CN115819504A

CN115819504A - 鲟鱼功能性多肽及其应用

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Publication number: CN115819504A
Application number: CN202211351894.XA
Authority: CN
Inventors: 尚楠; 武瑞赟; 李平兰; 穆文强; 高博雅
Original assignee: China Agricultural University
Current assignee: China Agricultural University
Priority date: 2022-10-31
Filing date: 2022-10-31
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-10-31
Also published as: CN115819504B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及鲟鱼功能性多肽及其应用。本发明提供的功能性多肽为以下1)或2)中所述的多肽：1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；2)在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽的N端和/或C端添加蛋白标签得到的多肽。该功能性多肽具有较高的抗肿瘤、抗炎、促进骨细胞增殖、分化活性，可用于具有上述功能的药物的制备，具有制备过程简单、得率高的优势，应用价值较好，且有利于实现鲟鱼软骨的高值化利用，提高鲟鱼原料的利用率。

Description

鲟鱼功能性多肽及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及从鲟鱼软骨中提取的功能性多肽及其应用。

背景技术

氨基酸(Amino acid)是构成蛋白质的基本单位，赋予蛋白质特定的分子结构形态，使其具有特定的生理生化活性，氨基酸和蛋白质在体内具有特殊的生理功能，是生物体内不可缺少的营养成分之一。多肽是一类由多种氨基酸组成的具有特殊生理功能的活性物质。功能性多肽是具有特定生物活性多肽，具有易于吸收、易于加工、低致敏性、低渗透压等特点，在食品、医药、化妆品等领域具有重要的应用价值。以动物加工副产品为原料开发功能性多肽对于提高动物原料的利用率和促进人类健康具有重要的意义。

发明内容

本发明的第一目的在于提供从鲟鱼软骨中提取的功能性多肽。

本发明的第二目的在于提供上述功能性多肽的应用。

本发明的第三目的在于提供含有上述功能性多肽的产品。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供功能性多肽，所述多肽为以下1)或2)中所述的多肽：

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；

2)在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽的N端和/或C端添加蛋白标签得到的多肽。

以上所述的SEQ ID NO.1所示的序列具体如下：

SEQ ID NO.1：LNGTDPEDVIR。

以上所述的蛋白标签可为任意的蛋白标签，包括但不限于His、Flag、GST、c-Myc、eGFP/eCFP/eYFP/mCherryeGFP、HA、SUMO标签等。所述多肽的N端和C端携带的蛋白标签可以相同也可以不同。

本发明经实验验证证明，以上所述的功能性多肽具有较高的抗肿瘤、抗炎和促进骨细胞增殖、分化的活性。

上述功能性多肽可为从鲟鱼软骨中分离得到的纯天然小分子活性肽。

第二方面，本发明提供编码所述功能性多肽的核酸分子。

第三方面，本发明提供包含所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

其中，所述表达盒为将所述核酸分子与转录或翻译调控元件可操作性地连接得到的重组核酸分子。

所述载体包括但不限于质粒载体、病毒载体、转座子。

所述宿主细胞包括微生物细胞(例如：大肠杆菌、酵母等)或动物细胞或细胞系。

第四方面，本发明提供以上所述的功能性多肽或所述核酸分子或所述生物材料在制备食品或药物中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述药物具有抗肿瘤、抗炎和/或促进骨细胞增殖、分化功能。

本发明还提供所述功能性多肽或所述核酸分子或所述生物材料在制备具有抗肿瘤功能的产品中的应用。

本发明还提供所述功能性多肽或所述核酸分子或所述生物材料在制备具有抗炎功能的产品中的应用。

本发明还提供所述功能性多肽或所述核酸分子或所述生物材料在制备具有促进骨细胞增殖、分化功能的产品中的应用。

以上所述的产品优选为药物。

本发明还提供所述功能性多肽或所述核酸分子或所述生物材料在非治疗目的的促进骨细胞增殖、分化中的应用。

第五方面，本发明提供一种产品，所述产品含有所述功能性多肽。

优选地，所述产品为具有抗肿瘤功能、抗炎功能和/或促进骨细胞增殖、分化功能的药物。

以上所述的药物优选以所述功能性多肽作为活性成分。

除所述功能性多肽以外，所述药物还可包含其他活性成分，或者包含药学领域允许的辅料。

第六方面，本发明提供一种鲟鱼软骨肽，所述鲟鱼软骨肽采用包括以下步骤的方法制备得到：将鲟鱼软骨经两步酶解制得酶解物，将所述酶解物进行功能性多肽的分离和纯化；

所述两步酶解中，第一步酶解使用碱性蛋白酶，第二步酶解使用软骨素裂解酶；

所述鲟鱼软骨肽含有功能性多肽，所述功能性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述鲟鱼软骨肽中，所述功能性多肽的质量百分含量为9-12％。

进一步优选地，所述鲟鱼软骨肽中，所述功能性多肽的质量百分含量为9-10％。

上述分离纯化包括凝胶层析色谱分离和反相高效液相色谱分离。

优选地，所述鲟鱼软骨肽的制备方法包括：将鲟鱼软骨粉碎后，以水混合，调至pH为6.9-7.2，与碱性蛋白酶混合后酶解处理3.5-4.5h，经灭酶处理后，再与软骨素裂解酶混合，酶解处理2.5-3.5h后，进行灭酶处理，经固液分离取上清液进行乙醇沉淀处理，经固液分离取上清液后，对乙醇沉淀分离的上清液进行凝胶层析色谱分离；将经凝胶层析分离收集的组分进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离。

上述方法中，反相高效液相色谱的色谱条件如下：

流动相A：超纯水(含0.1％三氟乙酸)；

流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；

进样量：50μL；

样品浓度：5mg/mL；

检测波长：280nm；

洗脱程序：0-5min，流动相B为0％；5-10min，流动相B从0％到20％；10-45min流动相B从20％到45％；45-65min流动相B从45％回到20％；利用自动馏分收集器收集28.5-29.5min(优选28.98min)的馏分。

上述收集的馏分还可经浓缩后进行冷冻干燥制成冻干产品。

上述方法中，碱性蛋白酶的用量优选为100-200IU/g鲟鱼软骨，和/或，软骨素裂解酶的用量优选为150-250IU/g鲟鱼软骨。

上述方法中，固液分离优选采用离心分离。

上述方法中，乙醇沉淀的条件为于2-4℃沉淀，时间优选为8-15h。

本发明的有益效果在于：本发明提供的功能性多肽具有较高的抗肿瘤、抗炎、促进骨细胞增殖、分化活性，可用于具有上述功能的药物的制备，具有制备过程简单、得率高的优势，具有较好的应用价值，且有利于实现鲟鱼软骨的高值化利用，提高鲟鱼原料的利用率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中的鲟鱼软骨多肽的质谱Basepeak图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1功能性多肽的获得

1、鲟鱼软骨活性肽的制备

将鲟鱼软骨清洗干净，冷冻干燥后磨粉，按照1:25的比例加入水后，调pH至7，按照150IU/g鲟鱼软骨的用量加入碱性蛋白酶，酶解4h，灭酶后按照200IU/g鲟鱼软骨的用量加入软骨素裂解酶，酶解3h后，100℃灭酶处理后，10000r/min离心15min后取上清液，添加3倍体积的无水乙醇后，4℃醇沉过夜后，10000r/min离心15min后取上清液进行分离、浓缩、冷冻干燥，得到鲟鱼软骨富含氨基酸活性肽混合物，得率为64.38％。

2、凝胶层析色谱分离

取5mL鲟鱼软骨富含氨基酸活性肽混合物加入到SephadexG-15凝胶层析柱中，持续用去离子水洗脱凝胶柱(流速为1.0mL/min)。并依据在280nm下观测的洗脱曲线峰收集每个组分，将收集到的各组分冷冻干燥并评估其功能活性(功能活性的评估方法同实施例2-4)。

其中，上述收集的组分1-4的抗炎活性、肿瘤细胞增殖抑制率和促进骨细胞增殖活性如表1所示。

表1

3、反相高效液相色谱(RP-HPLC)分离

使用RP-HPLC在Kromasil 100-5-C18半制备柱上进一步纯化凝胶层析色谱获得的组分。色谱条件如下所示：

流动相A：超纯水(含0.1％三氟乙酸)；

流动相B：乙腈(含0.1％三氟乙酸)；

进样量：50μL；

样品浓度：5mg/mL；

检测波长：280nm；

洗脱程序：0-5min，流动相B为0％；5-10min，流动相B从0％到20％；10-45min，流动相B从20％到45％；45-65min，流动相B从45％回到20％。

利用自动馏分收集器收集各洗脱峰的馏分，然后冻干。各组分比例和活性(活性的评估方法同实施例2-4)如表2所示。

表2

4、LC-MS/MS分析

取上述反相高效液相色谱分离获得的各组分样品适量，使用纳升流速Easy nLC1200色谱系统(Thermo Scientific)进行色谱分离。缓冲液：A液为0.1％甲酸水溶液，B液为含0.1％甲酸的乙腈和水混合溶液(其中乙腈占比80％)。色谱柱以100％的A液平衡。样品进样到Trap Column(100μm*20mm,5μm，C18，Dr.Maisch GmbH)后经过色谱分析柱(75μm*150mm,3μm，C18，Dr.Maisch GmbH)进行梯度分离，流速为300nl/min。液相分离梯度如下：0分钟～2分钟，B液线性梯度从2％到5％；2分钟～44分钟，B液线性梯度从5％到28％；44分钟～51分钟，B液线性梯度从28％到40％；51分钟～53分钟，B液线性梯度从40％到100％；53分钟～60分钟，B液维持在100％。

肽段分离后用Q-Exactive HF-X质谱仪(Thermo Scientific)进行DDA(数据依赖采集)质谱分析。分析时长为60min，检测模式：正离子，母离子扫描范围：350-1800m/z，一级质谱分辨率：60,000@m/z 200，AGC target：3e6，一级Maximum IT：50ms。肽段二级质谱分析按照下列方法采集：每次全扫描(full scan)后触发采集20个最高强度母离子的二级质谱图谱(MS2 scan)，二级质谱分辨率：15,000@m/z 200，AGC target:1e5，二级Maximum IT：50ms，MS2Activation Type:HCD，Isolation window：1.6m/z，Normalizedcollisionenergy：28。

多肽的质谱Basepeak如图1所示。

经上述分离纯化和鉴定，获得多条序列、分子量和性质不同的多肽，对这些多肽进行功能分析，筛选具有抗肿瘤、抗炎、促进骨细胞增殖分化的功能性多肽。筛选得到的具有较高的抗肿瘤、抗炎、促进骨细胞增殖分化活性的多肽的序列如表3所示，作为示例，表3中还列举了部分活性较差的多肽及其序列。

表3

序列编号	肽段序列
		SEQ ID NO.2	IGGIGTVPVGR
SEQ ID NO.1	LNGTDPEDVIR

实施例2功能性多肽的抗肿瘤活性(肿瘤细胞增殖抑制率)检测

对序列如SEQ ID NO.1和2所示的多肽进行抗肿瘤活性(肿瘤细胞增殖抑制率)检测，MTT活性检测方法和结果如下：

1、实验材料

人肺癌细胞株A549。

2、细胞培养

从液氮中取出冻存的细胞，遵从慢冻快融的原则，立即放入37℃水浴锅，迅速摇动两分钟，使其尽快融化。按标准操作规程将细胞转移到培养瓶中。在DMEM培养基中加入10％胎牛血清，1‰青霉素、链霉素得到完全培养基，细胞生长于完全培养基中，二氧化碳细胞培养箱中37℃培养。细胞长满80％以上汇合度时，胰酶消化，传代培养。

3、细胞传代

(1)细胞贴壁生长后，24h更换DMEM培养液一次；

(2)吸去原培养液；PBS缓慢冲洗2次，避免血清对胰蛋白酶的消化效率的影响；

(3)添加1mL 0.25％的胰蛋白酶消化A549细胞；

(4)显微镜下观察细胞形态，防止消化过度；

(5)加入新鲜DMEM培养液终止消化，缓慢多次吹打成分散单细胞，稀释后分装。

4、细胞增殖检测

肺癌细胞A549分别以5×10⁴cell/mL密度加入96孔板中，二氧化碳培养箱静置培养，贴壁过夜；弃去原细胞培养液，每孔加入等体积的相同浓度的多肽样品溶液(200μg/mL)，另设对照组(与多肽组相比，不添加多肽样品)和空白组(不含细胞和多肽样品)，每个浓度设6个平行，继续培养24h后，向每个孔中添加10μL的CCK-8，37℃避光反应；酶标仪测定A450值，并按以下公式计算：

根据细胞存活率计算抗肿瘤活性：肿瘤细胞增殖抑制率＝(1-细胞存活率)×100％。

各多肽组的抗肿瘤活性的检测结果如表4所示。

表4

序列编号	肿瘤细胞增殖抑制率
		SEQ ID NO.2	-20.38％
SEQ ID NO.1	62.03％

实施例3功能性多肽的抗炎活性检测

对序列如SEQ ID NO.1和2所示的多肽进行抗炎活性检测，具体方法和结果如下：

使用C57小鼠，对小鼠灌胃相同浓度的不同多肽样品连续2周后，采用眼眶采血法收集小鼠全血。采用ELISA试剂盒测定小鼠血清中NO、抗炎症因子IL-10、促炎症因子IL-1β的表达水平，具体实验步骤按照试剂盒说明书操作。

(1)制备血清样品：取全血并置于1.5mL离心管中，室温下静置2h，1000g离心15min收集血清转移至新离心管中，-80℃保存备用。

(2)ELISA：使用稀释液配置不同浓度梯度的标准品。实验设置有标准品孔、待测样本孔和空白对照孔，标准品孔中每孔添加50μL不同浓度标准品进行标准曲线的建立；使用稀释液对待测多肽样品进行5倍稀释，使用稀释液作为空白对照，然后取样品/待测液50μL缓慢滴加至96孔酶标板孔底部，每孔加入100μL的酶标试剂，避光37℃恒温孵育60min后，吸取并弃去孔板中液体，甩干后再向每孔中加入200μL洗涤液，静置30s后甩干弃去洗涤液，重复上述洗涤步骤5次，晾干后每孔加入50μL显色剂A和50μL显色剂B，置于摇床上低速震荡混合均匀，37℃避光反应15min后，加入等体积终止液终止反应，使用空白孔对酶标仪进行调零后，测定样品在450nm波长的吸光度值并记录。

结果如表5所示。

表5

实施例4功能性多肽促进骨细胞增殖和分化活性检测

对序列如SEQ ID NO.1和2所示的多肽进行促进骨细胞增殖、分化活性检测，具体方法和结果如下：

1、细胞培养：

MC3T3-E1成骨细胞传代后贴壁生长至融汇率达到80-90％进行下一次传代，采用0.25％胰蛋白酶(无EDTA)进行消化，待细胞状态良好时以2×10⁴cell/cm²密度接到100×100mm的培养皿或六孔板中培养24-72h，进行传代和备用。

2、细胞增殖实验：

成骨细胞状态良好时进行传代并计数，按照4×10⁴密度将细胞接种于96孔细胞培养板中，完全培养基中培养24h后，弃原培养基加入无血清培养基饥饿细胞，37℃、5％CO₂培养12h后分别加入相同浓度的不同多肽样品，同时设置空白对照组，每个处理组设5个平行，培养36h后，向每个孔中添加10μL的CCK-8，37℃避光反应；酶标仪测定A450值，并按以下公式计算：

3、促进骨细胞分化——碱性磷酸酶(ALP)活性的测定：

前成骨细胞系MC3T3-E1以2×10⁴cell/cm²的密度接种于24孔细胞培养板，正常培养2天至细胞融合度达到90％，更换分化培养基并隔天换液，连续培养4天后(即接板后的第7天)换无血清培养基培养过夜，分别加入相同浓度的不同多肽样品处理细胞，培养24h，其中对照组不做任何处理；去除原培养基，4℃预冷的PBS洗涤细胞3次，在冰上加入细胞裂解液并用细胞刮刀刮下细胞，移液枪反复吹打使细胞分散，细胞超声破碎仪处理细胞1min，12000rpm、4℃离心10min，取上清并测定蛋白质浓度。使用罗氏碱性磷酸酶诊断试剂盒测定各样品中ALP的活性，并用蛋白浓度校正结果，得到ALP活性，以空白对照组作为参照，计算各组相对空白对照组的倍数。

结果如表6所示。

表6

序列编号	骨细胞增殖率	ALP活性
			SEQ ID NO.2	26.07％	20.52％
SEQ ID NO.1	62.18％	56.53％

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims

1.功能性多肽，其特征在于，所述多肽为以下1)或2)中所述的多肽：

1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的多肽；

2.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的功能性多肽。

3.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求2所述的核酸分子；

所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

4.权利要求1所述的功能性多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备食品或药物中的应用。

5.权利要求1所述的功能性多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备具有抗肿瘤功能的产品中的应用。

6.权利要求1所述的功能性多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备具有抗炎功能的产品中的应用。

7.权利要求1所述的功能性多肽或权利要求2所述的核酸分子或权利要求3所述的生物材料在制备具有促进骨细胞增殖、分化功能的产品中的应用。

8.一种产品，其特征在于，所述产品含有权利要求1所述的功能性多肽。

9.根据权利要求8所述的产品，其特征在于，所述产品为具有抗肿瘤功能、抗炎功能和/或促进骨细胞增殖、分化功能的药物。

10.一种鲟鱼软骨肽，其特征在于，所述鲟鱼软骨肽采用包括以下步骤的方法制备得到：将鲟鱼软骨经两步酶解制得酶解物，将所述酶解物进行功能性多肽的分离和纯化；

所述鲟鱼软骨肽含有功能性多肽，所述功能性多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；