CN101845422A

CN101845422A - 制备5’-磷酸二酯酶的方法及用其制备2’-脱氧核苷酸的方法

Info

Publication number: CN101845422A
Application number: CN201010169002A
Authority: CN
Inventors: 丁庆豹; 欧伶; 魏晓琨; 许彦梅; 王玥
Original assignee: SHANGHAI SIBEI BIOTECH CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI SIBEI BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2010-05-07
Filing date: 2010-05-07
Publication date: 2010-09-29
Anticipated expiration: 2030-05-07
Also published as: CN101845422B

Abstract

本发明制备5’-磷酸二酯酶的方法及用其制备2’-脱氧核苷酸的方法，提供了一种高活力高纯度液体5’-磷酸二酯酶的制备方法，并应用该制备的5’-磷酸二酯酶酶法降解脱氧核糖核酸生产2’-脱氧核苷酸。麦芽根粉碎至300目，加入7倍重量的去离子在45℃浸泡4h，纱布过滤，加入0.5倍体积的丙酮，离心去除沉淀，再加入4倍体积的丙酮，分离出5’-磷酸二酯酶，酶活可高达5000U/mL以上。用该酶降解脱氧核糖核酸，2’-脱氧核苷酸的转化率可达80％以上。经分离纯化，制备得到的2’-脱氧核苷的纯度与含量均达到98％以上。

Description

制备5’-磷酸二酯酶的方法及用其制备2’-脱氧核苷酸的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从麦芽根中制备高活力液体5’-磷酸二酯酶的方法，以及应用该酶降解脱氧核糖核酸制备高纯度2’-脱氧核苷酸的方法。

背景技术

2’-脱氧核苷酸为组成遗传物质脱氧核糖核酸(DNA)的重要组成部分，参与细胞内大量的生化反应。临床上，2’-脱氧核苷酸的混合钠盐可制备为针剂或口服剂，用于辅助治疗免疫低下的患者。近年来随着分子生物学的高速发展，尤其是现代基因工程技术中大量使用脱氧核苷三磷酸作为PCR的基础试剂，作为合成脱氧核苷三磷酸的原料-2’-脱氧核苷酸的市场需求日益增加。

目前，2’-脱氧核苷酸的制备主要由酶法降解DNA中获得，其工艺大体如下：1)利用市售的5’-磷酸二酯酶或桔青霉发酵产生的核酸酶P1，降解由鱼白中提取的DNA，获得酶解液，即2’-脱氧腺苷酸(dAMP)、2’-脱氧胞苷酸(dCMP)，2’-脱氧鸟苷酸(dGMP)和胸苷酸(TMP)的混合物；2)经活性炭脱盐、脱蛋白进行纯化；3)浓缩干燥后得到混合2’-脱氧核苷酸的固体。

上述工艺对于制备混合2’-脱氧核苷酸具有一定的意义，但是对于应用到分子生物学试剂却没有实际作用。因为分子生物学试剂需要极高的纯度(HPLC纯度至少要达到98％以上)，以满足后期的试验需要。

有关从麦芽根中提取5’-磷酸二酯酶用于降解核糖核酸(RNA)制备核苷酸已有不少报道，如中国专利公开号CN101012469A提供了一种采用液体5’-磷酸二酯酶制备5’-核苷酸类物质的方法；李德莹等报道了从麦芽根中提取5’-磷酸二酯酶降解生产5’-核苷酸的方法(华东理工大学学报，2002，28(4)：376-379)。这些报道中均未提及脱氧核糖核酸的酶解。

有关从核糖核酸的降解液中提取核苷酸的方法也很多。如中国专利公开号CN1286259公开了一种使用阳离子树脂分离5’-核苷酸的方法；中国专利ZL02136839.2公开了一种使用阴离子树脂分离5’-核苷酸的方法；中国专利公开号CN101381382A中提供了一种使用阴离子树脂分离2’-脱氧核苷酸的方法。上述方法中大多是以分离5’-核苷酸为目的，或以制备混合2’-脱氧核苷酸为目的。

Makoto等使用桔青霉发酵得到的核酸酶P1，大约有47％的DNA降解为2’-脱氧核苷酸(Food research International，1996，29(8)∶751-755)；吴汉民等亦以同样的方法降解DNA，并用阴离子交换树脂分离法分离得到了2’-脱氧核苷酸，报道中未提到转化率及2’-脱氧核苷酸的收率(水产学报，2000，24(3)：275-279)。

上述专利和文献中所述及的方法，2’-脱氧核苷酸的转化率低、或分离工艺效率低下、或未涉及高纯度2’-脱氧核苷酸的制备。

发明内容

本发明的发明人经过广泛的探索，发明了一种从麦芽根中制备高活力液体5’-磷酸二酯酶的方法。然后发明了应用该酶降解脱氧核糖核酸制备2’-脱氧核苷酸的方法。

因此，本发明所要解决的技术问题之一是提供一种从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种用从麦芽根中制备的5’-磷酸二酯酶降解DNA生产2’-脱氧核苷酸，并从酶解液中分离得到高纯度的2’-脱氧核苷酸的方法，以解决现有技术中存在的2’-脱氧核苷酸的转化率低、或分离工艺效率低下、或未涉及高纯度2’-脱氧核苷酸的制备之类的技术缺陷。

本发明的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法包括如下步骤，(1)浸泡：将粉碎或未粉碎的麦芽根与去离子水混合、浸泡，浸泡温度10-50℃、浸泡时间1-8小时；(2)固液分离：浸泡结束后，过滤或离心，收集清液；(3)清液中加入0.1-0.5倍的有机溶剂，并搅拌1-8小时，于1000-10000转/min离心去除残渣，收集离心液；(4)向离心液中加入0.5-20倍离心液体积的有机溶剂，于室温下静置1-24h后，虹吸去除上层的液体，下层的液体搅匀即为高纯度液体5’-磷酸二酯酶。

优选的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其中浸泡温度40-45℃，浸泡时间为3-5小时。

更优选的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法其中步骤(1)去离子水用量为麦芽根重量的7-8倍。

所用麦芽根为大麦或燕麦发芽后的根，也可以为各种植物的根尖部分。优选为啤酒工业中废弃的麦芽根。麦芽根可浸泡后再进行粉碎，也可以粉碎后再浸泡。本发明优选粉碎后再浸泡，粉碎的粒度可在50-400目之间，优选为250目-350目。

所用的有机溶剂可以为甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、二氢呋喃、二甲基亚砜等。本发明优选采用丙酮。第一次加入丙酮的量为0.1-0.5倍离心液体积，优选为0.4倍；第二次加入丙酮的量优选为4-6倍离心液体积。

由本发明所制备的5’-磷酸二酯酶中所含的5’-磷酸单酯酶活力极低，几乎检测不出来活性，非常适合于由脱氧核糖核酸酶解制备2’-脱氧核苷酸。

本发明制备2’-脱氧核苷酸的方法，包括如下步骤；(1)如前述的从麦芽根中制备的方法制备5’-磷酸二酯酶；(2)酶解DNA：配制0.5％-5％(W/V)DNA溶液，加热到25-75℃，然后加入上述制备的5’-磷酸二酯酶溶液，加入的酶活为500U-3000U/g DNA，优选为1000U-2500U/g DNA，搅匀后于60-65℃反应1-24h得酶反应液，(3)2’-脱氧核苷酸的分离纯化：上述酶反应液2.0L用氢氧化钠调pH至8.0左右，通过装有250mL的阴离子交换树脂的玻璃柱(Φ2.6cm×70cm)，流速控制在100-200mL/h，上样结束后，依次用下列溶液进行洗涤或洗脱：2500mL氢氧化钠溶液(pH＝8.0)、1500mL 0.01mol/L甲酸(Ⅰ)、1500mL 0.15mol/L甲酸(Ⅱ)、2000mL 0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠(Ⅲ)、2000mL 0.1mol/L甲酸-0.2mol/L氯化钠(Ⅳ)，将Ⅰ-Ⅳ洗脱下来的四种2’-脱氧核苷酸溶液用氢氧化钠调pH8.0-pH10.0，分别用100mL的阴离子交换树脂进行吸附(Φ1.6cm×70cm)，流速控制在50-100mL/h，上样结束后，用100mL去离子水洗涤树脂柱，弃去洗涤液，最后用150mL 0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钠(Ⅴ)分别从四根柱上洗脱下来2’-脱氧核苷酸，收集洗脱液，浓缩至10-50mL，加入3-10倍体积的乙醇沉淀出2’-脱氧核苷酸，经过滤、抽干、烘干，分别得到2’-脱氧胞苷酸、2’-脱氧腺苷酸、胸苷酸二钠、2’-脱氧鸟苷酸二钠。

优选的制备2’-脱氧核苷酸的方法，包括如下步骤；(1)如前述的从麦芽根中制备的方法制备5’-磷酸二酯酶；(2)酶解DNA：配制1％-3％，(W/V)DNA溶液，加热到60-65℃，然后加入上述制备的5’-磷酸二酯酶溶液，加入的酶活为1000U-2500U/g DNA，搅匀后于60-65℃反应7-10h得酶反应液；(3)2’-脱氧核苷酸的分离纯化：上述酶反应液2.0L用氢氧化钠调pH至8.0左右，通过装有250mL的阴离子交换树脂的玻璃柱(Φ2.6cm×70cm)，流速控制在100-200mL/h，上样结束后，依次用下列溶液进行洗涤或洗脱：2500mL氢氧化钠溶液(pH＝8.0)、1500mL 0.01mol/L甲酸(Ⅰ)、1500mL 0.15mol/L甲酸(Ⅱ)、2000mL0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠(Ⅲ)、2000mL 0.1mol/L甲酸-0.2mol/L氯化钠(Ⅳ)，将Ⅰ-Ⅳ洗脱下来的四种2’-脱氧核苷酸溶液用氢氧化钠调pH8.0-pH10.0，分别用100mL的阴离子交换树脂进行吸附(Φ1.6cm×70cm)，流速控制在50-100mL/h，上样结束后，用100mL去离子水洗涤树脂柱，弃去洗涤液，最后用150mL 0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钠(Ⅴ)分别从四根柱上洗脱下来2’-脱氧核苷酸，收集洗脱液，浓缩至10-50mL，加入3-10倍体积的乙醇沉淀出2’-脱氧核苷酸，经过滤、抽干、烘干，分别得到2’-脱氧胞苷酸、2’-脱氧腺苷酸、胸苷酸二钠、2’-脱氧鸟苷酸二钠。

经HPLC检测反应液，2’-脱氧核苷酸的转化率在80％以上。四种2’-脱氧核苷酸经HPLC检测，其纯度均达到98％以上，四种核苷酸对起始原料DNA的收率约在60％以上。

本发明的方法所得到的四种2’-脱氧核苷酸纯度均在98％以，且分离方法中去除了常用的活性炭脱盐的方法，极大地提高了产品品质，降低了工艺操作难度。

本发明中所用的阴离子交换树脂可为各种季胺盐类树脂或其它各种型号，本发明中优选采用717，粒度在80-100目。

本发明中所用的用于调pH的各种碱液，不限于本发明中所述，可为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、氨水等，本发明中优选采用氢氧化钠。

本发明的特征；

采用本发明的制备的液体5’-磷酸二酯酶活力高，无需透析和干燥，可以直接高转化率的由DNA制备2’-脱氧核苷酸，且无需活性炭脱盐的方法即可从洗脱液中回收2’-脱氧核苷酸，产品的纯度可高达98％以上。

检测方法

有关5’-磷酸二酯酶和5’-磷酸单酯酶的活力测定参见张群等(生物技术通报，2008年增刊，378-383)的报道。

HPLC的分析方法：

仪器：安捷伦1020高效液相色谱仪，UV检测器。检测波长254nm。

柱：Hypersil SAX 5μm(4.6mm×250mm)。柱温25℃。

流动相：pH3.0的磷酸二氢钾溶液，流速1.0mL/min。

附图说明

图1酶液A降解DNA生成的2’-脱氧核苷酸之HPLC图谱

图2酶液B降解DNA生成的2’-脱氧核苷酸之HPLC图谱

图3酶液C降解DNA生成的2’-脱氧核苷酸之HPLC图谱

具体实施方式

实施例1

称取粉碎至300目的麦芽根100g，加入去离子水750mL，于45℃浸泡4小时，期间不停搅拌。然后用二层纱布过滤，弃去残渣。约得滤液600mL(酶液A)。经检测，5’-磷酸二酯酶的活力为750U/mL，5’-磷酸单酯酶的活力为120U/mL。

上述滤液加入300mL丙酮，在常温下搅拌2h后，于10000r/min离心去除残渣，得到液体体积为870mL(酶液B)。经检测，5’-磷酸二酯酶的活力为483U/mL，5’-磷酸单酯酶的活力为14U/mL。

再在酶液B中加入丙酮约2100mL，在常温下搅拌2h，然后静置8h，收集上层溶液用于回收丙酮，得下层溶液约80mL(酶液C)。经检测，5’-磷酸二酯酶的活力为5821U/mL，5’-磷酸单酯酶活力为0.2U/mL。

实施例2

配制三份10g/L的DNA溶液各1L，加热到65℃，分别加入酶液A、酶液B和酶液C，加入的5’-磷酸二酯酶酶活比例为1000U/g DNA(依次为13.3mL、20.7mL、1.7mL)，并于65℃反应8h，取样用HPLC检测所生成的2’-脱氧核苷酸的量(HPLC图见附图，酶液A的反应结果为图1；酶液B的反应结果为图2；酶液C的反应结果为图3)。结果见表1.

表1

	酶液A	酶液B	酶液C
	酶液A	酶液B	酶液C	dCMP(g)	0	0.3	1.7
dAMP(g)	0	0.5	2.1	dCMP(g)	0	0.3	1.7
dAMP(g)	0	0.5	2.1	TMP(g)	0	0.8	2.3
dGMP(g)	0	0.7	2.2	TMP(g)	0	0.8	2.3
dGMP(g)	0	0.7	2.2	合计(g)	0	2.3	8.3

实施例3

配制三份DNA溶液各1L，其浓度分别为10g/L(反应A)、20g/L(反应B)和30g/L(反应C)。各加入酶液C 1.7mL，其它同实施例2。结果见表2。

表2

	反应A	反应B	反应C
	反应A	反应B	反应C	dCMP(g)	1.7	3.51	5.03
dAMP(g)	2.1	4.22	6.41	dCMP(g)	1.7	3.51	5.03
dAMP(g)	2.1	4.22	6.41	TMP(g)	2.3	4.54	6.77
dGMP(g)	2.2	4.37	6.48	TMP(g)	2.3	4.54	6.77
dGMP(g)	2.2	4.37	6.48	合计(g)	8.3	16.64	24.69
转化率(％)	83％	83.2％	82.3％	合计(g)	8.3	16.64	24.69

实施例4

配制2L 10g/L的DNA溶液，加入3.4mL酶液C，按实施例2反应，反应结束后，于100℃加热5min，经检测得dCMP 3.3g，dAMP 4.3g，TMP 4.5g，dGMP 4.4g。

反应液中加入少量的活性碳和硅藻土搅拌半小时后过滤，收集滤液用6mol/L氢氧化钠调pH8.0，以200mL/h的速度流过装有250mL 717树脂的阴离子交换柱(Φ2.6cm×70cm)，弃去流出液。上样结束后，用2500mL氢氧化钠溶液(pH＝8.0)以200mL/h洗涤，弃去流出液。

然后依次用1500mL 0.01mol/L甲酸(Ⅰ)、1500mL 0.15mol/L甲酸(Ⅱ)、2000mL 0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠(Ⅲ)、2000mL 0.1mol/L甲酸-0.2mol/L氯化钠(Ⅳ)进行洗脱，分别收集各部分洗脱液。

洗脱液用6mol/L氢氧化钠调pH8.0，然后以100mL/h的速度流过装有100mL717树脂的阴离子交换柱(Φ1.6cm×70cm)，弃去流出液，上样结束后用200mL去离子水洗涤树脂，并弃去洗涤液。最后用150mL 0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钠以50mL/h的速度进行洗脱，收集洗脱液，用6mol/L氢氧化钠调pH7.0，并于60℃真空浓缩至30mL，再用2mol/L盐酸调至pH2.0，缓慢加入100mL无水乙醇，搅拌均匀，置4℃过夜。过滤收集结晶，于65℃真空干燥，得dCMP 2.87g，经HPLC和UV检测，含量均在98％以上。

洗脱液Ⅱ-Ⅳ均按上述方法进行操作(只是Ⅲ、和Ⅳ在结晶前调pH8.0)，分别得到2’-脱氧腺苷酸3.5g、胸苷酸二钠3.41g、2’-脱氧鸟苷酸二钠3.5g。经HPLC和UV检测，含量均在98％以上。总收率在66.4％。

Claims

1.从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于包括如下步骤，(1)浸泡：将粉碎或未粉碎的麦芽根与去离子水混合、浸泡，浸泡温度10-50℃、浸泡时间1-8小时；(2)固液分离：浸泡结束后，过滤或离心，收集清液；(3)清液中加入0.1-0.5倍的有机溶剂，并搅拌1-8小时，于1000-10000转/min离心去除残渣，收集离心液；(4)向离心液中加入0.5-20倍离心液体积的有机溶剂，于室温下静置1-24h后，虹吸去除上层的液体，下层的液体搅匀即为高纯度液体5’-磷酸二酯酶。

2.根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步骤(1)的，加入的酶活为500U-3000U/g DNA，优选为1000U-2500U/g DNA，搅匀后于60-65℃反应1-24h得酶反应液，(3)2’-脱氧核苷酸的分离纯化：上述酶反应液2.0L用氢氧化钠调pH至8.0左右，通过装有250mL的阴离子交换树脂的玻璃柱(Φ2.6cm×70cm)，流速控制在100-200mL/h，上样结束后，依次用下列溶液进行洗涤或洗脱：2500mL氢氧化钠溶液(pH＝8.0)、1500mL 0.01mo浸泡温度40-45℃，浸泡时间为3-5小时。

3.根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步骤(1)去离子水用量为麦芽根重量的7-8倍。

4.根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法，其特征在于，步骤(3)和(4)的有机溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、二氢呋喃、二甲基亚砜。

5.制备2’-脱氧核苷酸的方法，其特征在于，包括如下步骤，(1)根据权利要求1的从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶的方法从麦芽根中制备5’-磷酸二酯酶；(2)酶解DNA：配制0.5％-5％(W/V)DNA溶液，加热到25-75℃，然后加入上述制备的5’-磷酸二酯酶1/L甲酸(I)、1500mL 0.15mol/L甲酸(II)、2000mL 0.01mol/L甲酸-0.05mol/L甲酸钠(III)、2000mL 0.1mol/L甲酸-0.2mol/L氯化钠(IV)，将I-IV洗脱下来的四种2’-脱氧核苷酸溶液用氢氧化钠调pH8.0-pH10.0，分别用100mL的阴离子交换树脂进行吸附(Φ1.6cm×70cm)，流速控制在50-100mL/h，上样结束后，用100mL去离子水洗涤树脂柱，弃去洗涤液，最后用150mL 0.1mol/L甲酸-0.5mol/L氯化钠(V)分别从四根柱上洗脱下来2’-脱氧核苷酸，收集洗脱液，浓缩至10-50mL，加入3-10倍体积的乙醇沉淀出2’-脱氧核苷酸，经过滤、抽干、烘干，分别得到2’-脱氧胞苷酸、2’-脱氧腺苷酸、胸苷酸二钠、2’-脱氧鸟苷酸二钠。

6.根据权利要求5的制备2’-脱氧核苷酸的方法，其特征在于，步骤(2)酶解DNA：配制1％-3％(W/V)DNA溶液，加热到60-65℃，然后加入上述制备的5’-磷酸二酯酶溶液，加入的酶活为1000U-2500U/g DNA，搅匀后于60-65℃反应7-10h得酶反应液。