CN111378705A - 一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和d-核糖的方法 - Google Patents

一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和d-核糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物化工用领域，具体涉及一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D‑核糖的方法。本发明利用腺苷水解酶和中性蛋白酶两种酶通过生物水解法制备腺嘌呤和D‑核糖，其中，利用腺苷水解酶水解腺苷得到腺嘌呤和D‑核糖，进一步利用中性蛋白酶处理体系中残留的腺苷水解酶，而中性蛋白酶可进一步通过水洗的方式去除，与传统的化学合成法和天然产物提取法相比，反应温和，不需要加热，副产物少，产物收率高和纯度高。

Description

一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法
技术领域
本发明属于生物化工用领域，具体涉及一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法。
背景技术
腺嘌呤，化学名为6-氨基嘌呤，化学式为C5H5N5，是核酸的组成成分，参与遗传物质的合成；是很多医药原料及中间体，主要用于生产维生素B4、植物激素6-苄基腺嘌呤、腺嘌呤核苷、抗乙肝药物阿德福韦酯及泰诺福韦酯等；其磷酸盐能促进白细胞增生，使白细胞数目增加，用于防治各种原因引起的白细胞减少症，特别是用于肿瘤化学治疗时引起的白细胞减少症，也用于急性粒细胞减少症。目前，生产腺嘌呤的方法主要有化学合成法、天然原料提取法和微生物发酵法等。
乙酰次黄嘌呤法是目前国内生产企业使用较多的化学合成方法，例如，CN102321086A公开了乙酰次黄嘌呤和三氯氧磷在N，N-二甲基苯胺的催化下进行氯代反应，得到6-氯嘌呤；在高压釜中，往6-氯嘌呤水溶液中通氨气至饱和，密闭反应釜，升温至120～140℃进行反应直至反应完全，调反应液pH至7～8，冷却，析出腺嘌呤。CN104327081A公开了以乙酰次黄嘌呤为原料，将其分散于1，2-二氯乙烷中，加入无水吡啶和三乙胺，再加入三氯氧磷进行反应，反应结束后，快速过滤，得到中间体；然后将中间体立即加入氨水/甲醇混合液中，进行氨解，制得腺嘌呤。CN107602558A公开了把乙酰次黄嘌呤分散于1，2-二氯乙烷中，然后加入到反应釜，缓慢投入无水吡啶和三乙胺，搅拌升温至110℃～120℃，加入三氯氧磷保温反应50～80min，继续110℃～120℃保温反应4～6h后降温至15℃左右，静至过夜；将上述反应液过滤，再加入混合液中进行氨解，烘干得到腺嘌呤粗品；进一步纯化得到腺嘌呤纯品。上述方法均存在产率较低，使用吡啶、二氯乙烷等大量有毒有害的有机溶剂，且使用三氯氧磷，后处理产生大量废液，反应时间较长、反应条件苛刻等缺点和不足。
天然产物提取法主要是提取天然物种中富集的腺嘌呤。但是目前由于天然宿主腺嘌呤产量低，因此该方法的生产成本高，且提取效率低。吴萍萍等人(吴萍萍,黄丽英,黄丽萍,et al.Analysis of the extraction of adenine from Anoectochilus roxburghi％金线莲中腺嘌呤的提取与分析[J].中国医院药学杂志,2013,033(003):215-218.)公开了应用超声-微波协同萃取技术提取金线莲中的腺嘌呤，其中，提取物中腺嘌呤含量为10.64μg/g。
微生物发酵法生产条件温和，安全性较高，例如，申请号为“CN201810517392.7”的中国专利申请公开了通过在累积腺苷的菌株中引入编码生物酶的基因，获得腺嘌呤生产菌株，通过基因工程手段，实现了细菌体内腺苷(或其前体腺苷酸AMP)向腺嘌呤的转化，从而直接生产出腺嘌呤，但是该方法存在耗时长、效率低、产物难分离等问题。
发明内容
为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的目的在于提供一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，该方法反应步骤简单、产量高，反应的转化率高达>99％，腺嘌呤的收率为99％左右，纯度达到99.85％以上；同时D-核糖的收率也在80％以上，有利于实现产业化。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，包含如下步骤：
(1)将腺苷和水混合，调节体系pH值至6.5～7.0；然后加入腺苷水解酶，升温至35～37℃并保温反应4～6h；反应完毕后，45～50℃保温处理30～60min；
(2)将步骤(1)中的反应体系升温至50～55℃，加入中性蛋白酶，保温反应3～12h；反应完成后降温至0～5℃并固液分离，收集固体部分1和液相部分1；其中，固体部分1进一步洗涤；
(3)在步骤(2)制得的液相部分1中加入活性炭，40～45℃搅拌0.5～1h，固液分离，收集液相部分2；将液相部分2浓缩后加入无水乙醇，再次浓缩，得到D-核糖；
(4)将步骤(2)洗涤后的固体部分1加入到水中，90～95℃保温处理1～2h；然后将体系降温至0～5℃并固液分离，收集固体部分2；固体部分2进一步洗涤，得到腺嘌呤；
步骤(1)中所述的腺苷水解酶的用量优选为100～300U/g腺苷；
步骤(1)中所述的中性蛋白酶的用量优选为10～300U/g腺苷；
步骤(2)中所述的保温反应的时间优选为6h；
步骤(2)中所述的固液分离的方式优选为过滤或抽滤；
步骤(2)中所述的洗涤优选为水洗1～3次；
步骤(3)中所述的固液分离的方式优选为过滤或抽滤；
步骤(3)中所述的浓缩优选为40℃以下浓缩至无溶剂；
步骤(4)中所述的固液分离的方式优选为过滤或抽滤；
步骤(4)中所述的洗涤优选为水洗1～3次；
本发明的原理：
Figure BDA0002461409570000031
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(4)本发明利用腺苷水解酶和中性蛋白酶两种酶通过生物水解法制备腺嘌呤和D-核糖，其中，利用腺苷水解酶水解腺苷得到腺嘌呤和D-核糖，进一步利用中性蛋白酶处理体系中残留的腺苷水解酶，而中性蛋白酶可进一步通过水洗的方式去除，与传统的化学合成法和天然产物提取法相比，反应温和，不需要加热，副产物少，产物收率高，收率达99％左右，产品纯度高，其中，如果只采用腺苷水解酶制备腺嘌呤，腺嘌呤纯度最高仅为98.5％，产品透明度不合格，而采用腺苷水解酶和中性蛋白酶两种酶制备腺嘌呤，腺嘌呤纯度99.85％以上，产品透明度高，且不产生泡沫。
(2)本发明提供的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法步骤简单、产量高，纯化简单，不需要溶剂，大幅降低了生产成本，并且制备过程中产生的三废的量很少，非常环保绿色。
(3)本发明提供的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法反应的转化率高达>99％，有利于实现产业化。
(4)本发明提供的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法原子经济性非常高，腺嘌呤的收率达到99％左右，同时D-核糖的收率也在80％以上。
附图说明
图1是实施例1与对比实施例1不同腺苷制备方法酶解后产品透明度展示图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中，腺苷水解酶和中性蛋白酶均为市购，其中，腺苷水解酶的酶活/效价5万U/g，中性蛋白酶的酶活/效价20万U/g。
实施例1
(1)取50g腺苷和100ml水混合，调节体系pH值至7.0；然后加入腺苷水解酶，升温至37℃进行反应，HPLC监测反应进程，反应共计5h，其中，腺苷水解酶的用量为250U/g腺苷；反应完毕后，48℃保温处理30min；
(2)将步骤(1)中的反应体系升温至53℃，加入中性蛋白酶，保温反应6h，其中，中性蛋白酶的用量为100U/g腺苷；反应完成后降温至4℃并过滤，收集固体部分1和液相部分1；其中，固体部分1水洗1次，备用；
(3)在步骤(2)制得的液相部分1中加入活性炭，42℃搅拌50min，抽滤，收集液相部分2；将液相部分2在40℃以下浓缩至无溶剂后加入无水乙醇混合均匀，再次40℃以下浓缩至无溶剂，得到D-核糖，其中，D-核糖的收率85％；
(4)将步骤(2)洗涤后的固体部分1加入到水中，92℃保温处理1.5h；然后将体系降温至4℃并抽滤，收集固体部分2；进一步水洗3次，得到腺嘌呤，其中，腺嘌呤的收率为99.1％，纯度为99.91％。
实施例2
(1)取50g腺苷和100ml水混合，调节体系pH值至6.5；然后加入腺苷水解酶，升温至35℃进行反应，HPLC监测反应进程，反应共计6h，其中，腺苷水解酶的用量为100U/g腺苷；反应完毕后，45℃保温处理60min；
(2)将步骤(1)中的反应体系升温至50℃，加入中性蛋白酶，保温反应10h，其中，中性蛋白酶的用量为40U/g腺苷；反应完成后降温至0℃并过滤，收集固体部分1和液相部分1；其中，固体部分1水洗2次，备用；
(3)在步骤(2)制得的液相部分1中加入活性炭，40℃搅拌1h，抽滤，收集液相部分2；将液相部分2在40℃以下浓缩至无溶剂后加入无水乙醇混合均匀，再次40℃以下浓缩至无溶剂，得到D-核糖，其中，D-核糖的收率为81％；
(4)将步骤(2)洗涤后的固体部分1加入到水中，90℃保温处理2h；然后将体系降温至0℃并抽滤，收集固体部分2；进一步水洗2次，得到腺嘌呤，其中，腺嘌呤的收率为98.9％，纯度为99.85％。
实施例3
(1)取90g腺苷和100ml水混合，调节体系pH值至6.8；然后加入腺苷水解酶，升温至37℃进行反应，HPLC监测反应进程，反应共计4h，其中，腺苷水解酶的用量为300U/g腺苷；反应完毕后，50℃保温处理40min；
(2)将步骤(1)中的反应体系升温至55℃，加入中性蛋白酶，保温反应4h，其中，中性蛋白酶的用量为300U/g腺苷；反应完成后降温至5℃并过滤，收集固体部分1和液相部分1；其中，固体部分1水洗1次，备用；
(3)在步骤(2)制得的液相部分1中加入活性炭，45℃搅拌30min，抽滤，收集液相部分2；将液相部分2在40℃以下浓缩至无溶剂后加入无水乙醇混合均匀，再次40℃以下浓缩至无溶剂，得到D-核糖，其中，D-核糖的收率82％；
(4)将步骤(2)洗涤后的固体部分1加入到水中，95℃保温处理1h；然后将体系降温至5℃并抽滤，收集固体部分2；进一步水洗3次，得到腺嘌呤，其中，腺嘌呤的收率为98.5％，纯度为99.90％。
对比实施例
(1)取50g腺苷和100ml水混合，调节体系pH值至7.0；然后加入腺苷水解酶，升温至37℃进行反应，HPLC监测反应进程，反应共计5h，其中，腺苷水解酶的用量为250U/g腺苷；反应完毕后，48℃保温处理30min；
(2)将步骤(1)中的反应体系降温至4℃并过滤，收集固体部分1和液相部分1；其中，固体部分1水洗1次，备用；
(3)在步骤(2)制得的液相部分1中加入活性炭，42℃搅拌50min，抽滤，收集液相部分2；将液相部分2在40℃以下浓缩至无溶剂后加入无水乙醇混合均匀，再次40℃以下浓缩至无溶剂，得到D-核糖，其中，D-核糖的收率85％；
(4)将步骤(2)洗涤后的固体部分1加入到水中，92℃保温处理1.5h；然后将体系降温至4℃并抽滤，收集固体部分2；进一步水洗3次，得到腺嘌呤，其中，腺嘌呤的收率为99.4％，纯度为98.5％。
效果实施例
分别取0.5克实施例1和对比实施例制得的腺嘌呤加入到50毫升3mol/L的盐酸溶液中搅拌至混合均匀，检测产品透明度。
其中，图1B是实施例1制得的腺嘌呤产品的透明度，图1A是对比实施例制得的腺嘌呤产品的透明度，从图中可以看出，对比实施例单独采用腺苷水解酶酶解后制得的腺嘌呤产品不澄清，透明度不高，即纯度较低；此外，该体系易起泡，在实际工业生产中，容易造成漫溢，且延长反应周期。而实施例1制得的腺嘌呤产品的透明度高，完全澄清，体系中无泡沫。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于包含如下步骤：
(1)将腺苷和水混合，调节体系pH值至6.5～7.0；然后加入腺苷水解酶，升温至35～37℃并反应4～6h；反应完毕后，45～50℃保温处理30～60min；
(2)将步骤(1)中的反应体系升温至50～55℃，加入中性蛋白酶，保温反应3～12h；反应完成后降温至0～5℃并固液分离，收集固体部分1和液相部分1；其中，固体部分1进一步洗涤；
(3)在步骤(2)制得的液相部分1中加入活性炭，40～45℃搅拌0.5～1h，固液分离，收集液相部分2；将液相部分2浓缩后加入无水乙醇，再次浓缩，得到D-核糖；
(4)将步骤(2)洗涤后的固体部分1加入到水中，90～95℃保温处理1～2h；然后将体系降温至0～5℃并固液分离，收集固体部分2；固体部分2进一步洗涤，得到腺嘌呤。
2.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的腺苷水解酶的用量为100～300U/g腺苷。
3.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的中性蛋白酶的用量为10～300U/g腺苷。
4.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的保温反应的时间为6h。
5.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的固液分离的方式为过滤或抽滤。
6.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的洗涤为水洗1～3次。
7.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的固液分离的方式为过滤或抽滤。
8.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的浓缩为40℃以下浓缩至无溶剂。
9.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的固液分离的方式为过滤或抽滤。
10.根据权利要求1所述的腺苷水解酶水解腺苷制备腺嘌呤和D-核糖的方法，其特征在于：
步骤(4)中所述的洗涤为水洗1～3次。
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