CN114874275A

CN114874275A - 脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备

Info

Publication number: CN114874275A
Application number: CN202111118515.8A
Authority: CN
Inventors: 邱蔚然; 邱志云; 周洁; 陈修足; 王军; 欧伶
Original assignee: Shanghai Weizhixing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Weizhixing Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-24
Filing date: 2021-09-24
Publication date: 2022-08-09
Anticipated expiration: 2041-09-24
Also published as: CN114874275B

Abstract

本发明公开了一种脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备，采用实时在线检测和智能化控制对DNA酶解液进行层析分离，通过核酸蛋白检测仪的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有脱氧核苷酸流出，从而了解这一过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器分析，控制分段洗脱过程和收集5’‑dCMP、5’‑dAMP、5’‑dTMP和5’‑dGMP四种脱氧核苷酸溶液；本发明不仅实现了整个层析分离全流程无人化操作，过程控制更加精密便捷，省时省力，减少人为误差，避免生产受到损失，而且能得到纯度≥99％的单一组分的脱氧核苷酸，并将单一组分的脱氧核苷酸按一定比例复配成脱氧核苷酸钠原料药。

Description

脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备

技术领域

本发明属于单脱氧核苷酸制备领域，尤其涉及一种脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备，特别涉及一种基于智能控制的脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备。

背景技术

脱氧核苷酸钠是一种生化药物，它具有提高造血功能修复DNA等重要生理功能，故常作为癌症放疗、化疗的白血球或造血功能降低的治疗药物；其中脱氧核苷酸钠是由DNA(一般是鱼白中提取)通过酶解，并经过分离纯化获得的混合物。脱氧核苷酸钠作为一种多组分的生化药物含有的5’-脱氧腺苷酸(dAMP)，5’-脱氧胞苷酸(dCMP)，5’-脱氧鸟苷酸(dGMP)，5’-脱氧胸苷酸(dTMP)等4种组分。由于脱氧核苷酸钠并未作为单一组分分离纯化，这样会含有较多杂质，例如部颁标准提升到国家标准时，其含量只有75％，另外由于工艺收率高低，或原料来源不同， 4种组分的比例也不一致。现代药物法规要求多组分生化药需要提纯成单一组分再进行复配，特别是作为注射剂的原料药更加迫切需要提升其标准和纯度；因而脱氧核苷酸钠作为一种多组分的生化药物不符合现代生物制药法规的要求，同时此种生化药也存在一定的安全隐患。

脱氧核苷酸钠原料药的制备方法如下：

文献1：《动物生化制药学》人民卫生出版社1981年2月中陈述的方法是将 DNA酶解液经过阴离子交换柱后，用0.2mol/L的盐酸溶液洗脱，收集pH＝2.5～0.5 的部分，再过活性炭柱收集，氨乙醇洗脱、浓缩、结晶、干燥，最后获得含量75％的4种混合脱氧核苷酸钠产品。

文献2：中国专利CN 102382150 B是对文献1的改进，其采取2根阴离子交换住串联方法，分别用纯水和0.01mol/L醋酸溶液洗柱，直至流出液pH＝3.5为止，此时可将柱上脱氧核苷等杂质洗尽，然后再用0.5％NaCl-0.01mol/L醋酸溶液将4种脱氧核苷酸洗至活性炭柱富集脱盐得到纯度较高且4种组分有一定比例的原料药。

上述技术中，文献1所得到的产品含量仅到达75％，显然不符合药品的要求，文献2虽然有较大改进，但没有获得单一脱氧核苷酸产品，并且4种脱氧核苷酸不是精确的比例，不符合现代生物制药法规中多组分生化药物的要求。

鉴于此，亟待研发一种脱氧核苷酸的分离方法，不仅能将DNA酶解液分离成单一组分，而且能得到高纯度的脱氧核苷酸，并由此获得由单一脱氧核苷酸复配制备的具有精确比例的脱氧核苷酸钠原料药。

发明内容

针对现有技术中存在的上述缺陷，本发明的目的是提供一种脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备，采用实时在线检测和智能化控制对DNA酶解液进行层析分离，通过核酸蛋白检测仪(下称检测仪)的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有脱氧核苷酸流出，从而了解这一过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器分析，控制洗脱过程和收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP 和5’-dGMP四种脱氧核苷酸溶液；本发明不仅实现了整个层析分离全流程无人化操作，过程控制更加精密便捷，省时省力，减少人为误差，避免生产受到损失，而且能得到高纯度的单一组分的脱氧核苷酸，并按一定比例将单一脱氧核苷酸复配成具有精确比例的脱氧核苷酸钠原料药。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面提供了一种脱氧核苷酸层析分离方法，包括以下步骤：

(1)上样，将过滤后的DNA酶解液依次通过由1根阳离子交换树脂柱和多根阴离子交换树脂柱串联的柱层析系统，并采用核酸蛋白检测仪对阴离子交换树脂柱的流出液进行实时在线检测；

(2)水洗，上样结束后，采用去离子水或纯化水对所述柱层析系统进行水洗，去除所述柱层析系统中的残留杂质；

(3)分段洗脱，断开所述阳离子交换树脂柱，对串联的多根阴离子交换树脂柱进行分段洗脱，同时采用HPLC检测器对最后一根阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测，并分别收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGMP四种脱氧核苷酸；

(4)浓缩，将收集的5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP分别通入对应的炭柱中，然后采用氨乙醇溶液分别对每根炭柱洗脱，再分别收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP 溶液，并分别将四种脱氧核苷酸进行结晶、过滤、干燥。

优选地，所述步骤(1)中：

所述柱层析系统中，所述阴离子交换树脂柱至少采用2根；和/或

所述阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱均采用盐酸或NaOH进行再生处理，所述阳离子交换树脂柱为Na型阳离子交换树脂柱，所述阴离子交换树脂柱为 Cl型阴离子交换树脂柱；和/或

所述上样过程中，所述DNA酶解液的流速为120～180L/h；和/或

所述上样过程中，当所述核酸蛋白检测仪检测到最后一根阴离子交换树脂柱流出液中A260＜1时排废，反之则上样结束。

优选地，所述步骤(2)中：

所述水洗过程中，所述去离子水或纯化水的体积为所述阴离子交换树脂柱的柱体积的5～10倍；和/或

所述水洗过程中，采用核酸蛋白检测仪对所述柱层析系统的流出液进行检测，当柱层析系统流出液中A260＜1时，排废；反之则收集流出液。

优选地，所述步骤(3)中：

所述分段洗脱过程中，采用0.01mol/L甲酸洗脱5’-dCMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dCMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dCMP溶液；采用0.1mol/L甲酸洗脱 5’-dAMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dAMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dAMP 溶液；采用0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠洗脱5’-dTMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dTMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dTMP溶液；采用质量百分浓度为3％的 NaCl洗脱5’-dGMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dGMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dGMP溶液。

优选地，所述步骤(4)中：

所述炭柱洗脱过程中，采用氨乙醇溶液或NaOH-乙醇溶液作为洗脱液进行洗脱；和/或

所述炭柱洗脱过程中，采用HPLC检测器对炭柱流出液进行定时检测，当炭柱流出液检测出5’-dCMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dCMP溶液；当炭柱流出液检测出5’-dAMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dAMP溶液；当炭柱流出液检测出5’-dTMP 且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dTMP溶液。

优选地，所述炭柱洗脱过程中，所述氨乙醇溶液采用氨水、95％乙醇和水配比而成，所述氨水、95％乙醇和水的体积比为5：50：45。

本发明第二方面提供了一种脱氧核苷酸钠原料药的制备，原料包括本发明第一方面所述的脱氧核苷酸层析分离方法制备的5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGM；

所述5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGM的含量均≥98％。

优选地，所述原料包括按重量百分比计的如下组分：

本发明的有益效果如下：

1、本发明的脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备，采用实时在线检测和智能化控制对DNA酶解液进行层析分离，通过核酸蛋白检测仪(下称检测仪)的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有脱氧核苷酸流出，从而了解这一过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器分析，控制洗脱过程和收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGMP四种脱氧核苷酸溶液；

2、本发明的脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备，不仅实现了整个层析分离全流程无人化操作，过程控制更加精密便捷，省时省力，减少人为误差，避免生产受到损失，而且能得到高纯度的单一组分的脱氧核苷酸，并按一定比例将单一脱氧核苷酸复配成具有精确比例的脱氧核苷酸钠原料药。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明第一方面提供的脱氧核苷酸层析分离方法所用的智能层析分离系统的结构示意图；

图2为本发明第一方面提供的脱氧核苷酸层析分离方法中所用的智能层析分离系统的逻辑控制图；

图3为本发明第一方面提供的脱氧核苷酸层析分离方法的流程控制图。

具体实施方式

为了能更好地理解本发明的上述技术方案，下面结合实施例进一步说明本发明的技术方案。

结合图1所示，本发明所提供的脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备，整体构想如下：结合在线检测和智能化控制技术，将DNA酶解液分离成高纯度单一组分的脱氧核苷酸，然后将4种脱氧核苷酸按比例配比，制成冻干粉注射液或压制成口服片；具体而言：DNA酶解后，生成5’-dAMP、5’-dCMP、5’-dGMP、 5’-dTMP四种脱氧核苷酸，其摩尔转化率约85-90％左右，其中含有少量核苷、碱基以及未降解的多核苷酸；DNA酶解液经过滤、微滤等除去颗粒性杂质；然后再通过阳离子交换树脂柱除去阳离子杂质，比如带正电荷的钙、镁离子以及带正电荷大分子酶蛋白等；然后再串联上样通过阴离子交换树脂柱将4种脱氧核苷酸交换吸附，此过程中采用核酸蛋白检测仪112对阴离子交换树脂柱流出液实时在线监测，通过流出液中A260值，来判断是否有脱氧核苷酸流出，从而判断上样是否结束；上样结束后，用去离子或纯化水淋洗、去除残留柱上不吸附的杂质；随后断开阳离子交换树脂柱，采用不同的洗脱液对阴离子交换树脂柱进行洗脱，在洗脱过程中，同时采用HPLC控制器对阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测，并根据流出液中脱氧核苷酸的类型，以及根据对应脱氧核苷酸的浓度分别收集，其中某脱氧核苷酸的浓度C＝某脱氧核苷酸的实测图谱峰面积×某脱氧核苷酸的标准浓度/某脱氧核苷酸的标准图谱峰面积；由于5’-dAMP、5’-dCMP、5’-dTMP的浓度低、含盐量大，可在酸性条件下采用炭柱吸附，再用氨乙醇或NaOH-乙醇溶液洗脱，同时也采用HPLC 控制器对阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测，并根据流出液中脱氧核苷酸的类型，并根据对应脱氧核苷酸的浓度分别收集，之后再将5’-dAMP、5’-dCMP、 5’-dTMP分别结晶、过滤、干燥，最终制得含量≥98％的结晶产品；而5’-dGMP的洗脱液由于浓度较高，因此无需浓缩，可直接进行结晶、过滤、干燥得到含量≥98％的5’-dGMP结晶产品。上述整个上样、水洗、分段洗脱过程周期约8天(24*8＝192 小时)完成；且层析分离过程应该连续而不要中途停顿，否则会影响层析分离效果；因此整个过程应当基于智能化控制。

基于上述构思，结合图1所示，本发明的脱氧核苷酸层析分离方法中所使用的智能化层析系统，包括柱层析系统、上样机构、水洗机构、洗脱机构、阴柱收集器、检测机构、控制系统114、3个炭柱单元以及炭柱洗脱罐111；

结合图1所示，柱层析系统包括由1根阳离子交换树脂柱(比如A1)与多根阴离子交换树脂柱(阴离子交换树脂柱至少设置两根，比如A2、A3)串联而成，图1中柱层析系统以1根阳离子交换树脂柱A1与2根阴离子交换树脂柱A2、A3 串联而成；其中阳离子交换树脂柱A1与第一根阴离子交换树脂柱A2的进液口分别与上样机构、水洗机构、洗脱机构连通，且阳离子交换树脂柱A1与上样机构、水洗机构、洗脱机构之间设有单向阀，参见图1中的单向阀11、12；阳离子交换树脂柱A1与多根阴离子交换树脂柱(A2、A3)之间不设置单向阀；最后一根阴离子交换树脂柱(如图1中A3)的出液口分别与阴柱收集器、检测机构连通，其上分别设有单向阀13、14；其中阳离子交换树脂柱A1和阴离子交换树脂柱A2、A3内的树脂均采用盐酸或NaOH进行再生处理，阳离子交换树脂柱A1为Na型阳离子交换树脂柱，阴离子交换树脂柱A2、A3为Cl型阴离子交换树脂柱。

结合图1所示，上样机构包括上样罐101以及上样泵和上样阀1；水洗机构包括水洗罐102以及水洗泵和水洗阀2；洗脱机构包括第一洗脱罐103、第二洗脱罐 104、第三洗脱罐105、第四洗脱罐106以及洗脱泵和洗脱阀3、4、5、6。

结合图1所示，检测机构用于对阴离子交换树脂柱A3、3个炭柱单元的流出液进行检测，并将监测信息传递给控制系统114；检测机构包括核酸蛋白检测仪112 和HPLC检测器113；其中核酸蛋白检测仪112用于实时在线检测最后一个根阴离子交换树脂柱A3流出液的A260数值，从而判断上样和水洗过程中是否有脱氧核苷酸流出，便于了解上样和水洗过程是否正常进行；HPLC检测器113则用于定时检测洗脱过程中最后一个根阴离子交换树脂柱流出液的紫外吸收光谱，并根据吸收峰判断流出液中脱氧核苷酸的类型以及计算浓度；另外HPLC检测器113还分别与3 个炭柱单元的出液口连通，用于检测每个炭柱A4、A5、A6洗脱时流出液中脱氧核苷酸的浓度。

结合图1所示，阴柱收集器包括排污罐、第一收集罐107、第二收集罐108、第三收集罐109、第四收集罐110，分别用于收集废水、5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP、5’-dGMP四种脱氧核苷酸溶液，其中排污罐、第一收集罐107、第二收集罐108、第三收集罐109、第四收集罐110的进口管道上分别设有如图1所示的单向阀15、 7、8、9、10；

结合图1所示，每个炭柱单元包括1根炭柱与炭柱出口端连通的炭柱收集罐； 3个炭柱单元分别与第一收集罐107、第二收集罐108以及第三收集罐109对应；其中，炭柱A4的进口端与第一收集罐107连通，炭柱A4与第一收集罐107之间设有单向阀16；炭柱A5的进口端与第二收集罐108连通，炭柱A5与第二收集罐108 之间设有单向阀17；炭柱A6的进口端与第三收集罐109连通，炭柱A6与第三收集罐109之间设有单向阀18；炭柱洗脱罐111分别与炭柱A4、A5、A6的进口端连通，且炭柱洗脱罐111与炭柱A4、A5、A6之间的管道上分别设有单向阀19、20、 21；炭柱A4、A5、A6的出口端分别与炭柱收集罐116、117、118连接；炭柱A4、 A5、A6的出口端分别与HPLC检测器113连接，便于HPLC检测器113检测炭柱 A4、A5、A6流出液中脱氧核苷酸的种类及浓度。

结合图1、图2所示，控制系统114接收检测机构的检测信息，并根据检测信息生成水洗指令、阴柱洗脱指令、阴柱收集指令、炭柱上样指令、炭柱洗脱指令，并输出信号至上样机构、水洗机构、洗脱机构、阴柱收集器、3个炭柱单元和炭柱洗脱罐。控制系统114包括阳柱上样控制器、水洗控制器、阴柱洗脱控制器、阴柱收集控制器、炭柱上样控制器、炭柱洗脱控制器；其中阳柱上样控制器根据控制系统114内设的阳柱上样指令，控制上样阀1的启闭，从而控制上样的开始与结束，上样指令包括上样时间、上样量、流速以及上样阀1的启闭等；水洗控制器根据控制系统114的水洗指令控制水洗阀2的启闭，从而控制水洗的开始与结束，水洗指令包括水洗阀2的启闭，去离子水或纯化水的用量、流速等；阴柱洗脱控制器根据控制系统114的阴柱洗脱指令控制水洗阀3、4、5、6的启闭，从而控制阴柱洗脱的开始与结束，阴柱洗脱指令包括洗脱液的种类、浓度、使用量、流速，水洗阀3、 4、5、6的启闭等；阴柱收集控制器根据控制系统114的阴柱收集指令控制单向阀 15、7、8、9、10的启闭，从而控制阴柱收集的开始与结束，阴柱收集指令包括单向阀15、7、8、9、10的启闭等；炭柱上样控制器根据控制系统114的炭柱上样指令控制单向阀16、17、18的启闭，从而控制炭柱上样的开始与结束；炭柱洗脱控制器根据控制系统114的炭柱洗脱指令控制单向阀19、20、21的启闭，从而控制3 个炭柱A4、A5、A6洗脱的开始与结束，炭柱洗脱指令包括洗脱液的用量、流速、单向阀19、20、21的启闭等。

结合图1所示，为了便于远程控制，该智能层析分离系统还包括监控系统115，该监控系统115114包括用于监控DNA酶解液的层析分离过程的摄像装置以及与摄像装置连接的显示器。

结合图1、2、3所示，本发明提供了一种脱氧核苷酸层析分离方法，包括以下步骤：

(1)上样，将过滤后的DNA酶解液依次通过由1根阳离子交换树脂柱和多根阴离子交换树脂柱串联的柱层析系统，并采用核酸蛋白检测仪112对阴离子交换树脂柱的流出液进行实时在线检测；

具体过程为：结合图1所示的智能层析分离系统，控制系统114控制上样阀1、 11、13打开，过滤后的DNA酶解液依次通过1根阳离子交换树脂柱A1和多根阴离子交换树脂柱(阴离子交换树脂柱至少采用2根，此处以2根阴离子交换树脂柱 A2、A3为例)串联的柱层析系统，其中带正电荷的钙、镁离子，以及带正电荷大分子酶蛋白等被吸附在阳离子交换树脂柱A1上，DNA酶解液中的4种脱氧核苷酸被吸附在阴离子交换树脂柱上，同时在上样过程中采用核酸蛋白检测仪112对阴离子交换树脂柱A3的流出液进行实时在线监测，当流出液中A260＜1时，则表明阴离子交换树脂柱A2、A3未吸附饱和，可继续上样以及排废，反之，则表明阴离子交换树脂柱A2、A3已经饱和，上样结束；其中阳离子交换树脂柱A1和阴离子交换树脂柱A2、A3均采用盐酸或NaOH进行再生处理，阳离子交换树脂柱A1为Na 型阳离子交换树脂柱，阴离子交换树脂柱A2、A3为Cl型阴离子交换树脂柱；上样过程中，DNA酶解液的流速为120～180L/h；

(2)水洗，上样结束后，采用去离子水或纯化水对柱层析系统进行水洗，去除柱层析系统中的残留杂质；

具体过程如下：上样结束后，控制系统114控制水洗机构进行水洗，采用5～ 10倍阴离子交换树脂柱(A2或A3)柱体积的去离子水或纯化水对柱层析系统进行水洗后自动停止，同时采用核酸蛋白检测仪112对最后一根阴离子交换树脂柱A3 的流出液进行实时在线检测，当A260＜1时，则认为流出液中没有脱氧核苷酸流出，可以正常排废；反之则认为流出液中有脱氧核苷酸流出，此时需要收集流出液，并将信号传递给控制系统114，进行调整上样量或增加树脂等。

(3)分段洗脱，断开阳离子交换树脂柱，对串联的多根阴离子交换树脂柱进行洗脱，同时采用HPLC检测器113对最后一根阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测，并分别收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGMP四种脱氧核苷酸；

具体过程如下：水洗结束后，控制系统114关闭单向阀2、11，打开水洗阀3、单向阀12、14，断开阳离子交换树脂柱A1，并控制洗脱机构对阴离子交换树脂柱 A2、A3进行分段洗脱，同时采用HPLC检测器113对阴离子交换树脂柱A3的流出液进行在线定时检测：

采用0.01mol/L的甲酸洗脱5’-dCMP，收集浓度≥0.5g/L的5’-dCMP，即HPLC 检测器113对阴离子交换树脂柱A3的流出液，当HPLC检测器113检测出5’-dCMP，且控制系统114根据计算公式计算5’-dCMP浓度≥0.5g/L时，开始收集5’-dCMP，当5’-dCMP的浓度＜0.5g/L时则5’-dCMP洗脱结束；

采用0.1mol/L甲酸洗脱5’-dAMP，收集浓度≥0.5g/L的5’-dAMP，即HPLC 检测器113对阴离子交换树脂柱A3的流出液，当HPLC检测器113检测出5’-dAMP，且控制系统114根据计算公式计算5’-dAMP浓度≥0.5g/L时，开始收集5’-dAMP，当5’-dAMP的浓度＜0.5g/L时则5’-dAMP洗脱结束；

采用0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠洗脱5’-dTMP，收集浓度≥0.5g/L的 5’-dTMP，即HPLC检测器113对阴离子交换树脂柱A3的流出液，当HPLC检测器 113检测出5’-dTMP，且控制系统114根据计算公式计算5’-dTMP浓度≥0.5g/L时，开始收集5’-dTMP，当5’-dTMP的浓度＜0.5g/L时则5’-dTMP洗脱结束；

采用质量百分浓度为3％的NaCl洗脱5’-dGMP，收集浓度≥0.5g/L的5’-dGMP，即HPLC检测器113对阴离子交换树脂柱A3的流出液，当HPLC检测器113检测出5’-dGMP，且控制系统114根据计算公式计算5’-dGMP浓度≥0.5g/L时，开始收集5’-dGMP，当5’-dGMP的浓度＜0.5g/L时则5’-dGMP洗脱结束；

(4)浓缩，将收集的5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP分别通入对应的炭柱中，然后分别对每根炭柱洗脱，再分别收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP溶液，并分别将四种脱氧核苷酸进行结晶、过滤、干燥。

具体过程如下：控制系统114控制单向阀16打开，将第一洗脱罐107内的 5’-dCMP上样至炭柱A4中，此过程中5’-dCMP吸附在炭柱A4内，然后启动炭柱洗脱罐对炭柱A4进行洗脱，洗脱液采用氨乙醇溶液或NaOH-乙醇溶液，洗脱液的用量为炭柱体积的5-10倍，其中氨乙醇溶液采用氨水、95％乙醇和水配比而成，质量百分浓度25-28％的氨水、95％乙醇和水的体积比为5：50:45；NaOH-乙醇溶液采用NaOH和乙醇配比而成，浓度为1mol/L的NaOH、95％乙醇和水的体积比为 10:20:70；在炭柱洗脱过程中，采用HPLC检测器113在线检测，当流出液中检测出5’-dCMP且浓度≥0.5g/L时收集5’-dCMP溶液；同理，将第二洗脱罐108内的 5’-dAMP上样至炭柱A5中，并对炭柱A5进行洗脱，收集浓度≥0.5g/L的5’-dAMP 溶液；将第三洗脱罐109内的5’-dTMP上样至炭柱A6中，并对炭柱A6进行洗脱，收集浓度≥0.5g/L的5’-dTMP溶液；

然后分别将5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP、5’-dGMP四种脱氧核苷酸进行结晶、过滤、干燥：即分别采用2-3倍的95％的乙醇结晶、过滤、真空干燥分别得到含量＞98％的5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP、5’-dGMP四种结晶产品。

本发明提供一种脱氧核苷酸钠原料药，原料采用上述脱氧核苷酸层析分离方法制备的5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGM产品，上述4种脱氧核苷酸的标准为：白色结晶粉末，含量≥98％，有关物质(其他核苷酸、核苷等)小≤0.5％；

脱氧核苷酸钠原料药的原料包括按重量百分比计的如下组分：

按上述比例混合后，加入双蒸水，溶解后成20％(w/w)的溶液，在洁净车间 (区)内，通过0.22μ微滤除菌，然后采用5mol/L的NaOH调节pH至7.5，之后冷冻干燥成冻干粉，它可作为针剂，或片剂，或胶囊等固体制剂原料。

下面结合具体的例子对本发明的脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备进一步介绍。采用图1所示的智能层析系统对DNA酶解液进行层析分离。

实施例1

本实施例中采用图1所示的智能层析系统对DNA酶解液进行层析分离，具体过程如下：

(1)酶解

在1m³反应釜中加入16kg DNA和900L纯化水加热溶解，在72℃时加入1.1kg 磷酸二酯酶(酶活力6000单位)，72℃(±1)保温3小时，取样测定反应转化率≥70％。然后升温85-90℃，保温10分钟，杀灭酶活性，通冷凝水冷却至40℃以下，用6mol/L NaOH调pH至10，用6m²板框过滤，再微滤，超滤得到DNA酶解液。

在DNA酶解液中加入3倍去离子水稀释后装入上样罐101中；在A1柱中装入120L732阳离子交换树脂，在A2、A3柱中装入120L 201*7阴离子交换树脂，树脂用1.2-1.5MOL/L盐酸或NaOH再生后使用，A1中的阳离子交换树脂为Na型， A2、A3阴离子交换树脂为Cl型。

(2)上样、水洗、洗脱

上样罐中的DNA酶解液依次通过阳离子交换树脂柱A1和阴离子交换树脂柱 A2、A3，控制流速120-180L/h，上样时核酸蛋白检测器检测阴离子交换树脂柱A3 柱流出液A260,其中A260应＜1，超过此值说明柱已交换吸附达到饱和状态，应停止上样。上样结束，控制系统自动切换阀门，关闭上样阀1，开启水洗阀2，水洗体积600L-1200L，流速120-180L/h。水洗结束，控制系统自动切换阀门，关闭水洗阀2，开启洗脱阀3、单向阀14，采用0.01mol/L甲酸作为洗脱液对阴离子交换树脂柱A2、A3进行洗脱，流速为60L/h，控制系统根据HPLC检测器的信号换算，当检测出5’-dCMP且浓度C≥0.5g/L时，单向阀15关闭，单向阀7开启收集5’-dCMP 洗脱液，当5’-dCMP的浓度C＜0.5g/L时5’-dCMP的洗脱结束；同理，控制系统关闭单向阀7，打开单向阀15、洗脱阀4，采用0.1mol/L甲酸对5’-dAMP进行洗脱，同时采用HPLC检测器进行检测，当检测出5’-dAMP且浓度C≥0.5g/L时，关闭单向阀15，打开单向阀8，收集5’-dAMP洗脱液，当5’-dAMP的浓度C＜0.5g/L时 5’-dAMP的洗脱结束；控制系统关闭单向阀8，打开单向阀15、洗脱阀5，采用 0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠对5’-dTMP进行洗脱，同时采用HPLC检测器进行检测，当检测出5’-dTMP且浓度C≥0.5g/L时，关闭单向阀15，打开单向阀9，收集5’-dTMP洗脱液，当5’-dTMP的浓度C＜0.5g/L时5’-dTMP的洗脱结束；控制系统关闭单向阀9，打开单向阀15、洗脱阀6，采用0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠对 5’-dGMP进行洗脱，同时采用HPLC检测器进行检测，当检测出5’-dGMP且浓度C ≥0.5g/L时，关闭单向阀15，打开单向阀9，收集5’-dGMP洗脱液，当5’-dGMP 的浓度C＜0.5g/L时5’-dGMP的洗脱结束；

(3)浓缩

洗脱结束后，将5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP溶液分别连接炭柱A4、A5、 A6，其中炭柱A4、A5、A6中分别加40-60L 769活性炭，5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP 分别被吸附在炭柱A4、A5、A6上，采用氨乙醇溶液进行洗脱，氨乙醇溶液中质量百分浓度为25-28％的氨水、95％乙醇、水的体积比为5：50:45，其中氨乙醇溶液的用量为炭柱体积的5-10倍，炭柱A4、A5、A6的流出液经HPLC检测器检测，并分别收集5’-dCMP浓度≥0.5g/L、5’-dAMP浓度≥0.5g/L、5’-dTMP浓度≥0.5g/L； 5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP减压浓缩后达到10-20％的质量百分浓度；之后， 5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP采用2-3倍95％乙醇结晶，过滤，真空干燥，即可分别获得2kg 5’-dCMP、含量99.1％，2.4kg 5’-dAMP、含量99.2％，2.2kg5’-dTMP、含量99.5％。5’-dGMP洗脱液浓度较高，约可达到5-6％的浓度，可直接加入2-3倍 95％乙醇，结晶，过滤，真空干燥，获得3kg 5’-dGMP，含量99.2％。

采用本实施例中的5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP、5’-dGMP产品作为原料制备脱氧核苷酸钠原料药，其中5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP、5’-dGMP白色结晶粉末，含量≥98％，有关物质(其他核苷酸、核苷等)小≤0.5％；

原料的包括按重量百分比计的如下组分：

按上述比例混合后，加入双蒸水，溶解后成20％(w/w)的溶液，在洁净车间 (区)内，通过0.22μ微滤除菌，采用5mol/L的NaOH调节pH至7.5，之后冷冻干燥成冻干粉，它可作为针剂，或片剂，或胶囊等固体制剂原料。

实施例2

本实施例中采用图1所示的智能层析系统对DNA酶解液进行层析分离；

按照实施例1中的酶解、水洗、洗脱方法得到5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP 和5’-dGMP；

浓缩过程中炭柱洗脱采用NaOH-乙醇溶液，其中浓度为1mol/L的NaOH、95％乙醇和水的体积比为10:20:70；其他与实施例1中相同，最终得到2kg 5’-dCMP、含量99.1％，2.4kg5’-dAMP、含量99.2％，2.2kg 5’-dTMP、含量99.5％，3kg 5’-dGMP，含量99.2％。

原料的包括按重量百分比计的如下组分：

实施例3

按照实施例1进行酶解、上样、水洗、洗脱、浓缩得到2kg 5’-dCMP、含量99.1％，2.4kg 5’-dAMP、含量99.2％，2.2kg5’-dTMP、含量99.5％，3kg 5’-dGMP，含量99.2％。

原料的包括按重量百分比计的如下组分：

综上所述，本发明的脱氧核苷酸层析分离方法及脱氧核苷酸钠原料药的制备，采用实时在线检测和智能化控制对DNA酶解液进行层析分离，通过核酸蛋白检测仪(下称检测仪)的实时在线检测，监控上样、水洗过程中是否有脱氧核苷酸流出，从而了解这一过程是否正常运转；通过定时在线取样和HPLC检测器分析，控制洗脱过程和收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGMP四种脱氧核苷酸溶液；本发明不仅实现了整个层析分离全流程无人化操作，过程控制更加精密便捷，省时省力，减少人为误差，避免生产受到损失，而且能得到高纯度的单一组分的脱氧核苷酸，并根据单一脱氧核苷酸复配成脱氧核苷酸钠原料药。

本技术领域中的普通技术人员应当认识到，以上的实施例仅是用来说明本发明，而并非用作为对本发明的限定，只要在本发明的实质精神范围内，对以上所述实施例的变化、变型都将落在本发明的权利要求书范围内。

Claims

1.一种脱氧核苷酸层析分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)上样，将过滤后的DNA酶解液依次通过由1根阳离子交换树脂柱和多根阴离子交换树脂柱串联的柱层析系统，并采用核酸蛋白检测仪对最后一根阴离子交换树脂柱的流出液进行实时在线检测；

(3)分段洗脱，断开所述阳离子交换树脂柱，对串联的多根阴离子交换树脂柱进行洗脱，同时采用HPLC检测器对最后一根阴离子交换树脂柱的流出液进行定时检测，并分别收集5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGMP四种脱氧核苷酸；

2.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法，其特征在于，所述步骤(1)中：

所述阳离子交换树脂柱和阴离子交换树脂柱均采用盐酸或NaOH进行再生处理，所述阳离子交换树脂柱为Na型阳离子交换树脂柱，所述阴离子交换树脂柱为Cl型阴离子交换树脂柱；和/或

所述上样过程中，所述DNA酶解液的流速为120～180L/h；和/或

3.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中：

4.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法，其特征在于，所述步骤(3)中：

所述分段洗脱过程中，采用0.01mol/L甲酸洗脱5’-dCMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dCMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dCMP溶液；采用0.1mol/L甲酸洗脱5’-dAMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dAMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dAMP溶液；采用0.1mol/L甲酸-0.1mol/L甲酸钠洗脱5’-dTMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dTMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dTMP溶液；采用质量百分浓度为3％的NaCl洗脱5’-dGMP，当所述HPLC检测器检测出5’-dGMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dGMP溶液。

5.根据权利要求1所述的脱氧核苷酸层析分离方法，其特征在于，所述步骤(4)中：

所述炭柱洗脱过程中，采用HPLC检测器对炭柱流出液进行定时检测，当炭柱流出液检测出5’-dCMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dCMP溶液；当炭柱流出液检测出5’-dAMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dAMP溶液；当炭柱流出液检测出5’-dTMP且浓度≥0.5g/L时，收集5’-dTMP溶液。

6.根据权利要求5所述的脱氧核苷酸层析分离方法，其特征在于，所述炭柱洗脱过程中，所述氨乙醇溶液采用氨水、95％乙醇和水配比而成，所述氨水、95％乙醇和水的体积比为5：50:45。

7.一种脱氧核苷酸钠原料药的制备，其特征在于，原料包括如权利要求1-6任一项所述的脱氧核苷酸层析分离方法制备的5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGM；

所述5’-dCMP、5’-dAMP、5’-dTMP和5’-dGM的含量均≥98％。

8.根据权利要求7所述的脱氧核苷酸钠原料药的制备，其特征在于，所述原料包括按重量百分比计的如下组分：