CN103159807A - 一种桑枝提取物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高纯度桑枝提取物及其制备方法，其主要工艺步骤如下：选取桑枝原料，采用水或乙醇-水混合溶媒进行提取，提取液采用大孔树脂进行精制，乙醇-水混合溶媒进行梯度洗脱，浓缩，干燥，分别获得相应桑皮苷A精制提取物、桑皮黄素精制提取物；所得精制提取物再采用加压柱色谱，以以碳十八改性硅胶为填料，适宜甲醇-水为流动相进行分离，分别收集含有桑皮苷A、桑皮黄素的流份，浓缩，干燥，分别获得纯度大于80％的桑皮苷A成品、桑皮黄素成品。本发明产品纯度高，抗氧化活性好，可应用于相关食品和药品领域；制备方法和工艺简洁、易于实现产业化放大，可实现植物资源的综合利用。

Description

一种桑枝提取物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种桑枝提取物及其制备方法，属药品和保健食品领域。

技术背景

桑科植物桑(Morus alba L.)是中国蚕桑养植的重要特色经济作物，桑同时也是常用中药，桑白皮(根部)、桑枝(干燥嫩枝)、桑叶都具有不同药用功效，其中桑枝具有祛风湿、利关节、行水之功效，用于风寒湿痹、四肢拘挛、脚气浮肿之病症。现代药理学已经证实桑枝具有降血糖、降血压、抗菌、抗病毒、祛风清热、凉血明目等功效(周吉银等，桑的不同药用部位药理作用研究进展，中国新药与临床杂志，2009，28(12)：895-899)。桑白皮和桑枝中主要活性成分包括桑皮黄素等黄酮衍生物类，桑皮苷A和白藜芦醇等二苯乙烯苷类，1-脱氧野尻霉素等生物碱类，以及多糖类等成分，其中二苯乙烯类和黄酮类成分具有抗氧化、抗炎等多种药理活性，生物碱类具有降糖活性，在降血脂、抗衰老、抑制肿瘤等方面具有应用价值。

近来关于桑枝提取工艺方面的相关研究主要集中于我国。周林等(桑枝皮总黄酮提取工艺条件的优化试验，蚕业科学，2010，36(3)：0491-0495)确定了桑枝皮总黄酮提取的乙醇回流提取工艺条件，总黄酮的提取率可达1.01％。伍春(桑枝中桑皮苷A的分离纯化工艺及其活性研究，西南大学硕士研究生论文，2012)对桑枝中桑皮苷A的提取分离工艺进行了优化，采用水提、D101树脂精制、聚酰胺树脂纯化的工艺路线，获得桑皮苷A(含量76.9％)。采用阳离子交换等工艺制备1-脱氧野尻霉素等生物碱也有文献报道(李平平等，桑中1-脱氧野尻霉素及其衍生物的研究进展，中草药，2010，41(11)：1921-1924)。

对桑枝中有效成分的制备工艺已受到人们关注，现有文献对其中的总黄酮、白藜芦醇、生物碱等成分制备工艺均分别有报道。文献报道采用硅胶柱色谱、反相硅胶柱高压制备等多种方法和步骤进一步分离纯化桑皮苷A和桑皮黄素单体，但工艺步骤繁杂、产品回收率低、成本高，难以实现生产。充分利用药材资源，探索可行的产业化生产工艺，实现桑枝中各有效部位的综合提取分离和综合利用，是目前有待解决的关键技术问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种高纯度的桑枝提取物。

本发明同时提供制备桑枝提取物的方法，包括以下步骤：

(1)选取桑枝原料，采用水或醇-水混合溶剂进行提取，提取液合并，浓缩，过滤，得桑枝提取液；

(2)由(1)所得桑枝提取液，采用预处理好的大孔树脂进行吸附，再用乙醇-水混合溶媒按0-10％、20-50％、60-95％乙醇梯度洗脱，分别收集20-50％、60-95％乙醇洗脱部位洗脱液，浓缩，干燥，分别获得相应桑皮苷A精制提取物、桑皮黄素精制提取物；

(3)由(2)所得桑皮苷A、桑皮黄素精制提取物，分别采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜甲醇一水为流动相进行分离，分别收集含有桑皮苷A、桑皮黄素的流份，浓缩，干燥，分别获得高纯度的桑皮苷A成品、桑皮黄素成品。

所述工艺步骤(1)中所述桑枝来自桑树品种中的任意一种，所述原料部位为桑树嫩枝或伐条后的枝条，其中优选伐条后的枝条。所述提取溶剂优选乙醇-水提取，其中优选60-95％乙醇提取。所述提取方法可根据公开文献报道，选用回流提取、超声提取、微波辅助提取、逆流提取中的任意一种。

所述工艺步骤(2)中，所述大孔树脂为苯乙烯系或丙烯酸系树脂，其中优选非极性或弱极性苯乙烯系大孔树脂。选用乙醇-水混合溶媒进行梯度洗脱，优选按0-10％、25-45％、65-90％乙醇梯度洗脱。所述桑皮苷A精制提取物、桑皮黄素精制提取物中，相应桑皮苷A、桑皮黄素含量采用液相检测均大于30％。

所述工艺步骤(3)中所述加压柱色谱为低压或中压柱色谱，检测方式优选在线紫外检测。所述填料为碳十八改性硅胶，所述流动相为甲醇-水，其中桑皮苷A精制提取物的流动相优选15-25％比例，洗脱方式优选等度洗脱；桑皮黄素精制提取物的流动相优选65-75％比例，洗脱方式优选等度洗脱。所述桑皮苷A成品、桑皮黄素成品中相应桑皮苷A、桑皮黄素含量均大于80％。

本发明通过高纯度桑枝提取物的工艺研究，所完成的制备技术路线有以下特色和优势：(1)药材原料可选用各种桑树品种枝条，包括伐条后废弃的枝条，扩大和丰富了植物资源的有效综合利用；(2)采用优选的大孔树脂梯度洗脱工艺，同时获得了富含桑皮苷A、桑皮黄素的组份；(3)应用加压柱色谱工序，实现了高纯度单体成分纯化工序的自动化和可操作性，成功获得纯度大于80％的成品。本发明工艺路线经济合理、效率高、能耗低，可实现植物资源的充分利用，溶剂便于回收和循环利用，容易实现工业化生产。

本发明同时对各工序提取物的抗氧化作用进行了考察。结果表明，各提取物样品对DPPH和ABTS自由基均有一定程度清除能力。其中桑皮苷A和桑皮黄素的抗氧化作用均强于对应的精制提取物，桑皮苷A的抗氧化作用与维生素C相近；表明该两种成分是其主要抗氧化活性成分。结果表明，所述桑枝提取物均具有较好的抗氧化活性，可以根据使用需要应用于不同的功能食品和药品中。

本发明内容是通过大量实验研究和工艺优化分析完成的，以下述具体实施例进行说明。

附图说明

图1为采用本发明从桑枝中提取的桑皮苷A提取物MA-1。图中，色谱峰1为桑皮苷A。

图2为采用本发明从桑枝中提取的桑皮黄素提取物MA-2。图中，色谱峰2为桑皮黄素。

具体实施方式

本发明所述的桑枝提取物是按以下实施例所表示的方法制造，所涉及到的方法是本领域的技术人员能够掌握和运用的技术手段。但以下实施例不得理解为任何意义上的对本领域发明权利要求的限制。

实施例1：大孔树脂制备工艺考察

取500g桑枝样品，剪碎，加入75％的乙醇5L，回流提取2次，每次2h，滤过，合并滤液，减压浓缩至300mL(1.6g生药/mL)，备用。液相色谱测得桑皮苷A和桑皮黄素含量分别为1.032、0.1486mg/mL。检测色谱条件：ODS色谱柱(4.6×250mm)；流动相为乙腈-1％醋酸水溶液(0-15min7％乙腈，15-30min7％-43％乙腈，30-45min43％乙腈，45-50min43％-70％乙腈，50-55min70％-7％乙腈)，检测波长303nm，柱温30℃，进样量为20μL。

(1)静态吸附与解吸附实验筛选树脂：取9种大孔树脂AB-8、D101、LX-17、LX-28、LX-38、LX-60、LX-68G、LX-8和HP-20大孔树脂，按树脂干重计各取1.0g，95％乙醇浸泡过夜，水洗3次，放入50mL具塞锥形瓶内，加桑枝提取液25mL于恒温振荡箱内25℃、180prm条件下振荡6h，将吸附后的桑枝提取液真空抽滤，液体取样检测。吸附好的树脂水洗三次，加25mL95％乙醇相同条件下恒温振荡6h，进行解吸附。液相检测吸附前后桑皮苷A、桑皮黄素含量变化，比较不同树脂的吸附与解吸附能力。

通过计算吸附量与解吸率来评价树脂。吸附量(1.1)和解吸率计算公式(1.2)为：

(1.1)q_e＝(C₀-C_e)V_i/W

(1.2)D＝C_dV_d/(C₀-C_e)V_i×100％

式(1.1)中，q_e为树脂吸附量(mg/g)，C₀溶液初始浓度，C_e吸附饱和后溶液浓度，V_t为样品体积，W为树脂干重。式(1.2)中D为解吸率，C_d为解吸附后洗脱液待测成分的浓度，V_d为洗脱液体积，C₀、C_e、V_i与上同。

结果：九种树脂对桑皮苷A和桑皮黄素都有不同程度的吸附与解吸附，但各树脂差别较大，其中非极性和弱极性大孔树脂吸附和解吸附率参数较高。综合比较，以苯乙烯系弱极性树脂AB-8的解吸率较好，进一步进行动态法考察。实验结果参见表1。

表1各型号树脂对桑皮苷A和桑皮黄素的最大吸附量和解吸率

(2)动态法比较树脂分离效果：根据静态法实验结果，取预处理好的AB-8树脂(干重4.00g)装柱，加入桑枝提取液提取液(1.6g生药/mL)，依次用水，15％乙醇、30％乙醇、40％乙醇、50％乙醇、60％乙醇、70％乙醇、80％乙醇、90％乙醇洗脱4BV，HPLC检测桑皮苷A、桑皮黄素在各洗脱部位的分布情况。

结果：当乙醇浓度为40％时，大部分桑皮苷A可被洗脱；当乙醇浓度为90％时，大部分桑皮黄素可被洗脱。综合考虑，选用20-50％乙醇洗脱桑皮苷A组分，选用60-95％乙醇洗脱桑皮黄素组分。

(3)放大实验：称取1500g桑枝，提取后浓缩至1.5L，加入含AB-8树脂1.2kg的玻璃柱中，柱体积为1.5L。吸附平衡后，依次用水5L，40％乙醇6L，95％乙醇10L洗脱。分别收集40％、95％两组洗脱液，浓缩，干燥，分别获得MA-1(2.3g，桑皮苷A含量40.47％)和MA-2(0.28g，桑皮黄素含量43.81％)，回收率分别为86.47％，91.63％。HPLC图谱见附图1和2。

实施例2中压柱制备桑皮苷A和桑皮黄素

(1)桑皮苷A的制备：经预实验分析，桑皮苷A的流动相适宜洗脱比例为15-25％甲醇，优选20％甲醇等度洗脱。将反相硅胶(40μm，0.8kg)采用干法装柱装入中压柱(400mm×70mmi.d.)，用20％甲醇平衡柱子。取MA-12.5g，溶于25mL甲醇后进样，用20％甲醇洗脱，流速25mL/min，检测波长为303nm。收集对应桑皮苷A的峰并用HPLC检测。

(2)桑皮黄素的制备：经预实验分析，桑皮黄素的流动相适宜洗脱比例为65-75％甲醇，优选68％甲醇等度洗脱。取MA-20.28g，溶于25mL甲醇后上样，用68％甲醇洗脱，流速25mL/min，检测波长为303nm。收集对应桑皮黄素的峰并用HPLC检测。

(3)结果：分别获得桑皮苷A(0.75g，含量90.2％)和桑皮黄素(0.12g，含量95.3％)，回收率为73.1％和80.5％。

实验例1：桑枝提取物组分抗氧化活性研究

(1)二苯代苦味酰肼(DPPH)法：取配好的0.04％DPPH乙醇溶液5mL中，加入1mL各浓度的样品溶液，室温避光反应30min后用分光光度计测定517nm处吸光度A_i，维生素C作对照。按下列公式计算各样品对DPPH自由基的清除率：

DPPH自由基清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％

根据清除率曲线计算半数清除率(IC₅₀)，结果见表2。

(2)2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)(ABTS)法：将配制好的ABTS溶液与K₂S₂O₈均匀混合，在室温下置于暗处过夜(14h)。将生成的ABTS^·+溶液用乙醇稀释，使其在30℃、734nm波长下的吸光度为0.70±0.02，即得到ABTS^·+工作液。在试管中加入0.3mL的样品溶液，再加入6.0mL的ABTS^·+工作液，混合，30℃静置6min，在734nm处测吸光值为A₁。根据不同浓度样品溶液对ABTS^·+的清除率作图。

清除率(％)＝[1-(A_i-A_j)/A₀]×100％

其中，A₀未加样品时的吸光值；A_i为加入样品后溶液的吸光值；A_j为样品溶液的吸光值。根据清除率曲线计算半数清除率(IC₅₀)。

(3)结果：参见表2。

表2各样品对DPPH的半数清除率(IC₅₀，mg/mL)

各样品对DPPH和ABTS自由基均有一定程度清除能力。其中桑皮苷A和桑皮黄素的抗氧化作用均强于对应的MA-1和MA-2提取物，桑皮苷A的抗氧化作用与维生素C相近；表明该两种成分是其主要抗氧化活性成分。

Claims (10)

1.一种桑枝提取物的制备方法，其特征在于所述桑枝提取物的制备方法如下：

(1)选取桑枝原料，采用水或醇-水混合溶剂进行提取，提取液合并，浓缩，过滤，得桑枝提取液；

(2)由(1)所得桑枝提取液，采用预处理好的大孔树脂进行吸附，再用乙醇-水混合溶媒按0-10％、20-50％、60-95％乙醇梯度洗脱，分别收集20-50％、60-95％乙醇洗脱部位洗脱液，浓缩，干燥，分别获得相应桑皮苷A精制提取物、桑皮黄素精制提取物；

(3)由(2)所得桑皮苷A、桑皮黄素精制提取物，分别采用加压柱色谱，以碳十八改性硅胶为填料，适宜甲醇-水为流动相进行分离，分别收集含有桑皮苷A、桑皮黄素的流份，浓缩，干燥，分别获得高纯度的桑皮苷A成品、桑皮黄素成品。

2.根据权利要求1所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于制备方法步骤(1)中所述桑枝原料为桑树嫩枝或伐条后的枝条，其中优选伐条后的枝条。

3.根据权利要求1所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(1)中所述提取溶剂优选乙醇-水提取，其中优选60-95％乙醇提取。

4.根据权利要求1所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于制备方法步骤(2)中所述大孔树脂为苯乙烯系树脂，其中优选非极性或弱极性大孔树脂。

5.根据权利要求4所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(2)中乙醇-水混合溶媒优选按0-10％、25-45％、65-90％乙醇梯度洗脱。

6.根据权利要求4所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(2)中所述桑皮苷A精制提取物、桑皮黄素精制提取物中相应桑皮苷A、桑皮黄素含量均大于30％。

7.根据权利要求1所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述加压柱色谱为低压或中压柱色谱，检测方式优选在线紫外检测。

8.根据权利要求7所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述桑皮苷A精制提取物的流动相优选15-25％比例，洗脱方式优选等度洗脱。

9.根据权利要求7所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述桑皮黄素精制提取物的流动相优选65-75％比例，洗脱方式优选等度洗脱。

10.根据权利要求7所述桑枝提取物的制备方法，其特征在于其制备方法步骤(3)中所述桑皮苷A成品、桑皮黄素成品中相应桑皮苷A、桑皮黄素含量均大于80％。

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