CN117447540A - 一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种β‑烟酰胺单核苷酸的纯化方法，属于生物技术领域。本发明提供了一种β‑烟酰胺单核苷酸的纯化方法，先将β‑烟酰胺单核苷酸料液上样至第一连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液，再将第一洗脱液上样至第二连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β‑烟酰胺单核苷酸，其中，第一连续色谱柱系统由至少两个以吸附树脂LX‑8400为填料的层析柱串联而成，第二连续色谱柱系统由至少一个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和至少一个以大孔吸附树脂LX‑36为填料的层析柱依次串联而成。所述纯化方法无需使用酸碱、无机盐和有机溶剂，并且，具有纯度高和收率高的优势。
Description
技术领域
本发明涉及一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，属于生物技术领域。
背景技术
烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+，NicotinamideAdenine Dinucleotide)是细胞能量代谢和氧化应激适应性反应的关键辅酶，参与人体糖酵解、TCA循环、氧化磷酸化、DNA修复和蛋白质去乙酰化等的多种酶促过程，在维持人体新陈代谢、氧化还原、DNA的维持和修复、基因稳定性、表观遗传调控等的生理活动中发挥重要作用。研究表明，随着年龄增加，人体内NAD+水平均呈下降趋势。而NAD+下降会诱发听力和视力丧失，认知和运动功能障碍，免疫缺陷，自身免疫炎症反应失调导致的关节炎、代谢障碍和心血管疾病等疾病。因此，提高人体NAD+水平对保持人体健康十分重要。
β-烟酰胺单核苷酸(NMN，β-Nicotinamide Mononucleotide，CAS：1094-61-7)是NAD+的前体物质。研究表明，外源性补充NMN可以提高人体NAD+水平。因此，现在认为外源性补充NMN能有效预防和治疗NAD+下降所导致疾病，对保持人体健康十分重要。近些年，NMN的市场需求量逐年增高。
目前，主要通过化学合成法、酵母菌发酵法和生物催化法这三种方法生产NMN。其中，化学合成法是以烟酰胺为原料，经多步反应合成NMN，此方法存在反应路线长、反应条件苛刻、选择性差、易生成手性化合物、需用到昂贵的试剂、成本较高等缺陷，并且，此方法在合成过程还需使用大量的有机溶剂，大量有机溶剂的使用会造成环境污染(具体可见参考文献“李旺,郭文彬,王晓季.烟酰胺单核苷酸(NMN)的活性与化学制备的研究进展[J]”)。
酵母菌发酵法是以烟酰胺为原料，借助微生物，以类似于酿酒的方式进行NMN的生产，此方法技术壁垒较高，且具有工艺控制复杂、生产成本高、产量较低等缺陷(具体可参见公开号为CN116004489A的专利申请文本)。
生物催化法则是通过模拟体内NMN的代谢路径，将体内酶进行体外表达，实现体外酶催化反应，具体是以烟酰胺核糖(NR，Nicotinamide Riboside，CAS 1341-23-7)为原料，经烟酰胺核苷激酶(NMRK酶，Ribosylnicotinamide Kinase，EC 2.7.1.22)催化合成NMN。生物催化法的生产过程与生物体内酶催化过程一致，基本无额外杂质产生，纯度较高，与化学合成法和酵母菌发酵法相比，此方法具有反应路线短、工艺简单、反应条件温和、选择性好、成本较低、制得的NMN纯度更高的优势。
但是，现阶段，生物催化法受到纯化技术的限制，在NMN的纯化过程通常需要使用酸碱、无机盐或有机溶剂，并且，NMN的纯度和收率也不能得到保证(具体可参见公开号为CN104817604A的专利申请文本以及公开号为CN108026132A的专利申请文本)。因此，亟需找到一种无需使用酸碱、无机盐和有机溶剂，并且，纯化而得的β-烟酰胺单核苷酸纯度高、收率高的β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述方法包含如下步骤：
除盐脱色步骤：将β-烟酰胺单核苷酸料液上样至第一连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液；所述第一连续色谱柱系统由至少两个以吸附树脂LX-8400为填料的层析柱串联而成；
纯化步骤：将第一洗脱液上样至第二连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β-烟酰胺单核苷酸；所述第二连续色谱柱系统由至少一个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和至少一个以大孔吸附树脂LX-36为填料的层析柱依次串联而成。
在本发明的一种实施方式中，除盐脱色步骤中，所述β-烟酰胺单核苷酸料液在第一连续色谱柱系统中的单次上样总量为0.1～1个柱体积。
在本发明的一种实施方式中，纯化步骤中，所述第一洗脱液在第二连续色谱柱系统中的单次上样总量为0.1～1个柱体积。
在本发明的一种实施方式中，所述除盐脱色步骤为：将β-烟酰胺单核苷酸料液以2～5mL/min的进样速度上样至第一连续色谱柱系统后，使用0.2～6个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液。
在本发明的一种实施方式中，所述纯化步骤为：将第一洗脱液以10～15mL/min的进样速度上样至第二连续色谱柱系统后，使用0.1～4个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β-烟酰胺单核苷酸。
在本发明的一种实施方式中，所述第一连续色谱柱系统由3～8个以吸附树脂LX-8400为填料的层析柱串联而成。
在本发明的一种实施方式中，所述第一连续色谱柱系统由6个以吸附树脂LX-8400为填料的层析柱串联而成。
在本发明的一种实施方式中，所述第二连续色谱柱系统由1个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和1个以大孔吸附树脂LX-36为填料的层析柱依次串联而成。
在本发明的一种实施方式中，稀释步骤之前，所述方法还包含预处理步骤；所述预处理步骤为：将β-烟酰胺单核苷酸料液进行过滤，得到经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液。
在本发明的一种实施方式中，所述过滤为膜过滤；所述膜过滤包括陶瓷膜过滤、反渗透膜过滤、微滤、超滤和/或纳滤。
在本发明的一种实施方式中，所述预处理步骤为：将β-烟酰胺单核苷酸料液依次进行陶瓷膜过滤、超滤和纳滤，得到经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液。
在本发明的一种实施方式中，所述陶瓷膜的孔径为10～100nm；所述超滤的截留分子量为1000～3000；所述纳滤的截留分子量为100～300。
在本发明的一种实施方式中，所述除盐脱色步骤、纯化步骤和/或预处理步骤在室温(25±5℃)下进行。
本发明还提供了上述纯化方法在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
本发明技术方案，具有如下优点：
本发明提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法先将β-烟酰胺单核苷酸料液上样至第一连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液，再将第一洗脱液上样至第二连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β-烟酰胺单核苷酸，其中，第一连续色谱柱系统由至少两个以吸附树脂LX-8400为填料的层析柱串联而成，第二连续色谱柱系统由至少一个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和至少一个以大孔吸附树脂LX-36为填料的层析柱依次串联而成。所述纯化方法无需使用酸碱、无机盐和有机溶剂，并且，使用所述纯化方法纯化β-烟酰胺单核苷酸具有纯度高和收率高的优势。
附图说明
图1：实施例1中经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液的HPLC图谱。
图2：实施例1中经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液的峰表。
图3：实施例1中第一洗脱液的HPLC图谱。
图4：实施例1中第一洗脱液的峰表。
图5：实施例1中经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的HPLC图谱。
图6：实施例1中经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的峰表。
图7：实施例2中经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液的HPLC图谱。
图8：实施例2中经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液的峰表。
图9：实施例2中除盐后第一洗脱液的HPLC图谱。
图10：实施例2中除盐后第一洗脱液的峰表。
图11：实施例2中经纯化后最终得到的洗脱液的HPLC图谱。
图12：实施例2中经纯化后最终得到的洗脱液的峰表。
图13：对比例1中经纯化后最终得到的洗脱液的HPLC图谱。
图14：对比例1中经纯化后最终得到的洗脱液的峰表。
图15：对比例2中经纯化后最终得到的洗脱液的HPLC图谱。
图16：对比例2中经纯化后最终得到的洗脱液的峰表。
图17：对比例3中经纯化后最终得到的洗脱液的HPLC图谱。
图18：对比例3中经纯化后最终得到的洗脱液的峰表。
图19：对比例4中经纯化后最终得到的洗脱液的HPLC图谱。
图20：对比例4中经纯化后最终得到的洗脱液的峰表。
图21：对比例5中经纯化后最终得到的洗脱液的HPLC图谱。
图22：对比例5中经纯化后最终得到的洗脱液的峰表。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
下述实施例中未注明具体实验步骤或条件者，按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
下述实施例中涉及的电导率用电导率仪测定，具体参考GB/T 6908-2018；下述实施例中涉及的β-烟酰胺单核苷酸浓度的检测方法参见公开号为CN114958878A的专利申请文本；下述实施例中涉及β-烟酰胺单核苷酸纯度用高效液相色谱法测定；下述实施例中涉及β-烟酰胺单核苷酸回收率的检测方法参考《中国药典》2020版中9101项《分析方法验证指导原则》。
下述实施例中涉及的β-烟酰胺单核苷酸料液的制备过程参见公开号为CN114958878A的专利申请文本。实施例1和实施例2纯化的β-烟酰胺单核苷酸料液为两个批次，其中，实施例1纯化的β-烟酰胺单核苷酸料液pH为5.8，β-烟酰胺单核苷酸浓度为20.3g/L，实施例2纯化的β-烟酰胺单核苷酸料液pH为5.6，β-烟酰胺单核苷酸浓度为18.8g/L，实施例1和实施例2纯化的β-烟酰胺单核苷酸料液均呈黄色，较浑浊。
实施例1：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
本实施例提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法的步骤如下：
预处理步骤：将β-烟酰胺单核苷酸料液依次进行陶瓷膜过滤、超滤和纳滤浓缩，得到经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液(经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液的β-烟酰胺单核苷酸浓度为184.6g/L，纯度为73.52％，pH为5.2，电导率为12.7ms/cm，HPLC图谱见图1～2)；所述陶瓷膜的孔径为50nm；所述超滤的截留分子量为2000；所述纳滤的截留分子量为150(陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜均购自山东博纳生物科技有限公司)；
除盐脱色步骤：将经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液以5mL/min的进样速度上样(连续上样，总上样量为1.0个柱体积)至第一连续色谱柱系统后，使用4个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液(第一洗脱液的β-烟酰胺单核苷酸纯度为79.05％，电导率为0.43ms/cm，HPLC图谱见图3～4)；所述第一连续色谱柱系统由6个以吸附树脂LX-8400(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)为填料的层析柱(柱尺寸为：内径*长度＝16mm*400mm)串联而成；
纯化步骤：将第一洗脱液以10mL/min的进样速度上样(连续上样，总上样量为1.0个柱体积)至第二连续色谱柱系统后，使用2个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β-烟酰胺单核苷酸(经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸纯度为99.49％，回收率为92.1％，电导率为0.41ms/cm，HPLC图谱见图5～6)；所述第二连续色谱柱系统由1个以阴离子交换树脂D202(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)为填料的层析柱(柱尺寸为：内径*长度＝16mm*400mm)和1个以大孔吸附树脂LX-36(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)为填料的层析柱(柱尺寸为：内径*长度＝16mm*400mm)依次串联而成。
由图1～6可知，实施例1的纯化方法除杂效果好，可以得到高纯度的β-烟酰胺单核苷酸。
实施例2：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
本实施例提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法的步骤如下：
预处理步骤：将β-烟酰胺单核苷酸料液依次进行陶瓷膜过滤、超滤和纳滤浓缩，得到经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液(经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液的β-烟酰胺单核苷酸浓度为165.8g/L，纯度为75.69％，pH为5.1，电导率为11.6ms/cm，HPLC图谱见图7～8)；所述陶瓷膜的孔径为50nm；所述超滤的截留分子量为2000；所述纳滤的截留分子量为150(陶瓷膜、超滤膜和纳滤膜均购自山东博纳生物科技有限公司)；
除盐脱色步骤：将经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液以5mL/min的进样速度上样(连续上样，总上样量为1.0个柱体积)至第一连续色谱柱系统后，使用4个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液(第一洗脱液的β-烟酰胺单核苷酸纯度为79.50％，电导率为0.38ms/cm，HPLC图谱见图9～10)；所述第一连续色谱柱系统由6个以吸附树脂LX-8400(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)为填料的层析柱(柱尺寸为：内径*长度＝16mm*400mm)串联而成；
纯化步骤：将第一洗脱液以10mL/min的进样速度上样(连续上样，总上样量为1.0个柱体积)至第二连续色谱柱系统后，使用2个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β-烟酰胺单核苷酸(经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸纯度为99.86％，回收率为92.4％，电导率为0.37ms/cm，HPLC图谱见图11～12)；所述第二连续色谱柱系统由1个以阴离子交换树脂D202(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)为填料的层析柱(柱尺寸为：内径*长度＝16mm*400mm)和1个以大孔吸附树脂LX-36(购自西安蓝晓科技新材料股份有限公司)为填料的层析柱(柱尺寸为：内径*长度＝16mm*400mm)依次串联而成。
由图7～12可知，实施例2的纯化方法除杂效果好，可以得到高纯度的β-烟酰胺单核苷酸。
对比例1：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
本对比例提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法在实施例1的基础上，将第一连续色谱柱系统中的吸附树脂LX-8400替换为大孔吸附树脂D101，其他条件不变。经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸纯度为84.89％，回收率为78.5％，电导率为1.86ms/cm，HPLC图谱见图13～14。
由图13～14可知，与实施例1相比，对比例1的纯化方法纯化效果较差。
对比例2：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
本对比例提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法在实施例1的基础上，将第一连续色谱柱系统中的吸附树脂LX-8400替换为吸附树脂LX-50，其他条件不变。经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸纯度为92.94％，回收率为86.3％，电导率为0.76ms/cm，HPLC图谱见图15～16。
由图15～16可知，与实施例1相比，对比例2的纯化方法纯化效果较差。
对比例3：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
本对比例提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法在实施例1的基础上，将第一连续色谱柱系统连续色谱柱系统中吸附树脂LX-8400的数量由6个替换为1个，其他条件不变。经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸纯度为98.64％，回收率为89.7％，电导率为0.55ms/cm，HPLC图谱见图17～18。
由图17～18可知，与实施例1相比，对比例3的纯化方法纯化效果较差。
对比例4：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
本对比例提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法在实施例1的基础上，将由1个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和1个以大孔吸附树脂LX-36为填料的层析柱依次串联而成的第二连续色谱柱系统替换为由1个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱组成的第二连续色谱柱系统，其他条件不变。经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸纯度为87.22％，回收率为83.4％，电导率为0.58ms/cm，HPLC图谱见图19～20。
由图19～20可知，与实施例1相比，对比例4的纯化方法纯化效果较差。
对比例5：一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法
本对比例提供了一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述纯化方法在实施例1的基础上，将第一连续色谱柱系统连续色谱柱系统中吸附树脂LX-8400的数量由6个替换为1个，并且，将由1个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和1个以大孔吸附树脂LX-36为填料的层析柱依次串联而成的第二连续色谱柱系统替换为由1个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱组成的第二连续色谱柱系统，其他条件不变。经纯化的β-烟酰胺单核苷酸的β-烟酰胺单核苷酸纯度为85.90％，回收率为81.2％，电导率为1.43ms/cm，HPLC图谱见图21～22。
由图21～22可知，与实施例1相比，对比例5的纯化方法纯化效果较差。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
Claims (10)
1.一种β-烟酰胺单核苷酸的纯化方法，所述方法包含如下步骤：
除盐脱色步骤：将β-烟酰胺单核苷酸料液上样至第一连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液；所述第一连续色谱柱系统由至少两个以吸附树脂LX-8400为填料的层析柱串联而成；
纯化步骤：将第一洗脱液上样至第二连续色谱柱系统后，使用水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β-烟酰胺单核苷酸；所述第二连续色谱柱系统由至少一个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和至少一个以大孔吸附树脂LX-36为填料的层析柱依次串联而成。
2.如权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，除盐脱色步骤中，所述β-烟酰胺单核苷酸料液在第一连续色谱柱系统中的单次上样总量为0.1～1个柱体积；纯化步骤中，所述第一洗脱液在第二连续色谱柱系统中的单次上样总量为0.1～1个柱体积。
3.如权利要求1或2所述的纯化方法，其特征在于，所述除盐脱色步骤为：将β-烟酰胺单核苷酸料液以2～5mL/min的进样速度上样至第一连续色谱柱系统后，使用0.2～6个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到第一洗脱液。
4.如权利要求1～3任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述纯化步骤为：将第一洗脱液以10～15mL/min的进样速度上样至第二连续色谱柱系统后，使用0.1～4个柱体积的水作为流动相进行洗脱，得到经纯化的β-烟酰胺单核苷酸。
5.如权利要求1～4任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述第一连续色谱柱系统由3～8个以吸附树脂LX-8400为填料的层析柱串联而成。
6.如权利要求1～5任一项所述的纯化方法，其特征在于，所述第二连续色谱柱系统由1个以阴离子交换树脂D202为填料的层析柱和1个以大孔吸附树脂LX-36为填料的层析柱依次串联而成。
7.如权利要求1～6任一项所述的纯化方法，其特征在于，除盐脱色之前，所述方法还包含预处理步骤；所述预处理步骤为：将β-烟酰胺单核苷酸料液进行过滤，得到经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液。
8.如权利要求7所述的纯化方法，其特征在于，所述过滤为膜过滤；所述膜过滤包括陶瓷膜过滤、反渗透膜过滤、微滤、超滤和/或纳滤。
9.如权利要求7或8所述的纯化方法，其特征在于，所述预处理步骤为：将β-烟酰胺单核苷酸料液依次进行陶瓷膜过滤、超滤和纳滤，得到经预处理的β-烟酰胺单核苷酸料液。
10.权利要求1～9任一项所述的纯化方法在制备β-烟酰胺单核苷酸中的应用。
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