WO2014181769A1 - プラセンタ抽出物及びその製造方法 - Google Patents

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WO2014181769A1
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placenta
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広瀬　直宏
靖晃 伊東
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イビデン株式会社
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Definitions

  • the present invention relates to a placenta extract obtained by subjecting a placenta as a raw material to a subcritical process, and further relates to a method for producing a placenta extract in which a placenta extract can contain a high amount of a low molecular peptide. .
  • the placenta is the placenta of mammals and has been used as health foods, cosmetic materials and pharmaceuticals in recent years due to its excellent functionality. In order to exert excellent functionality, it has been generally required to lower the molecular weight and extract proteins in placenta to peptides having excellent absorbability and functionality. Conventionally, enzyme treatment has been used exclusively as a technique for solubilizing and reducing the molecular weight of placenta.
  • Patent Document 1 a yeast extract is added to a supernatant obtained by hydrolyzing a residue that is removed when a high-molecular protein such as a water-soluble protein is extracted from human placenta tissue with a protease.
  • a high-molecular protein such as a water-soluble protein is extracted from human placenta tissue with a protease.
  • the example that the melanin production inhibitor was obtained by adding was disclosed.
  • Patent Document 2 discloses an example in which a cosmetic composition containing a water-soluble component obtained by hydrolyzing pig and / or horse placenta by enzymatic treatment and a polyphenol derivative is obtained.
  • the present invention relates to a placenta extract obtained by subcritical treatment of placenta, preferably subcritical water treatment, and an aqueous solution containing the extract, and particularly relates to a high content of low molecular peptides.
  • the extraction process of protein components from placenta in the prior art requires a post-process of adding a processing aid in order to adjust the pH with the processing aid. Since a series of steps such as these enzyme treatments and addition of processing aids degrades peptides, which are active ingredients that exhibit functionality, free amino acids are increased due to peptide degradation. As the free amino acids increase, peptides as active ingredients in the extract are lost, and as a result, the functions such as antioxidants in the obtained extract may not be fully exhibited.
  • the present inventors have found characteristics of an extract obtained by treating the placenta with subcriticality and an aqueous solution containing the extract. It has been found that the aqueous solution containing a low molecular peptide having a molecular weight of 3000 or less contains a high proportion.
  • the gist of the present invention is as follows. [1] The content of free amino acid is 10 wt% or less of the total solid content, A placenta extract having a peptide content of 70 wt% or more and 99.5 wt% or less of the total solid content; [2] The content of free amino acid is 10 wt% or less of the total solid content, A placenta extract in which the content of a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less is 40 wt% or more and 99.5 wt% or less in the total solid content; [3] By subcritical treatment with placenta raw material and extractant, The content of free amino acid is 10 wt% or less in the total solid content, A method for producing a placenta extract having a peptide content of 70 wt% or more and 99.5 wt% or less in the total solid content; [4] By subcritical treatment with placenta raw material and extractant, The content of free amino acids
  • the placenta extract of the present invention preferably a placenta extract extracted through a subcritical treatment of a placenta raw material, contains a low-molecular peptide in a high content and a low free amino acid, and has such a characteristic composition.
  • the antioxidant ability collagen production promoting ability (beautifying skin), collagenase inhibiting ability (beautifying skin), elastase inhibiting activity ability, ACE (Angiotensin-Converting ability) than SOD (super oxide dismutase) -like activity.
  • Enzyme) inhibitory ability blood pressure increase suppressing action
  • blood pressure increase suppressing action and the like are remarkably improved.
  • FIG. 1 is a chart of molecular weight distribution obtained by analyzing the sample obtained in Example 5 by high performance liquid chromatography.
  • the lower horizontal axis of this chart shows the elution time (min), the upper horizontal axis shows the corresponding molecular weight, and the vertical axis shows the relative absorbance.
  • FIG. 2 is a chart of molecular weight distribution obtained by analyzing the sample obtained in Comparative Example 1 by high performance liquid chromatography.
  • the lower horizontal axis of this chart shows the elution time (min), the upper horizontal axis shows the corresponding molecular weight, and the vertical axis shows the relative absorbance.
  • FIG. 3 is a chart of molecular weight distribution obtained by analyzing the sample obtained in Comparative Example 2 by high performance liquid chromatography.
  • the lower horizontal axis of this chart shows the elution time (min), the upper horizontal axis shows the corresponding molecular weight, and the vertical axis shows the relative absorbance.
  • the weight ratio in the present application refers to the weight ratio (wt%) of each component to the total weight of the total solid content of the placenta extract.
  • the placenta extract contains a liquid component such as moisture
  • the placenta extract is dried or freeze-dried to remove the liquid component as the total solid content of the placenta extract.
  • the content of free amino acids in the total solid content is described in the examples below.
  • it is a value obtained by combining the acquisition of molecular weight distribution by high performance liquid chromatography of the dried or freeze-dried product of placenta extract and the calculation result of the constituent amino acid amount by amino acid analysis method and the like.
  • the peptide content is 70 wt% or more and 99.5 wt% or less in the total solid content, and the free amino acid production amount is 10 wt% in the total solid content. It is an extract that was able to be suppressed to less than%. Such an extract can be obtained by the production method of the present invention. Therefore, a placenta extract having a higher peptide content and a lower free amino acid content than conventional products can be obtained. As a result, it is possible to provide a placenta extract having high functionality such as antioxidant and collagen production promoting ability.
  • the content of the peptide in the total solid content is more preferably 75 wt% or more.
  • a placenta extract By exposing the placenta to a subcritical state, a placenta extract can be obtained without using a processing aid as in the conventional enzyme treatment.
  • this placenta extract contains a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less of 40 wt% or more and 99.5 wt% or less of the total solid content, and the amount of free amino acid produced is the content of free amino acid in the total solid content. It is the extract which was able to be suppressed to 10 wt% or less.
  • Such an extract can be obtained by the production method of the present invention. Therefore, a placenta extract having a higher content of low molecular weight peptides and a lower content of free amino acids than conventional products can be obtained. As a result, it is possible to provide a placenta extract having high functionality such as antioxidant and collagen production promoting ability.
  • content of the said low molecular peptide in total solid 55 wt% or more is more preferable.
  • the molecular weight distribution of a placenta extract treated with subcriticality and a placenta extract treated with a conventional enzyme are measured by high performance liquid chromatography described later.
  • the maximum peak height in the chart is 1 or more by high performance liquid chromatography described later, For example, when it is about 2, the relative absorbance (“relative absorbance” in the present specification means “relative absorbance” defined in this way) 3 is 3 or more. One or more peaks were observed.
  • the peak here indicates a result having a maximum value in the absorbance of high performance liquid chromatography, and is not a shoulder peak indicating a slight change in the absorbance when the absorbance increases or decreases.
  • the molecular weight region has a molecular weight of about 500
  • the molecular weight region has a molecular weight of about 250
  • the molecular weight region has a molecular weight of less than 250.
  • one peak was confirmed as a peak having a relative absorbance of 0.5 or more by a high performance liquid chromatography method described later in a region having a molecular weight of 3000 or less.
  • the peak has been confirmed to have a molecular weight of around 250.
  • the relative absorbance of high-performance chromatography of placenta extract processed at subcriticality is 0.5 or more
  • the peptide with three or more peaks with different molecular weight regions promotes antioxidant and collagen production.
  • it is possible to cope with multiple functionalities with different actions for example, immediate action and delayed action, functional action and functional auxiliary action
  • this estimation could yield an extract with higher functionality than the placenta extract treated with the enzyme.
  • a placenta extract having a peptide having a plurality of peaks having different molecular weight regions at a relative absorbance of 0.5 or higher in high-speed chromatography has higher functionality than a placenta extract treated with an enzyme. It was also estimated to be an extract.
  • placenta extract in which the content of free amino acids in the total solid content is 10 wt% or less, it is difficult to inhibit the performance of functions such as antioxidant and collagen production promoting ability.
  • the placenta extract treated with subcriticality makes it difficult for free amino acids to be produced by using no enzymes or processing aids in the extraction process, and the free amino acid content in the solids is 10 wt% or less. It will be easier to get.
  • the peptide has a higher functionality than the free amino acid alone because the peptide has a higher functional peptide bond than its free amino acid. Can be expressed. Therefore, if a certain amount or more of free amino acids are present, even if there is a corner functional peptide, the functionality of the peptide is inhibited by the presence of an amino acid with low functionality.
  • the concentration of free amino acids that inhibit the functionality of the peptide is generally a concentration exceeding 10 wt% of the total solid content in the extract.
  • the content of free amino acids in the total solid content is not included at all or is preferably as small as possible.
  • the content of the free amino acid is preferably 5 wt% or less, it is difficult to inhibit the display of functionality such as antioxidant and collagen production promoting ability, and the functionality of the peptide is easily expressed.
  • free amino acids are not easily generated by using no enzymes or processing aids, and placenta extract having a free amino acid content of 5 wt% or less in the solid content. It becomes easier to obtain.
  • the production of free amino acids can be suppressed, and a placenta extract with a free amino acid content of 5 wt% or less in solids can be obtained more. It becomes easier. Even if the content of free amino acid is 0 wt%, there is no problem as a placenta extract.
  • the free amino acid in the solid content affects the expression of functionality.
  • the peptide is more likely to express its functionality. As a result, functionality such as antioxidant and collagen production promoting ability is exhibited.
  • the placenta extract treated by subcriticality suppresses the formation of free amino acids and facilitates the production of peptides regardless of the molecular weight.
  • the content of free amino acids in the solid content is 10 wt% or less.
  • a placenta extract in which the total peptide amount in the solid content is 70 wt% or more can be obtained.
  • the placenta extract treated by subcriticality suppresses the formation of free amino acids and facilitates the production of peptides regardless of the molecular weight.
  • the content of free amino acids in the solid content is 5 wt% or less.
  • a placenta extract in which the content of the peptide in the solid content is 70 wt% or more.
  • Such an extract can be obtained by the production method of the present invention.
  • by adjusting various conditions such as temperature and time under subcritical conditions it is possible to suppress the production of free amino acids and facilitate the production of peptides, so the content of free amino acids in the solid content is 5 wt% or less.
  • a placenta extract having a peptide content in the solid content of 70 wt% or more can be obtained more reliably.
  • a placenta extraction in which the content of free amino acids in the solid content is 10 wt% or less, and the content of the low molecular weight peptide having a molecular weight in the solid content of 3000 or less is 40 wt% or more and 99.5 wt% or less.
  • the product can exert functions such as antioxidant and collagen production promoting ability more strongly.
  • the placenta extract treated by subcriticality suppresses the production of free amino acids and tends to produce low molecular weight peptides having a molecular weight of 3000 or less.
  • the content of free amino acids in the solid content is 10 wt% or less.
  • a placenta extract in which the content of the low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less in the solid content is 40 wt% or more and 99.5 wt% or less.
  • Such an extract can be obtained by the production method of the present invention.
  • the placenta extract processed by subcriticality has three or more different peaks in a molecular weight region of 3000 or less in a molecular weight region having a relative absorbance of 0.5 or more in high performance liquid chromatography described later.
  • the extract contains a low-molecular-weight peptide having a molecular weight of 3000 or less, and this extract has not only an increased amount of peptide that acts on functionality compared to conventional products, but also a different action (for example, immediate action and (Slow effect, functional action and functional auxiliary action) can act on complex functionality, and the free amino acid content in the solid content is 10% or less, so it is estimated that the functionality is not hindered did. Based on this estimation, it was also estimated that an extract with higher functionality than a placenta extract treated with a conventional enzyme could be obtained.
  • the placenta extract processed by subcriticality has a molecular weight of 3000 or less having a plurality of different peaks in a molecular weight region having a relative absorbance of 0.5 or more by high performance liquid chromatography in a region having a molecular weight of 3000 or less. It was estimated that even an extract containing the low molecular weight peptide had the same action as described above.
  • a placenta extract containing 55 wt% or more and 99.5 wt% or less of a low molecular weight peptide having a free amino acid content in the solid content of 5 wt% or less and a molecular weight in the solid content of 3000 or less.
  • the functions such as antioxidant and collagen production promoting ability can be sufficiently exhibited without inhibiting the performance of the functions.
  • the placenta extract treated by subcriticality is free from the production of free amino acids and tends to produce low molecular weight peptides having a molecular weight of 3000 or less.
  • the content of free amino acids in the solid content is 5 wt%.
  • a placenta extract containing 55 wt% or more and 99.5 wt% or less of a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less in the solid content can be obtained.
  • the placenta extract processed by subcriticality is an extract in which a relative absorbance is 0.5 or more and high-speed chromatography described later has three or more peaks in a region having a molecular weight of 3000 or less.
  • the placenta extract processed by subcriticality is an extract in which a plurality of different peaks are present in a region having a molecular weight of 3000 or less and having a relative absorbance of 0.5 or more by high-speed chromatography.
  • the production of free amino acids can be suppressed, and peptides with a molecular weight of 3000 or less can be easily produced.
  • Is 5 wt% or less and a placenta extract containing 55 wt% or more and 99.5 wt% or less of the low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less in the solid content can be obtained more reliably.
  • the extracted components in the placenta extract are roughly classified into four components: free amino acids, low molecular weight peptides having a molecular weight of 3000 or less, peptides having a molecular weight of 3000 or more, and other components.
  • Free amino acids include arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine, methionine, valine, alanine, glycine, proline, glutamic acid (including glutamine), serine, threonine, aspartic acid (including asparagine), cystine, and tryptophan.
  • the amino acid which 18 types of amino acids exist independently is pointed out.
  • Low molecular weight peptides with a molecular weight of 3000 or less are arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine, methionine, valine, alanine, glycine, proline, glutamic acid (including glutamine), serine, threonine, aspartic acid (including asparagine)
  • peptides in which two or more molecules of 18 kinds of amino acids such as cystine and tryptophan are bonded all peptides having a molecular weight of 3000 or less are indicated.
  • low molecular weight peptides with a molecular weight of 3000 or less have good absorbability to the human body, and the absorbed component is a placenta-derived protein typified by antioxidant activity, collagen production promoting ability, collagenase inhibitory activity, and blood pressure elevation inhibiting action. It is easy to demonstrate the functionality of the extract.
  • Peptides with a molecular weight greater than 3000 include arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine, methionine, valine, alanine, glycine, proline, glutamic acid (including glutamine), serine, threonine, aspartic acid (including asparagine), cystine.
  • arginine arginine
  • lysine histidine
  • phenylalanine tyrosine
  • leucine isoleucine
  • methionine valine
  • alanine glycine
  • proline proline
  • glutamic acid including glutamine
  • serine serine
  • threonine aspartic acid (including asparagine)
  • cystine including asparagine
  • components are inorganic components such as minerals, lipids, carbohydrates, etc. and all components other than peptides and amino acids. It is difficult to remove all of these other components by separation and extraction, and 0.5% by weight or more of the total solid content is contained in the placenta extract.
  • constituent amino acid in this specification refers to the total amount of amino acids contained in all proteins, free amino acids, and peptides constituting the placenta and placenta extract. That is, it refers to the free amino acids that exist alone and the amino acids that make up all proteins and peptides regardless of molecular weight or simple substance / complex.
  • constituent amino acids in the present application is a free amino acid, a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less, and a peptide having a molecular weight of 3000 or more, and all these amino acids are indicated.
  • constituent amino acid amount in the present application is a total amount of a free amino acid amount, a low molecular peptide amount having a molecular weight of 3000 or less, and a peptide amount having a molecular weight of greater than 3000.
  • all peptides are all low-molecular-weight peptides having a molecular weight of 3000 or less and peptides having a molecular weight of more than 3000, in other words, all peptides regardless of molecular weight.
  • the total peptide amount in the present application is a total amount of a low molecular peptide amount having a molecular weight of 3000 or less and a peptide amount having a molecular weight of greater than 3000.
  • the low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less is 55 wt% or more in terms of the weight ratio in the total solid content of the extract. This is because the peptide content is further increased and functionalities such as antioxidant and collagen production promoting ability can be sufficiently exhibited.
  • placenta is a mammalian placenta (placenta)
  • the type of animal is not limited. From the viewpoint of availability, mammals such as humans, pigs, cows, horses, sheep and wild boars can be mentioned.
  • the placenta raw material includes other components such as minerals such as minerals, lipids, and carbohydrates in an amount of 0.5 wt% or more. Therefore, even if all peptides can be made to have a molecular weight of 3000 or less by subcritical treatment, it is estimated that the upper limit of the content of the reduced peptide is 99.5 wt%. This is a numerical value obtained on the basis of empirical rules based on repeated experiments. Moreover, it is estimated that the upper limit of peptide content is also 99.5 wt%.
  • water When water is used as the extractant used for the subcritical treatment in the present invention, it can be used in a liquid state or a gas state as long as it is a high-temperature water treatment. That is, water vapor may be supplied to the subcritical processing tank, water may be supplied, or both of them may be supplied.
  • the temperature of water or water vapor is desirably 100 ° C. or higher, and the desired reaction field is more liable to proceed in the liquid state than in the gas.
  • the subcritical treatment is a process in which a subcritical fluid as an extracting agent brought into a subcritical state under a predetermined temperature and pressure is brought into contact with a raw material to be extracted (in the present invention, a placenta) to thereby extract predetermined components from the extracted raw material.
  • a raw material to be extracted in the present invention, a placenta
  • Is extracted For example, when water is raised to a pressure of 22.12 MPa and a temperature of 374.15 ° C., it shows a state where it is neither liquid nor gas. This point is called the critical point of water, and hot water at a temperature and pressure lower than the critical point is called subcritical water.
  • Subcritical water has an excellent component extraction action and hydrolysis action due to a decrease in dielectric constant and an improvement in ionic product.
  • placenta and water as an extractant are placed in a pressure vessel such as metal or ceramics to bring it into a closed state, and the water is in a subcritical state (temperature: 100 ° C or higher, pressure: saturated vapor pressure or higher). ),
  • the extract obtained by performing the contact between them for a certain time or more is defined as a subcritically processed extract.
  • Examples of the extractant used for the subcritical treatment include, in addition to water, ethylene, ethane, propane, carbon dioxide, methanol, ethanol, and mixtures thereof. Among these, it is most preferable to use water from the viewpoint of safety.
  • the temperature for sub-critical treatment of placenta is preferably 160-200 ° C. By adjusting to this temperature range, it is easy to produce a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less, and the relative absorbance in a molecular weight region having a relative absorbance of 0.5 or more is different in molecular weight distribution measurement by high performance liquid chromatography described later. A low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less having one or more peaks can be obtained.
  • the temperature of the subcritical treatment When the temperature of the subcritical treatment is less than 160 ° C., it tends to be difficult to produce a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less. When the temperature of the subcritical treatment exceeds 200 ° C., the produced low molecular peptide further undergoes a subcritical reaction, and there is a tendency to reduce the production amount of the low molecular peptide having a molecular weight of 3000 or less.
  • the temperature of the subcritical processing is 180 to 195 ° C. Within this range, it is easy to produce a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less, and the production of free amino acids is easily suppressed to 10 wt% or less.
  • the sub-critical processing pressure of the placenta is at or above the saturated vapor pressure at each temperature (for example, 0.61 MPa or more at 160 ° C., 1.55 MPa or more at 200 ° C. or more). By using this pressure, it is easy to produce a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less.
  • the upper limit of the subcritical processing pressure is not particularly defined, it is desirable to suppress the pressure to around 20-30 MPa due to the specifications of the high pressure apparatus.
  • the placenta subcritical processing time is preferably 5-30 minutes. By making it within this processing time range, it is easy to produce a low molecular peptide, and a plurality of three or more different peaks are formed in a molecular weight region having a relative absorbance of 0.5 or more by high performance liquid chromatography described later. A low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less can be obtained.
  • the subcritical processing time When the subcritical processing time is less than 5 minutes, it tends to be difficult to produce low molecular peptides. When the subcritical processing time exceeds 30 minutes, the produced low molecular weight peptide is further excessively decomposed, and a tendency to reduce the production amount of the low molecular weight peptide is observed.
  • the processing time is 10-30 minutes. This is because, within this range, it is easy to produce a low molecular peptide and the production of free amino acids is easily suppressed to 10 wt% or less.
  • the hydrolysis conditions by the subcritical treatment of the placenta when the extractant is water are as follows: the treatment temperature is 160-200 ° C., the treatment pressure is equal to or higher than the saturated vapor pressure of each temperature, and the treatment time is 5-30 minutes. It is desirable to do it. By carrying out under these conditions, it is easy to produce low molecular weight peptides and the production of free amino acids is suppressed.
  • the treatment temperature is 180 to 195 ° C.
  • the treatment pressure is equal to or higher than the saturated vapor pressure of each temperature
  • the treatment time is 10 to 30 minutes. If it is this range, it will be easy to produce
  • the recovered liquid can be used as it is as an aqueous solution containing a placenta extract.
  • a solid placenta extract can be obtained by drying the collected liquid. It goes without saying that an aqueous solution containing the placenta extract can be obtained by dissolving the solid placenta extract in the aqueous solution again.
  • Solid-liquid separation of the processed product obtained through the subcritical treatment can be performed by a general solid-liquid separation method to obtain a liquid portion. Specifically, filtration using a filter paper, centrifugation, Decantation, screw press, roller press, rotary drum screen, belt screen, vibrating screen, multiple plate vibration filter, vacuum dehydration, pressure dehydration, belt press, centrifugal concentration dehydration, multiple disk dehydration can be performed. It is.
  • a solid placenta extract can be obtained by drying the liquid obtained after solid-liquid separation.
  • a general drying method can be used.
  • heat transfer drying such as box drying or spray drying, which is a heating system, internal heat drying such as microwave drying, non-drying, etc.
  • a heating system such as freeze drying, vacuum drying, suction drying, pressure drying, ultrasonic drying, and the like are possible.
  • drying using a simple oven or thermostat is generally acceptable.
  • the placenta extract obtained by this subcritical treatment can be obtained as a low molecular peptide extract regardless of liquid or solid content.
  • Example 1 200 g of pig placenta (Tokyo Shibaura organ; hereinafter referred to as porcine placenta) and 200 g of distilled water are put into a pressure-resistant container having a volume of 2 L, and the processing temperature is 180 ° C., the processing pressure is 1.0 MPa, and the processing time is 10 minutes. Processed.
  • the treated product in the pressure vessel was collected and filtered with a cellulose filter paper (pore diameter: 1 ⁇ m, trade name: 5C, manufactured by Advantec), and the filtrate was collected.
  • the placenta extract was obtained by freeze-drying the filtrate.
  • this extract is referred to as a sample.
  • Example 2 Processing was performed under the same conditions as in Example 1 except that the subcritical processing was performed at a processing temperature of 180 ° C., a processing pressure of 1.0 MPa, and a processing time of 30 minutes.
  • Example 3 The process was performed under the same conditions as in Example 1 except that the subcritical process was performed at a processing temperature of 188 ° C., a processing pressure of 1.2 MPa, and a processing time of 20 minutes.
  • Example 4 The process was performed under the same conditions as in Example 1 except that the subcritical process was performed at a process temperature of 195 ° C., a process pressure of 1.6 MPa, and a process time of 10 minutes.
  • Example 5 The process was performed under the same conditions as in Example 1 except that the subcritical process was performed at a process temperature of 195 ° C., a process pressure of 1.6 MPa, and a process time of 30 minutes.
  • Comparative Example 1 (Conditions for producing extract by enzyme treatment) 200 g of pig placenta, 50 ml of water, 4 ml of protein hydrolase Alcalase (manufactured by Novozymes) and 2 ml of 25 wt% sodium hydroxide were added and reacted at 60 ° C. for 3 hours. Thereafter, the filtrate obtained by treating the treatment liquid at 90 ° C. for 1 hour to deactivate the enzyme was collected with a cellulose filter paper (pore diameter: 1 ⁇ m, trade name: 5C manufactured by Advantec). The filtrate was freeze-dried and powdered.
  • a cellulose filter paper pore diameter: 1 ⁇ m, trade name: 5C manufactured by Advantec
  • Comparative Example 2 As an enzyme-treated product of pig placenta, a commercially available product A of placenta powder extract treated with an enzyme was used.
  • Commercially available product A is a product obtained by purifying pig placenta with papain and treating with protease at 35 ° C. for 2 hours.
  • the molecular weight obtained this time is not more than the extra exclusion molecular weight (about 100,000) of the column used for the upper limit in all samples, and the maximum molecular weight calculated from the time when elution starts is about 20,000. there were. Therefore, it was found that all the proteins contained in the raw materials in the above Examples and Comparative Examples were converted into peptide forms having a molecular weight of about 100,000 or less, and further about 20,000 or less and contained in the sample. .
  • FIGS. 1 to 3 are charts of molecular weight distributions obtained by analyzing the samples obtained in Example 5, Comparative Example 1 and Comparative Example 2 by high performance liquid chromatography.
  • the lower horizontal axis of this chart shows the elution time (min), the upper horizontal axis shows the corresponding molecular weight, and the vertical axis shows the relative absorbance.
  • a molecular weight region having a molecular weight of about 500, a molecular weight region having a molecular weight of about 250, and a molecular weight region having a molecular weight of less than 250 can be estimated from the behavior of the calibration curve depending on the properties of the column used this time. Difficult and accurate molecular weight cannot be measured, but molecular weight distribution having rough peaks in each of the three regions was observed under the above experimental conditions.
  • Comparative Example 1 and Comparative Example 2 only a molecular weight distribution having one peak in the molecular weight region near the molecular weight of 250 was observed.
  • the tendency of the three peaks of Example 5 is also observed in other Examples 1 to 4, and not only peptides obtained by existing enzyme treatment but also molecular weight distributions not obtainable by existing enzyme treatment under subcritical conditions. Extracts containing peptides are also obtained.
  • Each sample was subjected to hydrochloric acid hydrolysis after performing formic acid oxidation treatment.
  • a total of 18 types of arginine, lysine, histidine, phenylalanine, tyrosine, leucine, isoleucine, methionine, valine, alanine, glycine, proline, glutamic acid (including glutamine), serine, threonine, aspartic acid (including asparagine), cystine and tryptophan are measured. did.
  • analysis other than tryptophan was measured by an amino acid automatic analyzer, and tryptophan was measured by a high-speed chromatographic method.
  • the sample was directly measured for each amino acid by the same analysis. About these, 18 types of free amino acid amount and the amount of constituent amino acids were totaled, respectively. From the result, the amount of free amino acids in the solid content of the extract and the amount of constituent amino acids were determined. Furthermore, from the results in Table 1, the amount of each peptide (peptide, peptide having a molecular weight of 3000 or less, peptide having a molecular weight of 3000 or more) was determined. The results are shown in Table 2.
  • Inhibition rate (%) 1- (absorbance after enzyme reaction of sample solution-absorbance of sample solution when added with buffer instead of enzyme) / (absorbance after enzyme reaction of blank-when adding buffer with instead of enzyme) Absorbance of blank) x 100
  • ORAC evaluation that is, active oxygen generated by the radical generator AAPH (2,2′-Azobis [2-amidinopropane] dihydrochloride) decomposes the fluorescent substance fluorescein, and the fluorescence intensity is measured over time. The area of the decrease curve was calculated by measuring the concentration and comparing with the standard substance.
  • Example 5 Using the samples of Example 5 and Comparative Example 2 and redissolving them in a mixture (1 ml) of acetone: water: acetic acid (70: 29.5: 0.5) (20 ⁇ l), 100 ⁇ M Trolox aqueous solution A dilute solution (20 ⁇ l) diluted with time and a blank (acetone: water: acetic acid (70: 29.5: 0.5) mixture (20 ⁇ l) were dispensed onto a microplate, and 94.4 nM fluorescein sodium salt (200 ⁇ l And was shaken for 30 minutes at 37 ° C.
  • the antioxidant value was converted as TE ( ⁇ mol TE / g) per extract.
  • the results of the antioxidant value of each sample are shown in Table 4.
  • Collagen production promotion evaluation was performed using the sample of Example 5 and the sample of Comparative Example 2.
  • N1RGB Normal human fibroblasts (NB1RGB) stored in liquid nitrogen are thawed and DMEM medium containing 5 wt% FBS (fetal calf serum) (Doulbecco's modified Eagles's) until sufficient cells are available for testing. (Medium).
  • FBS fetal calf serum
  • the cultured sample was diluted 3-fold with a DMEM medium containing 0.5 wt% FBS to prepare a total of 4 concentration test solutions.
  • Cells that had become a sufficient number to be used for the test were collected by trypsin treatment, seeded in each well of a 96-well microplate, and pre-cultured for 24 hours. Thereafter, the DMEM medium containing 5% FBS was removed from the 96-well microplate, replaced with a medium containing each concentration of the sample, and the culture was continued for further 48 hours.
  • the amount of collagen produced by the test sample was calculated according to the protocol of the human collagen (type I) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method.
  • the medium was removed from the 96-well microplate in which the cells were cultured, and the cell viability was measured by MTT (3- (4,5-di-methylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazole bromide, yellow tetrazole) assay. Measured and calculated the collagen concentration ( ⁇ g / ml) per 100% cell viability. The results are shown in Table 5.
  • Collagenase inhibitory activity was evaluated using the sample of Example 5 and the sample of Comparative Example 2.
  • Pz peptide solution manufactured by BACHEM Fenchemikaline AG, trade name: Pz-peptide
  • a collagenase solution (manufactured by Sigma, trade name: Collagenase Type IV) was added and reacted at 37 ° C.
  • ACE inhibitory activity was evaluated using the sample of Example 5 and the sample of Comparative Example 2. Extract 1.0 g of each sample with 20 ml of 50 vol% ethanol solution, dilute 10 times with 0.1 mol / l HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine etheric acid) buffer (pH 8.3), and then test solution was prepared. 25 ⁇ l of 0.1 mol / l HEPES buffer (pH 8.3) (untreated group) or test solution was added to a 96-well microplate, 25 ⁇ l of 20 mU / ml ACE solution was added, and the mixture was incubated at 37 ° C. for 5 minutes. 25 ⁇ l of 8 mmol / l Hip-His-Leu (Hippuryl-L-histidyl-L-Leucine) solution was added and reacted at 37 ° C. for 30 minutes.
  • HEPES 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazine etheric acid
  • reaction was stopped by adding 25 ⁇ l of 0.1 mol / l sodium hydroxide solution, and 25 ⁇ l of 1 wt% OPA (o-Phtalaldehyde) solution was added and left at room temperature for 20 minutes. Furthermore, 25 ⁇ l of 0.1 mol / l hydrochloric acid was added and allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and the fluorescence intensity at an excitation wavelength of 355 and a fluorescence wavelength of 460 nm was measured using a microplate reader (SpectraMax M2e, manufactured by Molecular Devices Sakai Japan Co., Ltd.). .
  • the blank was tested in the same manner as described above using phosphate buffer (PBS) instead of 20 mU / ml ACE solution.
  • PBS phosphate buffer
  • the inhibition rate was determined therefrom, and the IC50 value was calculated as the sample concentration that inhibited ACE activity by 50%.
  • the results are shown in Table 7.
  • ACE activity inhibition rate (%) 1-(Fluorescence intensity after reaction of sample solution-fluorescence intensity of sample solution when added with PBS instead of enzyme) / (Fluorescence intensity after reaction of blank-Blank when added with PBS instead of enzyme) Fluorescence intensity) ⁇ 100
  • the placenta extract obtained by subcritical treatment has a free amino acid content of 10 wt% or less, 0.1 wt% or more, and a low molecular weight peptide having a molecular weight of 3000 or less of 40 wt% or more, What was contained as a main component of 99.5 wt% or less could be obtained, and it was shown that functionality is high.
  • Elastase is a kind of protease having the ability to degrade elastin, and the decrease in elastin is said to contribute to the development of skin wrinkles. Therefore, a component that inhibits the activity of elastase can be expected to have an effect of keeping human skin beautiful.
  • elastase inhibitory activity was evaluated using the sample of Example 5 and the samples of Comparative Examples 1 and 2.
  • Elastase activity inhibition rate (%) 1- (Absorbance after reaction of sample solution-Absorbance of sample solution when added with purified water instead of enzyme) / (Absorbance after reaction of blank-Blank of when added with purified water instead of enzyme) Absorbance) x 100
  • the placenta extract of the present invention has functions such as antioxidant ability, collagen production promoting ability, collagenase activity inhibiting ability, ACE inhibiting ability, etc., so it can be used as a raw material for pharmaceuticals, and in foods such as cosmetic ingredients, drinks and supplements. Can be used.

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Abstract

　本発明は、遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の10wt%以下であり、ペプチドの含有量が全固形分中の70wt%以上、99.5wt%以下である、プラセンタ抽出物；遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の10wt%以下であり、分子量が3000以下である低分子化されたペプチドの含有量が全固形分中の40wt%以上、99.5wt%以下である、プラセンタ抽出物；並びにプラセンタ原料と抽出剤とにより亜臨界処理することによって、このようなプラセンタ抽出物を製造する方法を提供する。本発明のプラセンタ抽出物、好ましくはプラセンタ原料の亜臨界処理を経て抽出されたプラセンタ抽出物は、低分子ペプチドを高含有、遊離アミノ酸を低含有とするものなので、従来品よりも、SOD様活性による抗酸化能、コラーゲン産生促進能、コラゲナーゼ阻害能、エラスターゼ阻害能、ACE阻害能が著しく向上している。

Description

プラセンタ抽出物及びその製造方法
　本発明は、原料としてのプラセンタを亜臨界処理して得られるプラセンタ抽出物に関するものであり、さらにはプラセンタ抽出物に低分子ペプチドを高含有させることができるプラセンタ抽出物の製造方法に関するものである。
　プラセンタとは哺乳類の胎盤のことであり、その優れた機能性から近年健康食品や化粧品素材、医薬品として使用されている。優れた機能性を発揮させるには通常、プラセンタ中の蛋白質を、吸収性、機能性に優れたペプチドまで低分子化・抽出することが必要とされていた。従来、プラセンタを可溶化、低分子化する技術は酵素処理が専ら用いられていた。
　その具体的な事例としては、特許文献１では、人胎盤組織から水溶性プロテインなどの高分子蛋白質を抽出する際に除去される残渣物を蛋白分解酵素で加水分解させた上清に酵母抽出物を加えることにより、メラニン生成抑制剤を得ているという例が開示されていた。
　特許文献２では、ブタ及び／又はウマの胎盤を酵素処理により加水分解して得られる水溶性成分、及びポリフェノール誘導体を含有する化粧料組成物を得ているという例が開示されていた。
特開昭５３－１４２５１５ 特開２００２－２１２０４６
　本発明は、プラセンタの亜臨界処理、好ましくは亜臨界水処理によるプラセンタ抽出物及びその抽出物を含む水溶液に関し、特に低分子ペプチドを高含有するものに関する。
　しかしながら、前述した従来技術では、抽出を行うにあたり、酵素の添加は当然のことであるがその他の加工助剤を用いることが必要となる。具体的には、酵素処理による抽出では、加工助剤として、蛋白分解酵素や酵素の種類によってはｐＨ調整剤が用いられる。これらの加工助剤を用いて、プラセンタ等の蛋白質成分の抽出を行うと、加工助剤により有効成分の濃度が薄まってしまい、抽出物あたりの有効成分濃度が少なくなってしまう。
　さらに、従来技術でのプラセンタからの蛋白質成分の抽出処理は、加工助剤によるｐＨを調整するためさらに加工助剤を添加するという後工程が必要となる。これら酵素処理から加工助剤添加などの一連工程は機能性を発揮する有効成分であるペプチドを分解させるため、ペプチドの分解による遊離アミノ酸が増加してしまう。その遊離アミノ酸の増加に伴い、抽出物における有効成分であるペプチドが失われることになり、その結果として、得られた抽出物における抗酸化などの機能性が十分に発揮されないことがあった。
　本発明者らは、プラセンタ抽出物について鋭意研究した結果、プラセンタを亜臨界で処理することで得られる抽出物、その抽出物を含む水溶液に特徴を見出し、前述のプラセンタ抽出物、その抽出物を含む水溶液が、分子量３０００以下である低分子ペプチドを高い割合で含むことを見出した。
　即ち、本発明の要旨は、
[1]遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
　ペプチドの含有量が全固形分中の７０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下である、プラセンタ抽出物；
[2]遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
　分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドの含有量が全固形分中の４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下である、プラセンタ抽出物；
[3]プラセンタ原料と抽出剤とにより亜臨界処理することによって、
　遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
　ペプチドの含有量が全固形分中の７０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物を製造する方法；
[4]プラセンタ原料と抽出剤とにより亜臨界処理することによって、
　遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
　分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドの含有量が全固形分中の４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物を製造する方法；に関する。
　本発明のプラセンタ抽出物、好ましくはプラセンタ原料の亜臨界処理を経て抽出されたプラセンタ抽出物は、低分子ペプチドを高含有、遊離アミノ酸を低含有とするものであり、このような特徴的な組成物を有することによって、従来のものよりも、ＳＯＤ（ｓｕｐｅｒ　ｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ）様活性による抗酸化能、コラーゲン産生促進能（美肌）、コラゲナーゼ阻害能（美肌）、エラスターゼ阻害活性能、ＡＣＥ（Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ－Ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ　Ｅｎｚｙｍｅ）阻害能（血圧上昇抑制作用）等が著しく向上する。
図１は、実施例５で得られた試料を高速液体クロマトグラフィーで分析して得られた分子量分布のチャートである。このチャートの下側の横軸は溶出時間（ｍｉｎ）を示し、上側の横軸は対応する分子量を示し、縦軸は相対的な吸光度を示す。 図２は、比較例１で得られた試料を高速液体クロマトグラフィーで分析して得られた分子量分布のチャートである。このチャートの下側の横軸は溶出時間（ｍｉｎ）を示し、上側の横軸は対応する分子量を示し、縦軸は相対的な吸光度を示す。 図３は、比較例２で得られた試料を高速液体クロマトグラフィーで分析して得られた分子量分布のチャートである。このチャートの下側の横軸は溶出時間（ｍｉｎ）を示し、上側の横軸は対応する分子量を示し、縦軸は相対的な吸光度を示す。
　本願における重量比率は、プラセンタ抽出物の全固形分の全重量に対する各成分の重量比率（ｗｔ％）を指している。プラセンタ抽出物が水分などの液体成分を含む場合、プラセンタ抽出物を乾燥もしくは凍結乾燥させて液体成分を除去した状態のものを、プラセンタ抽出物の全固形分とする。
　本明細書において、全固形分中の遊離アミノ酸の含有量、全固形分中のペプチドの含有量及び全固形分中の分子量３０００以下の低分子ペプチドの含有量は、後述の実施例で説明されているように、プラセンタ抽出物の乾燥物もしくは凍結乾燥物の高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布の取得や、アミノ酸分析法等による構成アミノ酸量等の算出結果を組み合わせることによって、求められる値である。
　また、このプラセンタ抽出物は、ペプチドの含有量が全固形分中の７０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であり、かつ、遊離アミノ酸の生成量を遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下にまで抑えることができた抽出物である。本発明の製造方法によって、このような抽出物を得ることができるのである。そのため、従来品よりもペプチドの含有率が高く、遊離アミノ酸の含有量の低いプラセンタ抽出物が得られる。そのことにより、抗酸化やコラーゲン産生促進能等の機能性の高いプラセンタ抽出物を提供できるのである。ここで、全固形分中のペプチドの含有量としては、７５ｗｔ％以上がより好ましい。
　プラセンタを亜臨界状態に晒すことで、従来の酵素処理のように加工助剤を使用することなく、プラセンタ抽出物を得ることができる。
　また、このプラセンタ抽出物は、分子量３０００以下の低分子ペプチドを全固形分中の４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下含み、かつ、遊離アミノ酸の生成量を遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下にまで抑えることができた抽出物である。本発明の製造方法によって、このような抽出物を得ることができるのである。そのため、従来品よりも低分子ペプチドの含有率が高く、遊離アミノ酸の含有量の低いプラセンタ抽出物が得られる。そのことにより、抗酸化やコラーゲン産生促進能等の機能性の高いプラセンタ抽出物を提供できるのである。ここで、全固形分中の前記低分子ペプチドの含有量としては、５５ｗｔ％以上がより好ましい。
　下記の実施例において、亜臨界にて処理させたプラセンタ抽出物と、従来の酵素にて処理させたプラセンタ抽出物を、後述する高速液体クロマトグラフィーにてその分子量分布測定を行っている。その分析結果であるチャートの比較から、亜臨界にて処理させたプラセンタ抽出物では、分子量３０００以下の領域において、後述する高速液体クロマトグラフィーにてチャート中の最大のピークの高さを１以上、例えば約２とした場合、相対的な吸光度（本明細書での「相対的な吸光度」とは、このように規定される「相対的な吸光度」を意味する。）が０．５以上の３つ以上の複数のピークが確認された。
　ここでのピークとは、高速液体クロマトグラフィーの吸光度で極大値を有する結果を示すものであり、吸光度の上昇もしくは下降時における吸光度の若干の変化を示すショルダーピークではない。
　具体的には、亜臨界にて処理させたプラセンタ抽出物では、分子量３０００以下の領域において、後述する高速液体クロマトグラフィー法にて相対的な吸光度が０．５以上の３つの複数のピークが存在し、それぞれ分子量５００前後の分子量領域、分子量２５０前後の分子量領域、分子量２５０未満の分子量領域であることが確認されている。
　従来の酵素法では、分子量３０００以下の領域において、後述する高速液体クロマトグラフィー法にて相対的な吸光度が０．５以上のピークとして一つのピークが確認されている。そのピークは、分子量２５０前後であることが確認されている。
　この結果より、原料のプラセンタを亜臨界にて処理を行うことで、得られたプラセンタ抽出物において、分子量３０００以下で、分子量領域の異なる複数のペプチドの同量程度を同時に生成することができる。
　よって、亜臨界にて処理させたプラセンタ抽出物の高速クロマトグラフィーの相対的な吸光度が０．５以上において、分子量領域の異なる３つ以上の複数のピークとなるペプチドにより、抗酸化やコラーゲン産生促進等の機能性に作用するペプチド量が増加するだけでなく、異なる作用（例えば、即効性と遅効性、機能性作用と機能性補助作用）での複合的な機能性に対応することができるようになると推定した。この推定により、酵素にて処理させたプラセンタ抽出物よりも機能性が高い抽出物を得ることができるとも推定した。
　また、亜臨界にて処理させたプラセンタ抽出物が、その高速クロマトグラフィーの相対的な吸光度が０．５以上において、分子量領域の異なる複数のピークとなるペプチドを含有していても、上記と同等の作用を有すると推定した。言い換えると、高速クロマトグラフィーの相対的な吸光度が０．５以上において、分子量領域の異なる複数のピークとなるペプチドを有するプラセンタ抽出物が、酵素にて処理させたプラセンタ抽出物よりも機能性が高い抽出物であるとも推定した。
　この遊離アミノ酸の割合が抽出物中で増えると、抽出物中のペプチドの割合が減少してしまうので、抗酸化性やコラーゲン産生促進能、コラゲナーゼ阻害活性、血圧上昇抑制作用に代表されるプラセンタ抽出物の機能性が発揮されにくくなる。この遊離アミノ酸は、抽出物を得るために通常使用される酵素や加工助剤によるペプチドの分解で生成し、結果的に、酵素や加工助剤の添加は、ペプチドを生成させる役割として使用されるものの、遊離アミノ酸の生成を増加させてしまうのである。
　全固形分中の遊離アミノ酸の含有量が１０ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物にすることにより、抗酸化やコラーゲン産生促進能などの機能性の発揮が阻害されにくくなる。亜臨界にて処理されたプラセンタ抽出物は、抽出過程で酵素や加工助剤を使用しないことで遊離アミノ酸が生成されにくくなり、固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物を得やすくなる。
　逆に、固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０ｗｔ％を越えるプラセンタ抽出物では、遊離アミノ酸の生体内への吸収がペプチドの吸収を阻害してしまう。よって遊離アミノ酸が多いと、ペプチドが本来持っている吸収性や機能性が抑えられてしまい、機能性が発現しにくいと推定されている。
　遊離アミノ酸の含有量が低いと相対的に抽出物中のペプチド量が多くなり、これらのペプチド量が多くなるとより機能性を発揮しやすい。
　また、抗酸化性に代表される機能性の発現にとっても、遊離アミノ酸よりもペプチドの方が、その構造から機能性の高いペプチド結合を保有しているので、遊離アミノ酸単体よりも高い機能性を発現させることができる。したがって遊離アミノ酸が一定量以上存在すると折角機能性ペプチドが存在しても、機能性の低いアミノ酸が存在することによってペプチドの機能性が阻害されてしまうのである。
　ペプチドの機能性を阻害する遊離アミノ酸の濃度はおおむね抽出物中の全固形分の１０ｗｔ％を越える濃度であることが推測されている。
　このように、プラセンタ抽出物の機能を発揮させる観点からは、全固形分中の遊離アミノ酸の含有量は、全く含まれないか又は、少なければ少ない方が好ましく、具体的には、固形分中の遊離アミノ酸の含有量が好ましくは５ｗｔ％以下であることにより、抗酸化やコラーゲン産生促進能などの機能性の発揮が阻害されにくくなり、ペプチドが有する機能性を発現させやすくなる。特に亜臨界にて処理されたプラセンタ抽出物においては、酵素や加工助剤を使用しないことで遊離アミノ酸が生成されにくくなり、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物を得やすくなるのである。さらに、亜臨界条件おける温度、時間などの諸条件を調整することにより、遊離アミノ酸の生成を抑制することができ、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物をより得やすくなるのである。また、遊離アミノ酸の含有量が０ｗｔ％であっても、プラセンタ抽出物としてはなんら問題はない。
　固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０ｗｔ％以下であり、固形分中のペプチド含有量が７０ｗｔ％以上であるプラセンタ抽出物であることにより、固形分中の遊離アミノ酸が機能性の発現に影響を与えず、かつ、ペプチドがその機能性を発現しやすくなる。その結果、抗酸化やコラーゲン産生促進能などの機能性が発揮される。
　特に亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物は、遊離アミノ酸の生成が抑制され、分子量に関らずペプチドを生成しやすくなり、その結果として、固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０ｗｔ％以下であり、固形分中の全ペプチド量が７０ｗｔ％以上であるプラセンタ抽出物を得ることができる。
　さらに、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であり、固形分中のペプチド量を７０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物であることにより、固形分中での遊離アミノ酸がプラセンタ抽出物由来のペプチドの機能性の発現に影響を与えず、かつ、ペプチドが機能性を発現しやすくなる。その結果として、抗酸化やコラーゲン産生促進能などの機能性を充分に発揮することができる。
　特に亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物は、遊離アミノ酸の生成が抑制され、分子量に関らずペプチドを生成しやすくなり、その結果として、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であり、固形分中のペプチドの含有量が７０ｗｔ％以上であるプラセンタ抽出物である。本発明の製造方法によって、このような抽出物を得ることができる。さらに、亜臨界条件における温度、時間などの諸条件を調整することにより、遊離アミノ酸の生成を抑制することができ、ペプチドを生成しやすくなるので、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であり、固形分中のペプチド含有量が７０ｗｔ％以上のプラセンタ抽出物をより確実に得ることができる。
　また、固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０ｗｔ％以下であり、固形分中の分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドの含有量が４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物は、抗酸化やコラーゲン産生促進能などの機能性をより強く発揮することができる。
　特に亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物は、遊離アミノ酸の生成が抑制され、分子量３０００以下である低分子ペプチド生成しやすくなり、その結果として、固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０ｗｔ％以下であり、固形分中の分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドの含有量が４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物とすることができる。本発明の製造方法によって、このような抽出物を得ることができるのである。さらに、亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物は、分子量３０００以下の領域において、後述する高速液体クロマトグラフィーにて相対的な吸光度が０．５以上の分子量領域に、異なる３つ以上の複数のピークをもつ分子量３０００以下の低分子ペプチドを含有する抽出物であり、この抽出物は、従来品よりも機能性に作用するペプチド量が増加しているだけでなく、異なる作用（例えば、即効性と遅効性、機能性作用と機能性補助作用）が複合的な機能性に作用することができるようになり、固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０％以下となるので機能性が阻害されないと推定した。この推定により、従来品の酵素にて処理させたプラセンタ抽出物よりも機能性が高い抽出物を得ることできるとも推定した。
　また、亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物が、分子量３０００以下の領域において、その高速液体クロマトグラフィーにて相対的な吸光度が０．５以上の分子量領域に、異なる複数のピークをもつ分子量３０００以下の低分子ペプチドを含有する抽出物であっても、上記と同様な作用を有するとも推定した。
　さらに、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であり、固形分中の分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドを５５ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下含むプラセンタ抽出物であることにより、抽出物中の遊離アミノ酸含有量が低いので機能性の発揮が阻害されること無く、抗酸化やコラーゲン産生促進能などの機能性を充分に発揮することができる。
　特に亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物は、遊離アミノ酸の生成が抑制され、分子量３０００以下である低分子ペプチドを生成しやすいものなので、その結果として、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であり、固形分中の分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドを５５ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下含むプラセンタ抽出物を得ることができる。さらに、亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物は、分子量３０００以下の領域において、後述する高速クロマトグラフィーにて相対的な吸光度が０．５以上に、３つ以上の複数のピークが存在する抽出物であり、この抽出物の機能性に作用するペプチド量が増加するだけでなく、異なる作用（例えば、即効性と遅効性、機能性作用と機能性補助作用）での複合的な機能性に対応することができるようになり、固形分中の遊離アミノ酸含有量が１０％以下となるので機能性の阻害されなくなると推定した。この推定により、酵素にて処理させたプラセンタ抽出物よりも機能性が高い抽出物を得ることできるとも推定した。
　また、亜臨界により処理されたプラセンタ抽出物が、分子量３０００以下の領域において、その高速クロマトグラフィーにて相対的な吸光度が０．５以上に、異なる複数の複数のピークが存在する抽出物であっても、上記と同様の作用を有することを推定した。
　また、亜臨界条件おける温度、時間などの諸条件を調整することにより、遊離アミノ酸の生成を抑制することができ、分子量３０００以下のペプチドが生成しやくなるので、固形分中の遊離アミノ酸含有量が５ｗｔ％以下であり、分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドを固形分中の５５ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下含むプラセンタ抽出物をより確実に得ることができるのである。
　ここでプラセンタ抽出物における抽出成分は、遊離アミノ酸、分子量３０００以下の低分子ペプチド、分子量３０００より大きいペプチド、その他成分の４つに大別されるのである。
　遊離アミノ酸とは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの１８種類からなるアミノ酸が単独で存在しているアミノ酸を指す。
　分子量３０００以下の低分子ペプチドとは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの１８種類からなるアミノ酸が２分子以上結合したペプチドの内、分子量３０００以下のすべてのペプチドを指している。これらの分子量３０００以下の低分子ペプチドは、人体への吸収性がよく、吸収された成分が抗酸化性やコラーゲン産生促進能、コラゲナーゼ阻害活性、血圧上昇抑制作用に代表されるプラセンタ由来の蛋白質の抽出物の機能性を発揮しやすいのである。
　分子量３０００より大きいペプチドとは、アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの１８種類からなるアミノ酸が２分子以上結合したペプチドの内、分子量３０００より大きいすべてのペプチドを指している。
　その他成分とは、ミネラルに代表される無機成分や脂質、炭水化物などでペプチド、アミノ酸以外のすべての成分を指している。これらのその他の成分は、分離、抽出で全てを取り除くことが困難であり、プラセンタ抽出物中で、全固形分量の０．５ｗｔ％以上は含まれるのである。
　なお、本明細書における構成アミノ酸とは、プラセンタおよびプラセンタ抽出物を構成するすべてのタンパク質、遊離アミノ酸、ペプチド中に含まれるアミノ酸の総量を指している。つまり、分子量、単体／複合体に関係なくすべての蛋白質、ペプチドを構成するアミノ酸と単独に存在する遊離アミノ酸を指している。
　本願における構成アミノ酸の具体的な説明をすると、遊離アミノ酸、分子量３０００以下の低分子ペプチド、分子量３０００より大きいペプチドであり、これら全てのアミノ酸を指しているのである。また、本願における構成アミノ酸量とは、遊離アミノ酸量と分子量３０００以下の低分子ペプチド量と分子量３０００より大きいペプチド量の合計量である。
　さらに、全ペプチドとは、分子量３０００以下の低分子ペプチド、分子量３０００より大きいペプチドのすべてペプチドであり、言い換えると、分子量に関らず、全てのペプチドを指しているのである。本願における全ペプチド量とは、分子量３０００以下の低分子ペプチド量と分子量３０００より大きいペプチド量の合計量である。
　さらに、分子量３０００以下の低分子ペプチドは、抽出物の全固形分中の重量比率で５５ｗｔ％以上であることが望ましい。よりペプチド含有量が高まり、抗酸化やコラーゲン産生促進能等の機能性を充分に発揮できるからである。
　プラセンタは、哺乳類のプラセンタ（胎盤）であれば、その動物の種類は限定されない。入手容易性の観点から、ヒト、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、イノシシ等の哺乳類が挙げられる。
　なお、プラセンタの原料にはタンパク、ペプチド、遊離アミノ酸以外にミネラルに代表される無機成分や脂質、炭水化物などのその他の成分も０．５ｗｔ％以上は含まれる。したがって亜臨界処理によってすべてのペプチドを分子量３０００以下にすることができても、低分子化されたペプチド含量の上限は９９．５ｗｔ％であると推測される。これは実験の積み重ねによる経験則に基づいて、得られた数値である。また、ペプチド含有量の上限も９９．５ｗｔ％であると推測される。
　本発明における亜臨界処理に用いる抽出剤として水を用いる場合、高温の水処理であれば液体状態でも気体状態でも利用することができる。即ち、亜臨界処理の処理槽へは、水蒸気を供給してもよく、水を供給してもよく、あるいはその両者を供給してもよい。水又は水蒸気の温度は望ましくは１００℃以上であり、望まれる反応場としては気体よりも液体状態の方が反応は進みやすいので、密閉に近い容器で強制的に液体の状態にしたいわゆる亜臨界の状態の水の使用が好ましい。
　亜臨界処理とは、所定温度及び圧力の条件下で亜臨界状態にした抽出剤としての亜臨界流体と抽出対象の原料（本発明ではプラセンタ）とを接触させることにより、抽出原料から所定の成分を抽出するものである。例えば、水は、圧力２２．１２ＭＰａ、温度３７４．１５℃まで上げると液体でも気体でもない状態を示す。この点を水の臨界点といい、臨界点より低い温度・圧力の熱水を亜臨界水という。亜臨界水は、誘電率低下とイオン積の向上により、優れた成分抽出作用と加水分解作用を有する。
　より具体的には、金属やセラミックスなどの耐圧容器にプラセンタと抽出剤である水を入れて、密閉状態に近い状態にし、水の亜臨界状態（温度：１００℃以上、圧力：飽和蒸気圧以上）で、両者の接触を一定時間以上行うことで得られる抽出物を亜臨界処理抽出物としている。
　亜臨界処理に用いる抽出剤は、水以外に、例えばエチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール、エタノール及びそれらの混合物が挙げられる。これらの中で、安全性の観点から水を用いるのが最も好ましい。
　次に抽出剤が水の場合の処理条件について説明する。
　プラセンタの亜臨界処理を行うための温度は、１６０－２００℃の間で行うことが望ましい。この温度範囲にすることにより、分子量３０００以下である低分子ペプチドを生成しやすいし、後述する高速液体クロマトグラフィーによる分子量分布測定にて相対的な吸光度が０．５以上の分子量領域に、異なる３つ以上の複数のピークをもつ分子量３０００以下の低分子ペプチドを得ることができる。
　亜臨界処理の温度が１６０℃未満では、分子量３０００以下である低分子ペプチドを生成させることが難しい傾向が見られる。亜臨界処理の温度が２００℃を越えると、生成された低分子ペプチドがさらに亜臨界反応を起こしてしまい、分子量３０００以下である低分子ペプチドの生成量を減少させる傾向が見られる。
　さらに、好ましくは、亜臨界処理の温度は、１８０－１９５℃にすることが望ましい。この範囲であれば、分子量３０００以下である低分子ペプチドを生成しやすいし、遊離アミノ酸の生成が１０ｗｔ％以下に抑制されやすいからである。
　プラセンタの亜臨界の処理圧力は、各温度の飽和蒸気圧以上（その一例としては、１６０℃のときには０．６１ＭＰａ以上、２００℃以上の時には１．５５ＭＰａ以上）で行うことが望ましい。この圧力にすることにより、分子量３０００以下の低分子ペプチドを生成しやすい。亜臨界処理の圧力の上限は特に定められないが、高圧装置の仕様上、２０－３０ＭＰａあたりに抑えることが望ましい。
　プラセンタの亜臨界の処理時間は、５－３０分の間で行うことが望ましい。この処理時間の範囲にすることにより、低分子ペプチドを生成しやすくし、後述する高速液体クロマトグラフィーにて相対的な吸光度が０．５以上の分子量領域に、異なる３つ以上の複数のピークをもつ分子量３０００以下の低分子ペプチドを得ることができる。
　亜臨界の処理時間が５分未満では、低分子ペプチドを生成させることが難しい傾向が見られる。亜臨界の処理時間が３０分を越えると、生成された低分子ペプチドがさらに過分解を起こしてしまい、低分子ペプチドの生成量を減少させる傾向が見られる。
　さらに、好ましくは処理時間を１０－３０分にすることが望ましい。この範囲であれば、低分子ペプチドを生成しやすいし、遊離アミノ酸の生成を１０ｗｔ％以下に抑制されやすいからである。
　このとき、抽出剤を水とした場合におけるプラセンタの亜臨界処理による加水分解条件としては、処理温度は１６０－２００℃、処理圧力は各温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は５－３０分で行うことが望ましいのである。この条件で行うことで、低分子ペプチドを生成しやすいし、遊離アミノ酸の生成が抑制されるのである。
　さらに、好ましくは、処理温度は１８０－１９５℃、処理圧力は各温度の飽和蒸気圧以上、処理時間は１０－３０分で行うことが望ましいのである。この範囲であれば、固形分中の低分子ペプチドを４０ｗｔ％以上に生成しやすく、固形分中の遊離アミノ酸の生成を１０ｗｔ％以下に抑制しやすいだけでなく、後述する高速液体クロマトグラフィーにて相対的な吸光度が０．５以上の分子量領域に、異なる３つ以上の複数のピークをもつ分子量３０００以下の低分子ペプチドを得ることができるからである。
　亜臨界処理を経て得られる亜臨界処理物を、次いで固液分離して液体を回収することが好ましい。回収した液体をそのままプラセンタ抽出物を含む水溶液として用いることができる。また、回収した液体を乾燥させることによって固形状のプラセンタ抽出物を得ることができる。この固形状のプラセンタ抽出物を再度、水溶液に溶解させることによってプラセンタ抽出物を含む水溶液を得ることができるのは言うまでもない。
　亜臨界処理を経て得られた処理物の固液分離を行い、液体部分を得るには一般的な固液分離方法により行うことができ、具体的には、ろ紙を用いたろ過、遠心分離、デカンテーション、スクリュープレス、ローラープレス、ロータリードラムスクリーン、ベルトスクリーン、振動スクリーン、多重板振動フィルター、真空脱水、加圧脱水、ベルトプレス、遠心濃縮脱水、多重円板脱水のいずれかで行うことができるのである。
　固液分離後に得られた液体を乾燥させることによって固形状のプラセンタ抽出物を得ることができる。このための方法には一般的な乾燥方法を用いることができ、自然放置はもちろんのこと、加熱系である箱型乾燥や噴霧乾燥などの伝熱乾燥、マイクロ波乾燥などの内部発熱乾燥、非加熱系である凍結乾燥、真空乾燥、吸引乾燥、加圧乾燥、超音波乾燥等が可能である。一般的に簡便なオーブン、恒温槽を用いて乾燥することももちろん許容される。
　この亜臨界処理で得られたプラセンタ抽出物は、液体、固形分を問わず低分子ペプチド抽出物として得ることができるのである。
　以下、実施例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
（プラセンタ抽出物の製造）
実施例１
　容積２Ｌの耐圧容器に、ブタ胎盤（東京芝浦臓器；以下、ブタプラセンタと呼ぶ）　２００ｇ、蒸留水　２００ｇを入れて、処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０ＭＰａ、処理時間１０分間で亜臨界処理を行った。
　亜臨界処理を終了後、耐圧容器内の処理物を回収し、セルロース製ろ紙（孔径：１μｍ、商品名：５Ｃ　Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）でろ過し、ろ過液を回収した。そのろ過液について凍結乾燥を行うことで、プラセンタ抽出物を得た。以降、この抽出物を試料と呼ぶ。
実施例２
　処理温度：１８０℃、処理圧力：１．０ＭＰａ、処理時間３０分間で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で行った。
実施例３
　処理温度：１８８℃、処理圧力：１．２ＭＰａ、処理時間２０分間で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で行った。
実施例４
　処理温度：１９５℃、処理圧力：１．６ＭＰａ、処理時間１０分間で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で行った。
実施例５
　処理温度：１９５℃、処理圧力：１．６ＭＰａ、処理時間３０分間で亜臨界処理を行った以外は、実施例１と同じ条件で行った。
比較例１
（酵素処理による抽出物の作製条件）
　ブタプラセンタ２００ｇ、水５０ｍｌ、蛋白質加水分解酵素Ａｌｃａｌａｓｅ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）４ｍｌ、２５ｗｔ％水酸化ナトリウム２ｍｌを添加し、６０℃で３時間反応させた。その後、９０℃で１時間処理し、酵素を失活させた処理液をセルロース製ろ紙（孔径：１μｍ、商品名：５Ｃ　Ａｄｖａｎｔｅｃ社製）によりろ過液を回収した。そのろ過液について凍結乾燥を実施し、粉末化した。
比較例２
　ブタ胎盤の酵素処理品として、酵素処理されたプラセンタ粉末抽出物の市販品Ａを用いた。なお、市販品Ａとは、ブタ胎盤をパパインで３５℃、２時間の条件でプロテアーゼ処理し精製したものである。
（分子量分布の評価方法）
　実施例１～５および比較例１～２の試料を用いて、分子量分布の評価を行った。
　分析方法はプラセンタ粉末を蒸留水に溶解させ４ｗｔ％溶液を作製し、０．４５μｍメンブランフィルターによりろ過し、高速液体クロマトグラフィー（アジレントテクノロジー社製ＨＰ１１００シリーズ）による測定を行った。
　分析条件については、カラム（東ソー社製　品番：ＴＳＫ ｇｕａｒｄ ｃｏｌｕｍｎ ＳＷＸＬ（６．０ｍｍ Ｉ.Ｄ.×４０ｍｍ）およびＴＳＫｇｅｌ Ｇ２０００ＳＷＸＬ（７．８ｍｍ Ｉ.Ｄ.×３００ｍｍ）を用い、溶離液を０．１ｗ／ｖ％ ＴＦＡ　ｉｎ　ＭｅＣＮ／Ｈ2Ｏ＝４５／５５、カラム温度３５℃、流速１．０ｍＬ／ｍｉｎ、検出ＵＶ２２０ｎｍ、導入量２０μＬ、分析時間３０ｍｉｎにて分子量分布測定用の標準試薬としてＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｃ（和光純薬工業）分子量１２,５００、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ（ＣＡＬＢＯＣＨＥＭ）分子量６,５１２、Ｂａｃｉｔｒａｃｉｎ(Ｄｒ.Ｅｈｒｅｎｓｔｏｒｆｅｒ)分子量１,４２３、Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ　II（ペプチド研究所）分子量１,０２６、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｔｙｒ－Ａｒｇ（ペプチド研究所）分子量４５１、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ペプチド研究所）分子量１８９により同様な測定で検量線を作成し、溶離時間に対する分子量位置を決め、分子量分布、および分子量分画範囲におけるピーク面積を求め、分子量比率を求めた。結果を表１に示す。
　なお、今回得られた分子量は、すべての試料においてその上限が用いたカラムの限外排除分子量（約１０万）以下であり、溶出が開始する時間から算出される最大の分子量は約２万であった。よって上記実施例・比較例において原料中に含まれていたタンパク質は、すべて分子量約１０万以下、さらには約２万以下のペプチドの形態に変換されて試料中に含まれていることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　図１～図３は、実施例５、比較例１及び比較例２で得られた試料を高速液体クロマトグラフィーで分析して得られた分子量分布のチャートである。このチャートの下側の横軸は溶出時間（ｍｉｎ）を示し、上側の横軸は対応する分子量を示し、縦軸は相対的な吸光度を示す。実施例５においては分子量５００前後の分子量領域、分子量２５０前後の分子量領域、分子量２５０未満の分子量領域（ただし、今回用いたカラムの性質により分子量約３００以下は検量線の挙動から分子量を見積もることが難しく、正確な分子量は測定できないが、上記実験条件からは分子量２５０未満と表現することとする。）のそれぞれの３つ領域に大まかなピークを持つ分子量分布が観察された。
　これに対して、比較例１及び比較例２においては分子量２５０付近の分子量領域に一つのピークを持つ分子量分布が観察されるのみであった。実施例５の３つのピークの傾向はその他の実施例１～４においても観察され、亜臨界条件では既存の酵素処理で得られるペプチドのみならず、既存の酵素処理では得られない分子量分布を持つペプチドも含む抽出物が得られている。
（遊離アミノ酸量、構成アミノ酸量の測定）
　実施例１～５と比較例１～２の試料の構成アミノ酸と遊離アミノ酸の分析を行った（なお、分析は一般財団法人食品分析開発センターＳＵＮＡＴＥＣにて依頼し行った。）。
　各試料を過ギ酸酸化処理後、塩酸加水分解を実施した。アルギニン、リジン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン、アラニン、グリシン、プロリン、グルタミン酸（グルタミン含む）、セリン、スレオニン、アスパラギン酸（アスパラギン含む）、シスチン、トリプトファンの計１８種類を測定した。なお、トリプトファン以外の分析は、アミノ酸自動分析機にて測定し、トリプトファンについては高速クロマトグラフ法にて測定した。
　遊離アミノ酸については試料をそのまま各アミノ酸について同様の分析にて測定した。これらについて１８種の遊離アミノ酸量および構成アミノ酸量を各々合計し、その結果より、抽出物の固形分中遊離アミノ酸量、構成アミノ酸量を求めた。さらに表１の結果より、各ペプチド（ペプチド、分子量３０００以下のペプチド、分子量３０００より大きいペプチド）の量を求めた。結果を表２に示す。
ペプチド量＝構成アミノ酸量－遊離アミノ酸量
分子量３０００以下のペプチドの量＝（構成アミノ酸量）＊（分子量３０００以下の分子量分布割合）－遊離アミノ酸量
分子量３０００より大きいペプチドの量＝（ペプチド量－分子量３０００以下のペプチドの量）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（機能性の評価：ＳＯＤ様活性の測定による抗酸化性の評価）
　実施例１～５と比較例１～２の試料についてＳＯＤ様作用活性の測定を行った。
　ＳＯＤ様作用活性の測定にはＳＯＤ測定キット（同仁化学製）を使用した。そこから、阻害率を求め、ＳＯＤ様活性を５０％阻害する添加物の濃度（ＩＣ５０値）を算出した。結果を表３に示す。
阻害率（％）
＝１－（試料溶液の酵素反応後の吸光度－酵素の代わりに緩衝液と添加したときの試料溶液の吸光度）／（ブランクの酵素反応後の吸光度－酵素の代わりに緩衝液と添加したときのブランクの吸光度）×１００
　表３より、本発明品（実施例１～実施例５）の抗酸化能は、従来品（比較例１～比較例２）よりも顕著に高いことが分かった。
（機能性の評価：ＯＲＡＣ評価による抗酸化性の評価）
　抗酸化評価試験としては、ＯＲＡＣ評価、即ち、ラジカル発生剤であるＡＡＰＨ（２，２‘－Ａｚｏｂｉｓ［２－ａｍｉｄｉｎｏｐｒｏｐａｎｅ］ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）が発生する活性酸素が蛍光物質フルオレセインを分解し、その蛍光強度を経時的に測定することによって、その減少曲線の面積を算出し、標準物質と比較することによって行った。
　上記の試料等に抗酸化物質が存在すれば活性酸素を消去するため、フルオレセイン分解速度が遅延する。これを抗酸化物質の標準物質である水溶性ビタミンEのトロロックス（Ｔｒｏｌｏｘ：６－Ｈｙｄｒｏｘｙ－２,５,７,８－ｔｅｔｒａｍｅｔｙｌｃｈｒｏｍａｎ－２－ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ ａｃｉｄ）存在下のフルオレセイン分解速度の遅延度合いと比較し、単位としてＴＥ（Ｔｒｏｌｏｘ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ：水溶性ビタミンＥ相当量）として算出される。この算出された数値が大きければ、上記の処理液等の抗酸化能が大きいということになる。
　実施例５と比較例２の試料を用いて、アセトン：水：酢酸（７０：２９．５：０．５）の混合液（１ｍｌ）にて再溶解したもの（２０μｌ）、１００μＭのトロロックス水溶液を適時希釈した希釈溶液（２０μｌ）、ブランク（アセトン：水：酢酸(７０：２９．５：０．５)の混合液（２０μｌ）をマイクロプレートに分注し、９４．４ｎＭフルオレセインナトリウム塩（２００μｌ）を添加して、空気下の恒温器内で３７℃で３０分振とうした。３１．７ｍＭのＡＡＰＨ（７５μｌ）を添加し、蛍光プレートリーダーＴＥＣＭＡＮ ＩｎｆｉｎｉｔｅＦ２００を用いて励起波長Ｅｘ４８５ｎｍ、蛍光波長Ｅｍ５３８ｎｍで２分おきに、ＡＡＰＨ添加から９０分後までの蛍光強度を測定した。
　抗酸化値は、抽出物量当たりのＴＥ（μｍｏｌ ＴＥ／ｇ）として換算した。各サンプルの抗酸化値の結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４より、本発明品（実施例５）の抗酸化能は、従来品（比較例２）よりも顕著に高いことが分かった。
（機能性の評価：コラーゲン産生促進評価による美肌への効果）
　実施例５の試料と比較例２の試料を用いて、コラーゲン産生促進評価を行った。
　液体窒素中に保存している正常ヒト繊維芽細胞（ＮＢ１ＲＧＢ）を解凍し、試験に供するのに十分な細胞となるまで５ｗｔ％ＦＢＳ(牛胎児血清）含有ＤＭＥＭ培地（Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）にて培養を行った。
　培養を行った試料を０．５ｗｔ％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地で３倍希釈し、合計４濃度試験溶液を調製した。試験に供するのに十分な数となった細胞をトリプシン処理により回収した後、９６ウェルマイクロプレートの各ウェルに播種し、２４時間前培養を行った。その後、９６ウェルマイクロプレートから５％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地を除去し、各濃度の試料を含む培地に置き換え、さらに４８時間培養を続けた。ヒトコラーゲン（Ｉ型）ＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法のプロトコルに従って、試験試料によるコラーゲン生成量を算出した。
　また、細胞を培養した９６ウェルマイクロプレートから培地を除去し、ＭＴＴ（３－（４，５－ｄｉ－ｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ）－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ，　ｙｅｌｌｏｗ　ｔｅｔｒａｚｏｌｅ）アッセイにより細胞生存率を測定し、細胞生存率１００％当たりのコラーゲン濃度（μｇ／ｍｌ）を算出した。結果を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５より、本発明品（実施例５）のコラーゲン産生促進能は、従来品（比較例２）よりも顕著に高いことが分かった。このことから、本発明品はヒトの肌を美しく保つ効果があることが示唆された。
（機能性の評価：コラゲナーゼ阻害活性評価による美肌への効果）
　実施例５の試料と比較例２の試料を用いて、コラゲナーゼ阻害活性評価を行った。
　各試料の希釈液（試料添加濃度　４ｗｔ／ｖｏｌ％、試料添加濃度　２０ｗｔ／ｖｏｌ％の２サンプルを用意した。）に対し、Ｐｚペプチド液（ＢＡＣＨＥＭ　Ｆｅｎｉｃｈｅｍｉｋａｌｉｅｎ　ＡＧ社製、商品名：Pz－ペプチド）、コラゲナーゼ液（シグマ社製、商品名：コラゲナーゼＴｙｐｅ　ＩＶ）を添加し、３７℃にて反応させた。その後、２５ｍｍｏｌ／Ｌ　クエン酸溶液を加えて反応を停止させ、酢酸エチルを加え、遠心分離を行った。波長３２０ｎｍにて酢酸エチル層の吸光度を測定し、コラゲナーゼ活性阻害率(％)を算出した。結果を表６に示す。
コラゲナーゼ活性阻害率（％）
＝１－（試料溶液の反応後の吸光度－酵素の代わりに精製水と添加したときの試料溶液の吸光度）／（ブランクの反応後の吸光度－酵素の代わりに精製水と添加したときのブランクの吸光度）×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６より、本発明品（実施例５）のコラゲナーゼ活性阻害能は、従来品（比較例２）よりも顕著に高いことが分かった。このことから、本発明品はヒトの肌を美しく保つ効果があることが示唆された。
（機能性の評価：ＡＣＥ阻害活性評価による血圧上昇抑制効果）
　実施例５の試料と比較例２の試料を用いて、ＡＣＥ阻害活性評価を行った。
　各試料１．０ｇを５０ｖｏｌ％エタノール溶液２０ｍｌで抽出後、０．１ｍｏｌ／ｌ ＨＥＰＥＳ（４－（２－ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）－１－ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ　ａｃｉｄ）緩衝液（ｐＨ８．３）で１０倍希釈して試験溶液を調製した。０．１ｍｏｌ/ｌ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．３）（未処置区）または試験溶液を９６穴マイクロプレートに２５μｌ加え、２０ｍＵ／ｍｌ ＡＣＥ溶液を２５μｌ加えて３７℃で５分間保温した。８ｍｍｏｌ／ｌ Ｈｉｐ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ（Ｈｉｐｐｕｒｙｌ－Ｌ－ｈｉｓｔｉｄｙｌ－Ｌ－Ｌｅｕｃｉｎｅ）溶液を２５μl加え、３７℃で３０分間反応した。
　その後、０．１　ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウム溶液を２５μｌ加えて反応停止し、１ｗｔ％ ＯＰＡ（ｏ－Ｐｈｔｈａｌａｌｄｅｈｙｄｅ）溶液を２５μｌ加え、室温で２０分間放置した。さらに、０．１ｍｏｌ／ｌ 塩酸を２５μｌ入れて室温で１０分間放置し、マイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ２ｅ　モレキュラーデバイス ジャパン株式会社社製）を用いて励起波長３５５、蛍光波長４６０ｎｍでの蛍光強度を測定した。なお、ブランクは２０ｍＵ/ｍｌ ＡＣＥ溶液の代わりにリン酸緩衝液（ＰＢＳ）を用いて、上述と同様に試験した。そこから阻害率を求め、ＡＣＥ活性を５０％阻害する試料濃度としてＩＣ５０値を算出した。結果を表７に示す。
ＡＣＥ活性阻害率（％）
＝１－（試料溶液の反応後の蛍光強度－酵素の代わりにＰＢＳと添加したときの試料溶液の蛍光強度）／（ブランクの反応後の蛍光強度－酵素の代わりにＰＢＳと添加したときのブランクの蛍光強度）×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表７より、本発明品（実施例５）のＡＣＥ活性阻害能は、従来品（比較例２）よりも顕著に高いことが分かった。このことから、本発明品は血圧上昇抑制効果を有することが示唆された。
　以上のように、亜臨界処理により得られたプラセンタ抽出物は、遊離アミノ酸含量が１０ｗｔ％以下、０．１ｗｔ％以上であり、分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドを４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下の主成分として含むものを得ることができ、機能性が高いことが示された。
（機能性の評価：エラスターゼ阻害活性評価による美肌への効果）
　エラスターゼはエラスチンを分解する能力を有するプロテアーゼの一種であり、エラスチンの減少は肌のシワの発生の一因と言われている。よって、エラスターゼの活性を阻害する成分は、ヒトの肌を美しく保つ効果を有することが期待できる。
　そこで、実施例５の試料と比較例１、比較例２の試料を用いて、エラスターゼ阻害活性評価を行った。
　各試料の希釈液５０μｌに１ｍＭ　Ｎ－Ｓｕｃｃｉｎｙｌ－Ａｌａ－Ａｌａ－ｐ－ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ（Ｂｉｏｃｈｅｍ ＡＧ製）／５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ）緩衝液（ｐＨ８．８）を１００μＬ、酵素溶液として０．５ｕｎｉｔｓ／ｍｌ豚由来膵臓エラスターゼ（和光純薬製）／５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）を添加し、３７℃にて１５分反応させた。その後、反応液の吸光度を波長４０５ｎｍで測定し、エラスターゼ活性阻害率(％)を算出し、エラスターゼ活性を５０％阻害する試料濃度としてＩＣ５０値を算出した。結果を表８に示す。
エラスターゼ活性阻害率（％）
＝１－（試料溶液の反応後の吸光度－酵素の代わりに精製水と添加したときの試料溶液の吸光度）／（ブランクの反応後の吸光度－酵素の代わりに精製水と添加したときのブランクの吸光度）×１００
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表８より、本発明品（実施例５）のエラスターゼ活性阻害能は、従来品（比較例１、比較例２）よりも顕著に高いことが分かった。このことから、本発明品はヒトの肌を美しく保つ効果があることが示唆された。
　本発明のプラセンタ抽出物は抗酸化能、コラーゲン産生促進能、コラゲナーゼ活性阻害能、ＡＣＥ阻害能等の機能を有するので、医薬品原料に用いたり、化粧料の配合成分やドリンク、サプリメント等の食品に用いたりすることができる。

Claims (13)

  1. 　遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
    　ペプチドの含有量が全固形分中の７０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下である、プラセンタ抽出物。
  2. 　遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
    　分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドの含有量が全固形分中の４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下である、プラセンタ抽出物。
  3. 　プラセンタ原料の亜臨界処理を経て抽出される請求項１又は２に記載のプラセンタ抽出物。
  4. 　前記亜臨界処理は、処理温度１６０－２００℃である請求項３に記載のプラセンタ抽出物。
  5. 　前記亜臨界処理は、処理時間５－３０分である請求項３又は４に記載のプラセンタ抽出物。
  6. 　亜臨界処理を経て得られる処理物を、次いで固液分離処理して液体を回収する工程をさらに含む、請求項３～５のいずれか１項に記載のプラセンタ抽出物。
  7. 　請求項１～６いずれか１項に記載のプラセンタ抽出物を含む水溶液。
  8. 　プラセンタ原料と抽出剤とにより亜臨界処理することによって、
    　遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
    　ペプチドの含有量が全固形分中の７０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物を製造する方法。
  9. 　プラセンタ原料と抽出剤とにより亜臨界処理することによって、
    　遊離アミノ酸の含有量が全固形分中の１０ｗｔ％以下であり、
    　分子量が３０００以下である低分子化されたペプチドの含有量が全固形分中の４０ｗｔ％以上、９９．５ｗｔ％以下であるプラセンタ抽出物を製造する方法。
  10. 　前記亜臨界処理は、処理温度１６０－２００℃である請求項８又は９に記載のプラセンタ抽出物を製造する方法。
  11. 　前記亜臨界処理は、処理時間５－３０分である請求項８～１０いずれか１項に記載のプラセンタ抽出物を製造する方法。
  12. 　前記抽出剤は、水、エチレン、エタン、プロパン、二酸化炭素、メタノール及びエタノールからなる群より選択される１種類以上である、請求項８～１１いずれか１項に記載のプラセンタ抽出物を製造する方法。
  13. 　亜臨界処理を経て得られる処理物を、次いで固液分離処理して液体を回収する工程をさらに含む、請求項８～１１いずれか１項に記載のプラセンタ抽出物を製造する方法。
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