CN112915583B - 一种荷叶生物碱单体的提纯系统及提纯工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明属于提纯工艺技术领域，具体涉及一种荷叶生物碱单体的提纯系统及提纯工艺，涉及提取、初级纯化和精制。本发明的提纯系统，将提取装置和初级纯化装置串联使得荷叶中有效物质的循环提取和富集同步进行，构建得到连续化工艺，且提取试剂的用量更加节约；采用制备液相法进行精制，同时获取多个高纯度荷叶生物碱单体。

Description

一种荷叶生物碱单体的提纯系统及提纯工艺
技术领域
本发明属于提纯工艺技术领域，具体涉及一种荷叶生物碱单体的提纯系统及提纯工艺。
背景技术
作为天然植物的药用成分，荷叶生物碱的降血脂、降胆固醇及减肥等生物活性功能近年受到关注。荷叶生物碱大部分呈弱碱性，在水中的溶解性较差，一般以游离态的形式存在，但易溶于甲醇、乙醇、丙酮等亲水性有机溶剂的酸性水溶液中。
目前，提取荷叶生物碱常用的方法有：酸性水溶液提取法、酸性水提取后采用大孔树脂富集吸附法、色谱分离法等。例如，荷叶生物碱单体的分离纯化及其对3T3-L1前脂肪细胞作用的构效关系研究中，其采用超声波提取，并将提取的溶出液采用氯仿反复萃取，得到生物碱粗提物。然而，氯仿具有毒性，不利于荷叶生物碱的纯化操作。另外，荷叶的有效物质的提取和富集大多是异步进行的，提纯效率较低。
发明内容
基于现有技术中存在的上述缺点和不足，本发明的目的之一是至少解决现有技术中存在的上述问题之一或多个，换言之，本发明的目的之一是提供满足前述需求之一或多个的一种荷叶生物碱单体的提纯系统及提纯工艺。
为了达到上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
一种荷叶生物碱单体的提纯系统，包括渗漉罐、层析柱、恒流泵、第一溶剂罐、第二溶剂罐、第一收集罐和第二收集罐，渗漉罐的出液口、第一溶剂罐和第二溶剂罐分别通过第一管路、第二管路和第三管路连接至恒流泵的进液口，恒流泵的出液口通过连通管路与层析柱的进液口连接；第一收集罐、第二收集罐和渗漉罐的进液口分别通过第四管路、第五管路和第六管路连接至层析柱的出液口；第一管路、第二管路、第三管路、第四管路、第五管路和第六管路均安装阀门。
作为优选方案，所述渗漉罐和层析柱均安装有排气阀。
作为优选方案，所述第一溶剂罐和/或第二溶剂罐和/或第一收集罐和/或第二收集罐的数量有多个，相应的管路及其上安装的阀门分别对应设置。
本发明还提供一种荷叶生物碱单体的提纯工艺，包括以下步骤：
S1、应用如权利要求1-3任一项所述的提纯系统对粉碎后的荷叶进行提纯处理，得到初级纯化的荷叶生物碱提取物；
S2、采用制备液相法对荷叶生物碱提取物进行纯化，得到荷叶生物碱单体。
作为优选方案，所述步骤S1包括：
S11、将粉碎后的荷叶浸泡在提取溶剂中至溶胀，然后将荷叶和提取溶剂装入渗漉罐，打开第一管路的阀门、恒流泵和第六管路的阀门，进行有效物质的循环提取和富集；
S12、关闭第一管路的阀门、恒流泵和第六管路的阀门，第一溶剂罐和第二溶剂罐中添加不同的洗脱溶剂，打开第二管路的阀门或第三管路的阀门，打开第四管路的阀门或第五管路的阀门，打开恒流泵，对吸附有效物质的层析柱进行梯度洗脱，得到初级纯化的荷叶生物碱提取物。
作为优选方案，所述提取溶剂为水、酸性水溶液或无毒有机溶剂；所述洗脱溶剂为不同浓度的乙醇溶液或不同浓度的碱性乙醇溶液。
作为优选方案，所述步骤S2包括：
S21、采用反向色谱柱，以碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，根据色谱图分段收集洗脱液，将洗脱液采用液相色谱法进行检测，得到色谱图；
S22、若色谱图为单峰或杂峰较小，则将洗脱液浓缩得到荷叶生物碱单体；若色谱图存在除溶剂峰之外的多个色谱峰，则将该段洗脱液低温浓缩析出沉淀物，沉淀物再溶解，然后采用柱效更高的反向色谱柱进行步骤S21的梯度洗脱，直至检测色谱图为单峰或杂峰较小为止，将对应的洗脱液浓缩得到荷叶生物碱单体。
作为优选方案，所述以碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱过程中，乙腈在流动相中的占比梯度变化范围从10％提高至70％。
作为优选方案，所述反向色谱柱的类型为C18色谱柱，填料粒径≤80μm。
作为优选方案，所述步骤S2之后，还包括：分析确定荷叶生物碱单体的化学式。
本发明与现有技术相比，有益效果是：
(1)本发明的提纯系统，将渗漉罐和层析柱串联使得荷叶中有效物质的循环提取和富集同步进行，构建得到连续化工艺，效率更高，且提取试剂的用量节约50％以上，成本降低；
(2)本发明的精制工艺，分离度佳，能够得到多种高纯度的荷叶生物碱单体；
(3)本发明的提纯工艺绿色环保，适用各种植物的有效成分的提纯。
附图说明
图1是本发明实施例的荷叶生物碱单体的提纯系统的构架示意图；
图2是本发明应用例1的一次纯化的液相色谱图；
图3是本发明应用例1的一次纯化的10-19min组分液相检测图谱；
图4是本发明应用例1的一次纯化的19-27min组分液相检测图谱；
图5是本发明应用例1的一次纯化的19-27min组分质谱图；
图6是本发明应用例1的二次纯化的液相色谱图；
图7是本发明应用例1的二次纯化的34.5-36min组分液相检测图谱；
图8是本发明应用例1的二次纯化的34.5-36min组分质谱图；
图9是本发明应用例2的一次纯化的液相色谱图；
图10是本发明应用例2的二次纯化的液相色谱图；
图11是本发明应用例2的二次纯化的10.0-12.3min组分液相检测图谱；
图12是本发明应用例2的二次纯化的16.2-17.6min组分液相检测图谱；
图13是本发明应用例2的二次纯化的18.1-19.5min组分液相检测图谱；
图14是本发明应用例2的二次纯化的29.3-30.3min组分液相检测图谱；
图15是本发明应用例2的二次纯化的37.2-39.9min组分液相检测图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步解释说明。
本发明实施例的荷叶生物碱单体的提纯系统，包括渗漉罐、层析柱、恒流泵(简称泵)、溶剂罐1、溶剂罐2、收集罐1和收集罐2。
具体地，渗漉罐下端的出液口、溶剂罐1的出液口和溶剂罐2的出液口分别通过第一管路、第二管路和第三管路连接至恒流泵的进液口，恒流泵的出液口通过连通管路与层析柱上端的进液口连接；收集罐1、收集罐2和渗漉罐的进液口分别通过第四管路、第五管路和第六管路连接至层析柱下端的出液口。其中，第一管路安装阀门1、第二管路安装阀门2、第三管路安装阀门3、第四管路安装阀门4、第五管路安装阀门5、第六管路均安装阀门6，渗漉罐的上端和层析柱的上端分别安装排气阀1和排气阀2。
当打开阀门1和阀门6，其他阀门关闭，渗漉罐和层析柱形成回路，通过恒流泵，可以同步完成荷叶中有效物质的循环提取和有效物质的富集。在循环提取前，应先排空管路中的气体，具体操作如下：
粉碎后的荷叶先用适量提取溶剂浸润至溶胀，然后装入渗漉罐，根据实际需求补充提取溶剂；
打开排气阀1、排气阀2和阀门1，再打开恒流泵，当层析柱上端的管道出液后，打开阀门6，关闭排气阀2，当渗漉罐上端的管道出液后，关闭排气阀1；由此在渗漉罐与层析柱之间构成循环回路，从而同步完成荷叶中有效物质的循环提取和富集；
有效物质的循环提取和富集完成后，关闭阀门1、阀门6和恒流泵；在溶剂罐1和溶剂罐2中加入不同的洗脱溶剂，打开阀门2(或阀门3)和阀门4(或阀门5)，通过恒流泵，可以对吸附富集有效物质的层析柱进行梯度洗脱，实现分离纯化的效果。当洗脱梯度较多，溶剂罐1和溶剂罐2、收集罐1和收集罐2可以交替使用，也可以适当增加溶剂罐和收集罐，相应的管路和阀门也对应设置，即溶剂罐(或收集罐)与相应的管路、阀门一一对应。
本发明实施例的荷叶生物碱单体的提纯工艺，包括以下步骤：
(1)树脂预处理，用提取溶剂分散，湿法装柱(若树脂已装好并用其他溶剂保存，则先用纯水将树脂中的溶剂洗尽，再用适量的提取溶剂置换树脂中的水)；具体地，将树脂进行预处理并采用提取溶剂分散，湿法上层析柱；其中，提取溶剂为水、酸性水溶液或无毒有机溶剂。
(2)荷叶粗碎，加入适量50％乙醇溶液(1％盐酸)浸泡溶胀，一段时间后，装入渗漉罐，排气；打开阀门1和阀门6(其他阀门关闭)，打开恒流泵，以适合流速让渗漉液流经层析柱，有效物质被树脂吸附后，带有杂质的溶剂又回到渗漉罐，循环提取，直到荷叶原料中的大部分有效成分被提取，并被树脂填料吸附，关闭恒流泵、阀门1和阀门6；
(3)在溶剂罐1和溶剂罐2中依次加入所需的洗脱溶剂，打开阀门2、阀门4和恒流泵，调节适合的流速进行洗脱，洗脱液收集于收集罐1中；关闭阀门2、阀门4，打开阀门3、阀门5，进行下一梯度的洗脱和收集。若洗脱梯度较多时，溶剂罐1和溶剂罐2，收集罐1和收集罐2可交替使用；
(4)选取富集目标产物的馏分，浓缩、干燥，即得到初级纯化的荷叶生物碱提取物；
(5)以荷叶生物碱提取物为原料，采用制备液相法对其进行纯化制备荷叶生物碱单体。具体的制备液相法包括：采用C18色谱柱，以碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，根据色谱图分段收集洗脱液，将洗脱液采用液相色谱法进行检测，得到色谱图；
当色谱图为单峰或杂峰较小，则将洗脱液浓缩得到荷叶生物碱单体；
当色谱图存在多个色谱峰(排除溶剂峰)，则将该段洗脱液低温浓缩，除去大部分乙腈，该过程有沉淀析出，加少量DMSO溶解，再次采用填料粒径更小的C18色谱柱进行分离纯化(即以碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，根据色谱图分段收集洗脱液，将洗脱液采用液相色谱法进行检测，得到色谱图)，直至色谱图为单峰或杂峰较小为止，将对应的洗脱液浓缩得到荷叶生物碱单体。
应用例1：
本应用例的荷叶生物碱单体的提纯工艺，包括以下步骤：
(1)将AB-8大孔树脂进行预处理并采用50％乙醇溶液分散，湿法上柱；
(2)荷叶粗碎，用5倍50％乙醇溶液浸泡荷叶使其充分溶胀，将荷叶和溶剂一同装入渗漉罐，以3BV/h(以大孔树脂体积计算)流速，循环提取5h；然后以6倍50％乙醇除杂，再用10倍乙醇(70％)溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥，得到经初级纯化的荷叶生物碱提取物干品，纯度为25.15％；
(3)一次纯化
称取1.6g经大孔树脂纯化后的荷叶提取物，加入80mLDMSO，超声溶解10min后，进行抽滤，滤液采用制备液相法纯化，根据色谱图分段收集洗脱液。
色谱柱类型：Flash C18 40-60μm
Figure BDA0002926900970000061
330g
流速：70mL/min
双波长检测：检测波长270nm、220nm
流动相及梯度如表1所示：
表1流动相及梯度表
时间/min 流动相A 20mM碳酸氢铵/％ 流动相B乙腈/％
0 90 10
6 90 10
7 30 70
34 30 70
制备液相法得到的色谱图如图2所示，收集10-19min以及19-27min的洗脱液，进行液相检测，检测的条件如下：
检测方法：
色谱柱类型：C18，5μm，250mm
流速：1mL/min
检测波长：270nm
流动相及梯度如表2所示：
表2流动相及梯度表
时间/min 流动相A 20mM碳酸氢铵/％ 流动相B乙腈/％
0 90 10
30 40 60
40 30 70
45 30 70
检测结果如图3和4所示，10-19min的收集液的液相检测图谱中的杂峰较多，须进一步纯化；19-27min的收集液的组分色谱图的主峰面积占比96.11％，即组分较单一，直接浓缩冻干，即得荷叶生物碱单体，经UPLC-MSMS检测分析后确定该物质为荷叶碱C19H21NO2，如图5所示。
(4)二次纯化
将一次纯化10-19min的收集液在45℃旋蒸浓缩剩余约100mL，有结晶析出，加入200mLDMSO超声溶解，得到约300mL样品液，取30mL进样。
色谱柱类型：Innoval ODS-2 10μm
Figure BDA0002926900970000071
300*250mm
流速：30mL/min
双波长检测：检测波长270nm、220nm
流动相及梯度如表3所示：
表3流动相及梯度表
时间/min 流动相A 20mM碳酸氢铵/％ 流动相B乙腈/％
0 90 10
29 53.6 46.4
40 40 60
48 30 70
58 10 90
63 10 90
制备图谱如图6所示，根据色谱图分段收集洗脱液，具体分为22段，如表4所示。
表4收集分段时间表
序号 收集时间段/min 序号 收集时间段/min 序号 收集时间段/min
1 2.5-3.5 9 25.5-26 17 34.5-36
2 15-16 10 26.5-27 18 36-36.5
3 16-18 11 27.5-28 19 36.5-36.8
4 20.5-21.5 12 28.5-29.5 20 39.5-40
5 21.5-22.5 13 29.5-30 21 44.5-45.5
6 22.5-23 14 30.5-31 22 49.5-50
7 23-24.5 15 31.5-32
8 24.5-25.5 16 32.5-32.8
其中，如图7所示，34.5-36min收集的组分的杂峰较小，主峰面积占比98.48％，直接浓缩冻干，即得荷叶生物碱单体，经UPLC-MSMS检测分析后确定该物质为原荷叶碱C18H19NO2，如图8所示。
应用例2：
本应用例的荷叶生物碱单体的提纯工艺，包括以下步骤：
(1)将D-001CC大孔树脂进行预处理并采用50％乙醇溶液(1％盐酸)分散，湿法上柱；
(2)荷叶粗碎，用5倍1％盐酸水溶液浸泡荷叶使其充分溶胀，将荷叶和溶剂一同装入渗漉罐，以3BV/h(以大孔树脂体积计算)流速，循环提取5h；然后以6倍50％乙醇除杂，再用10倍1％氨水乙醇(70％)溶液洗脱，收集洗脱液，浓缩、干燥，得到经初级纯化的荷叶生物碱提取物干品，纯度为22.08％；
(3)一次纯化
称取200mg荷叶生物碱提取物干品，加入10mLDMSO，超声溶解10min后，进行抽滤，滤液采用制备液相法纯化，根据色谱图分段收集洗脱液。
色谱柱类型：Flash C18 20-35μm
Figure BDA0002926900970000091
20g两支串联
流速：25mL/min
双波长检测：检测波长为270nm、220nm
流动相及梯度如表5所示：
表5流动相及梯度表
时间/min 流动相A 20mM碳酸氢铵/％ 流动相B乙腈/％
0 90 10
6 90 10
6.1 30 70
19 30 70
制备图谱如图9所示，收集8-18min的洗脱液，30℃旋蒸浓缩，除去大部分乙腈，有析出，加少量DMSO溶解，过滤，直接取样检测。
检测方法如下：
色谱柱类型：C18，5μm，250mm
流速：1mL/min
检测波长：270nm
流动相及梯度如表6所示：
表6流动相及梯度表
Figure BDA0002926900970000092
Figure BDA0002926900970000101
(4)二次纯化
将一次纯化的8-18min的收集液浓缩后溶解过滤上样。
色谱柱类型：Innoval ODS-2 10μm
Figure BDA0002926900970000102
300*250mm
流速：30mL/min
双波长检测：检测波长270nm、220nm
流动相及梯度如表7所示：
表7流动相及梯度表
时间/min 流动相A 20mM碳酸氢铵/％ 流动相B乙腈/％
0 90 10
29 53.6 46.4
40 40 60
48 30 70
制备图谱如图10所示，分别取10.0-12.3min、16.2-17.6min、18.1-19.5min、29.3-30.3min、37.2-39.9min的收集液，进行液相检测，得到如图11～15的图谱，主峰面积占比分别为95.5％、91.1％、90.2％、100％、99.1％。经UPLC-MSMS检测分析后确定该物质为杏黄罂粟碱C19H23NO3、L-(-)-N-去甲亚美罂粟碱C18H21NO3、乌药碱C17H19NO3、原荷叶碱C18H19NO2、荷叶碱C19H21NO2。
收集各组分峰进行检测，将含量高峰接收液30℃旋蒸浓缩出乙腈，冻干，得到荷叶生物碱单体。
对比例：
与上述实施例的区别在于：采用传统提纯工艺，即无渗漉罐装置。
从工序、提取溶剂用量以及荷叶生物碱单体纯度及个数等多个维度对传统提纯工艺与本发明上述实施例的提纯工艺进行对比，对比结果如表8所示。
表8不同提纯工艺的对比结果
Figure BDA0002926900970000111
因此，本发明实施例的提纯系统及提纯工艺，将渗漉罐和层析柱串联使得荷叶中有效物质的循环提取和富集同步进行，构建得到连续化工艺，效率更高，且提取试剂的用量节约50％以上，成本降低；本发明实施例的精制工艺，分离度佳，能够得到多种高纯度(90％以上)的荷叶生物碱单体。
以上所述仅是对本发明的优选实施例及原理进行了详细说明，对本领域的普通技术人员而言，依据本发明提供的思想，在具体实施方式上会有改变之处，而这些改变也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种荷叶生物碱单体的提纯工艺，其特征在于，包括以下步骤：
S1、应用荷叶生物碱单体的提纯系统对粉碎后的荷叶进行提纯处理，得到初级纯化的荷叶生物碱提取物；
所述荷叶生物碱单体的提纯系统包括渗漉罐、层析柱、恒流泵、第一溶剂罐、第二溶剂罐、第一收集罐和第二收集罐，渗漉罐的出液口、第一溶剂罐和第二溶剂罐分别通过第一管路、第二管路和第三管路连接至恒流泵的进液口，恒流泵的出液口通过连通管路与层析柱的进液口连接；第一收集罐、第二收集罐和渗漉罐的进液口分别通过第四管路、第五管路和第六管路连接至层析柱的出液口；所述渗漉罐和层析柱，以及第一管路、第二管路、第三管路、第四管路、第五管路和第六管路均安装阀门；所述第一溶剂罐和/或第二溶剂罐和/或第一收集罐和/或第二收集罐的数量有多个，相应的管路及其上安装的阀门分别对应设置；
S2、采用制备液相法对荷叶生物碱提取物进行纯化，得到荷叶生物碱单体。
2.根据权利要求1所述的提纯工艺，其特征在于，所述步骤S1包括：
S11、将粉碎后的荷叶浸泡在提取溶剂中至溶胀，然后将荷叶和提取溶剂装入渗漉罐，打开第一管路的阀门、恒流泵和第六管路的阀门，进行有效物质的循环提取和富集；
S12、关闭第一管路的阀门、恒流泵和第六管路的阀门，第一溶剂罐和第二溶剂罐中添加不同的洗脱溶剂，打开第二管路的阀门或第三管路的阀门，打开第四管路的阀门或第五管路的阀门，打开恒流泵，对吸附有效物质的层析柱进行梯度洗脱，得到初级纯化的荷叶生物碱提取物。
3.根据权利要求2所述的提纯工艺，其特征在于，所述提取溶剂为水、酸性水溶液或无毒有机溶剂；所述洗脱溶剂为不同浓度的乙醇溶液或不同浓度的碱性乙醇溶液。
4.根据权利要求1-3任一项所述的提纯工艺，其特征在于，所述步骤S2包括：
S21、采用反向色谱柱，以碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱，根据色谱图分段收集洗脱液，将洗脱液采用液相色谱法进行检测，得到色谱图；
S22、若色谱图为单峰或杂峰较小，则将洗脱液浓缩得到荷叶生物碱单体；若色谱图存在除溶剂峰之外的多个色谱峰，则将该段洗脱液低温浓缩析出沉淀物，沉淀物再溶解，然后采用柱效更高的反向色谱柱进行步骤S21的梯度洗脱，直至检测色谱图为单峰或杂峰较小为止，将对应的洗脱液浓缩得到荷叶生物碱单体。
5.根据权利要求4所述的提纯工艺，其特征在于，所述以碳酸氢铵水溶液和乙腈为流动相进行梯度洗脱过程中，乙腈在流动相中的占比梯度变化范围从10%提高至70%。
6.根据权利要求4所述的提纯工艺，其特征在于，所述反向色谱柱的类型为C18色谱柱，粒径≤80 μm。
7.根据权利要求4所述的提纯工艺，其特征在于，所述步骤S2之后，还包括：分析确定荷叶生物碱单体的化学式。
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