98.3％的紫草酸1.55g。
实施例14
将实施例1步骤三中的树脂换成Hz816(上海华震科技有限公司)，其余同实施例1，最终得到98.1％的紫草酸1.23g。
实施例15
将实施例1步骤三中的树脂换成XAD-4(上海罗门哈斯化工有限公司)，其余同实施例1，最终得到98.8％的紫草酸1.53g。
实施例16
将实施例1步骤三中树脂高径比调节至3：1，其余同实施例1，最终得到98.0％的紫草酸1.55g。
实施例17
将实施例1步骤三中树脂高径比调节至15：1，其余同实施例1，最终得到99.2％的紫草酸1.8g。
实施例18
将实施例1步骤三中水洗脱体积调节至3倍柱体积，其余同实施例1，最终得到98.2％的紫草酸1.02g。
实施例19
将实施例1步骤三中水洗脱体积调节至3倍柱体积，其余同实施例1，最终得到98.7％的紫草酸1.52g。
实施例20
将实施例1步骤二改为采用两步法制备紫草酸粗品溶液，步骤如下：
a)将丹参提取液pH调节至13，40℃搅拌反应1小时；
b)步骤a)中所得溶液pH调节至10.5在20℃搅拌反应5小时，得到紫草酸粗
品溶液，HPLC检测图谱如图5所示。
其余同实施例1，最终得到99.5％的紫草酸2.56g。
实施例21
将实施例1步骤二改为采用两步法制备紫草酸粗品溶液，步骤如下：
a)将丹参提取液pH调节至14，30℃搅拌反应2小时；
b)步骤a)中所得溶液pH调节至10在25℃搅拌反应3小时，得到紫草酸粗品
溶液。
其余同实施例1，最终得到99.2％的紫草酸2.32g。
实施例22
将实施例1步骤二改为采用两步法制备紫草酸粗品溶液，步骤如下：
a)将丹参提取液pH调节至12，50℃搅拌反应1.5小时；
b)步骤a)中所得溶液pH调节至11在15℃搅拌反应4小时，得到紫草酸粗品
溶液。
其余同实施例1，最终得到98.6％的紫草酸1.96g。
对比例1
将实施例1步骤二中所得紫草酸粗品溶液，不调pH，直接进行减压浓缩，其余同实施例1，最终得到97.8％的紫草酸1.14g。
对比例2
将实施例1步骤二中所得紫草酸粗品溶液，不进行减压浓缩处理，直接进行步骤三，其余同实施例1，最终得到98.2％的紫草酸1.32g。
对比例3
将实施例1步骤三中的紫草酸浓缩液，调节pH4过柱吸附，其余同实施例1，最终得到98.3％的紫草酸0.93g。
对比例4
将实施例1步骤三中的紫草酸浓缩液，调节pH11过柱吸附，其余同实施例1，最终得到97.6％的紫草酸0.87g。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种紫草酸的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤一、制备丹参提取液
向丹参药材中加入所述提取剂，经过加热提取后，提取液经过滤浓缩，得丹参提取液，所述提取剂为水、甲醇水溶液或乙醇水溶液；
步骤二、制备紫草酸粗品溶液
将丹参提取液pH调节至10-14，在10-50℃范围内搅拌反应2-10小时，得到紫草酸粗品溶液；
步骤三、大孔吸附树脂分离纯化紫草酸
调节紫草酸粗品溶液至pH5-10，经过大孔吸附树脂吸附后，采用水洗脱，分步收集洗脱液，HPLC检测，合并纯度超过98％的紫草酸溶液。
步骤四、浓缩干燥
纯度超过98％的紫草酸溶液经过浓缩干燥，得到紫草酸粉末。
2.如权利要求1所述的方法，其中步骤一中提取剂为40-70％(v／v)的乙醇水或甲醇水溶液，提取温度为50-100℃。
3.如权利要求1所述的方法，其中步骤二中还包括将所得的紫草酸粗品溶液调pH为2-4，减压浓缩至粗品溶液原体积的10-10％。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤二中采用两步法制备紫草酸粗品溶液，步骤如下：
a)将丹参提取液pH调节至12-14，30-50℃搅拌反应1-2小时；
b)步骤a)中所得溶液pH调节至10-11在10-30℃范围内搅拌反应2-5小时，
得到紫草酸粗品溶液。
5.如权利要求4所述的方法，其中，步骤a)中将丹参提取液pH调节至13，35-40℃搅拌反应1-2小时。
6.如权利要求4所述的方法，其中，步骤b)中将步骤a)中所得溶液pH调节至10.5在10-25℃范围内搅拌反应2-5小时。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤三采用的大孔吸附树脂是以聚苯乙烯-聚乙烯苯为骨架的大孔吸附树脂。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述大孔吸附树脂为型号为Hz816、XAD-4或者大孔吸附树脂微球1号。
9.如权利要求6所述的方法，其中步骤三中柱层析时，色谱柱的高径比为3-15：1。
10.如权利要求6所述的方法，其中步骤三水洗脱中水的用量为3-10倍柱体积。
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