CN101058572A - 一种新的具有抗肿瘤活性的肽类化合物 - Google Patents

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孔毅
吴梧桐
张红梅
黄春洪
刘建宁
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Abstract

本发明涉及医药技术领域，是从皖南尖吻腹蛇中分离纯化的一种新的抗肿瘤活性的肽类化合物。结构式如上图：体外抗肿瘤活性证明该 化合物对肝肿瘤细胞有抑制作用，其半数抑制浓度(IC50)为 4.46× 10－8mol/L。

Description

一种新的具有抗肿瘤活性的肽类化合物
技术领域
本发明涉及医药技术领域，是指从皖南尖吻蝮蛇蛇毒中提取获得的一种肽类化合物。
背景技术
尖吻蝮蛇(Agkistrodon acutus Guenther)属蝰蛇科蝮亚科尖吻蝮属，是一种剧毒蛇。分布于我国江南大部分地区和台湾省，是我国特有种类。尖吻蝮蛇毒中含有多种生理活性物质，主要是酶和毒素。尖吻蝮蛇毒酶主要有L-氨基酸氧化酶，乳酸脱氢酶，蛋白酶，磷脂酶，透明质酸酶和胶原蛋白酶，类凝血酶，激肽释放酶，纤溶酶(Fibrinlytic enzyme)。(中国毒蛇学南宁：广西科技出版社1995.)。尖吻蝮蛇毒毒素主要包括出血毒素、神经毒素和膜毒素。
神经毒素是一类相对分子质量小的碱性多肽，相对分子质量为6000～12000，pH值9以上。膜毒素的作用部位是细胞膜，使膜的通透性增加。膜毒素一般含60个氨基酸，4对二硫键，表现为强碱性，pI值为10～12，对热稳定，对水解酶有较强抗性。蛇毒细胞毒素对体外培养的多种动物和人的肿瘤细胞有溶解作用，能够强烈破坏游离细胞，尤其是恶性肿瘤细胞。Braganca(Bragaca BM，Pater NT，Badrinath PG.Biochem Biophys Acta)从印度眼镜蛇毒中分离出细胞毒组分，发现其破坏吉田肉瘤的能力比破坏人或大鼠红细胞的能力强千倍。仲晓燕(仲晓燕，刘玉芬，王晴川。中华眼镜蛇毒细胞毒素14的纯化及抗癌活性。中国药理学报，1993，14：279-282.)等测定了细胞毒素对MGC(人胃癌细胞)、CNE(人鼻咽癌细胞)、Hela细胞(人宫颈癌细胞)和乳鼠心肌细胞的细胞毒活性，结果表明对3种人癌细胞均有明显的杀伤作用。雷丹青等(雷丹青，王秋雁，刘绵林等.中国药理学报，2002，18(1)：61-64.)研究了广西眼镜蛇细胞毒对CNE，YAC(淋巴瘤细胞株)和卵巢癌细胞生长的抑制作用。中国医科大学蛇毒研究室证明蛇岛蝮蛇毒能够抑制肿瘤的生长，通过体外微量元素培养方法，发现了眼镜蛇毒对鼻咽癌、肝癌、胃癌、子宫颈癌等四种人肿瘤细胞和骨髓癌细胞等两种小鼠传代细胞的杀伤作用最强，其次是蝮蛇毒。蛇毒细胞毒素在体内能引起肿瘤体积缩小，延长荷瘤小鼠的存活时间(管锦霞，罗肖萍，曾谌文等.广州医学院学报，1997，1：17-19.)。
章良等从尖吻蝮蛇蛇毒中分离到了两个抗癌组分：ACTX-6和ACYX-8，对体外培养的人鼻咽癌细胞株(KB)，胃癌细胞株(BGC)，结肠癌细胞株(CACO-2)，卵巢癌细胞株(HO8910)，肺癌细胞株(A549)均有很强的抑制作用。并发现ACTX-6对A549和BGC的抑制作用明显优于5-氟尿嘧啶(5-FU)。实验室还对ACTX-6的体内抗小鼠移植性肉瘤(S180)、艾氏癌腹水型(EAC)、肝瘤实体型(Heps)的活性进行了研究，表明具有较强的抑瘤活性(Zhang liang，Li hong，Wu wutong.Journal of Chinese pharmaceutical sciences，2004，13(2)：97-102.)。从文献可以看出，以往研究的尖吻蝮蛇中的活性蛋白质及多肽，分子量都在1000Da以上，而我们发现的这个化合物分子量只有429Da。
发明内容
本化合物是从尖吻蝮蛇蛇毒中提取的，提取方法如下：
1溶解：称取尖吻蝮蛇蛇毒2g，溶于400ml缓冲液(Tris-HCl pH 8.0 10mmol)中，充分溶解。
2超滤：10000rpm离心10min，取上清，10000Da滤膜超滤(400ml-200ml)，收集滤出液，冷冻干燥浓缩。
3阴离子交换分离纯化：采用SOURCE Q色谱介质，色谱柱先用平衡液(A液：10mmol Tris-HClpH 8.0)平衡后，将冷冻干燥后的浓缩液上样，上样后用平衡液洗出未吸附组分，然后用洗脱液(B液：10mmol Tris-HCl pH 8.0+0.5mol·ml-1NaCl)进行梯度洗脱，程序为0％-100％B 30ml，流速0.8ml/min，检测波长为280nm。(图1)
4反相色谱纯化：收集上述分离的第2个组分，用反相色谱纯化。色谱柱为：RESOURCE RPC，用平衡液(A液：2％乙腈(含0.05％TFA))平衡后，上样，然后用洗脱液(B液：90％乙腈(含0.05％TFA))进行梯度洗脱，程序为0-100％B 20ml，流速为1ml/min，检测波长为280nm。(图2)
5收集主峰(峰1)，冷冻干燥，即为样品。
物理常数和图谱信息如下：
电喷雾离子化质谱：452.18(M+Na)+430.10(M+H)+
该化合物的1H 13C核磁共振数据，见表
Figure A20071002058400051
同时还测定了该化合物多种二维核磁共振谱，包括COSY，HSQC，HMBC和ROESY(混合时间分别为0.7s和1.0s)，确定了该化合物的化学结构及该化合物的所有的氢原子和碳原子的归属。结构如下：
Figure A20071002058400061
具体实施方式：体外抗肿瘤活性，采用方法为MTT，肿瘤细胞株为SMMC-7721(肝癌细胞)。结果如下：
  浓度(M)   1.17×10-8   2.33×10-8   4.66×10-8   9.32×10-8   1.40×10-7   1.86×10-7   2.33×10-7
  抑制率(％)   14   22.8   45.6   68.1   84.6   90.3   97.2
SMMC-7721的IC50为4.46×10-8mol/L。
本发明化合物的体外抗肿瘤活性极强，有望成为抗肿瘤药物或抗肿瘤先导化合物。对我国原创药物的研究开发具有重要意义。
附图说明
图1蛇毒低分子量超滤浓缩液的SOURCE Q离子交换色谱分离图
图2SOURCE Q峰2的RESOURCE RPC反相色谱分离图。

Claims (2)

1一种具有抗肿瘤活性的肽类化合物，其特征在于分子式是C20H23O6N5，具有如下结构：
2权力要求1所述的肽类化合物的用途，其特征在于用于制备抗肿瘤药物。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102060908A (zh) * 2010-09-17 2011-05-18 中国药科大学 一种人工合成的新型抗血栓多肽及其制备方法和应用
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CN104974239A (zh) * 2015-06-01 2015-10-14 苏州人本药业有限公司 一种离子交换和反相层析结合分离纯化眼镜蛇毒神经毒素的方法

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