KR101751718B1

KR101751718B1 - 항주름 효능을 가지는 저분자 말태반 효소가수분해물의 제조방법

Info

Publication number: KR101751718B1
Application number: KR1020170021650A
Authority: KR
Inventors: 오용환; 최면; 김경곤; 김태우
Original assignee: 주식회사 에스제이인터내셔널
Priority date: 2017-02-17
Filing date: 2017-02-17
Publication date: 2017-06-30
Also published as: WO2018151560A1; US20200268644A1

Abstract

본 발명은 저분자 말태반 효소가수분해물의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명에 의할 경우, 전처리 및 최적의 효소처리 발굴을 통해, 말태반 추출물을 저분자화 시킬 수 있다. 본 발명에 의해서 저분자화된 말태반 가수분해물은 분자량이 작아 우수한 피부침투성을 나타낼 수 있다.

Description

항주름 효능을 가지는 저분자 말태반 효소가수분해물의 제조방법 {Method for production of low molecular enzyme hydrolysate of horse placenta with function of anti-wrinkle}

본 발명은 저분자 말태반 효소가수분해물의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항주름 효능을 가지는 저분자 말태반 효소가수분해물의 제조방법에 관한 것이다.

피부는 표피, 진피 및 피하지방으로 이루어진 몸의 외피로서, 다양한 환경적인 요인에 대해 신체를 보호하는 물리적 장벽의 기능, 촉각 및 온도 조절 등의 역할을 한다. 하지만, 산업화된 현대 사회에서는 서구화된 생활습관, 스트레스 및 환경오염으로부터 야기되는 자외선 양의 증가로 인해 피부를 손상 및 노화를 야기시키고 있다.

피부의 노화는 시간이 지남에 따라 호르몬 분비가 감소하고, 면역세포의 기능과 활성이 저하되어 생체 구성 단백질들의 생합성이 줄어들게 되어 유발되는 내인성 노화와 오염된 공기, 약물이나 자외선 등에 의한 외인성 노화로 나뉜다 (Park HR et al., Journal of Investigative Cosmetology. 7: 115-122. 2011).

외인성 노화 중에서도 특히, 자외선은 피부 표면 각질층의 유연성을 상실시키고, 피부가 건성이 되게 하며, 거칠어지게 만든다. 또한, 자외선은 교원질의 합성을 감소시키며 세포 외 기질 단백질 분해 효소인 'MMPs(matrix metalloproteinase)' 발현을 증가시킨다 (Jin Young Seo et al., Korean Journal of Investigative Dermatology. 8(4):187-194. 2001). 이로 인해 피부 내 교원질의 양이 부족해지고 탄력섬유가 변성되면서 주름살이 생기게 된다.

피부 주름을 개선하려고 가장 많이 사용되는 것으로는 레티놀(retinol)이 있다. 레티놀은 주름 기능성 식약처 고시형 원료로써 표피세포의 분화 및 재생을 조절하는 것으로 알려 있다 (Griffiths CE et al., The New England Jornal of Medicine. 329(8):530-535). 하지만, 레티놀은 우수한 효과를 가지고 있음에도 불구하고, 열 안정성이 낮아 열을 가했을 때 변형이 쉽고, 독성이 높아 피부자극을 유발하는 문제가 있다.

이와 같은 레티놀의 불안정성을 해결하기 위해, 최근에는 'ECM(Extra-Cellular Matrix)' 조절 성분으로 작약에서 추출한 파에오니플로린(paeoniflorin), 인삼 내에 존재하는 컴파운드 K(compound K) 등 다양한 천연 물질들이 피부 주름 개선 소재로 사용되고 있다.

그런데, 이러한 물질의 원료가 되는 작약과 인삼의 경우, 가격이 비싸 가격 경쟁력에서 취약하다는 단점이 존재한다. 피부 주름 개선용 식품 및 화장품 조성물의 경우 지속적인 원료의 공급 및 확보가 가능해야 한다는 점에서 가격 경쟁력을 가지면서도 효능이 뛰어난 생리활성 물질의 개발이 이루어져야 한다.

한편, 최근에 말태반(Horse placenta)으로부터 추출한 추출물이 색소 침착을 예방하는 작용뿐만 아니라 미백작용도 나타내며 (Mallick Set el., Pigment Cell Res. Feb 18(1), 25-33, 2005), 피부주름 억제 및 개선에 효능이 있음을 확인한 바 있다. 따라서, 이를 화장료 및 식품 등의 재료에 사용하고 있으나, 말태반 추출물에서는 특유의 냄새 및 불안정성으로 인해 쉽게 변폐되고, 고농도에서 사용시 피부에 자극이 나타나는 단점이 있다. 또한, 말태반 추출물은 고분자 물질로 이루어져 있어, 피부 침투성이 떨어지는 단점도 있다.

대한민국 특허등록번호 제10-0987302호 (등록일자 2010.10.06)에는, 말태반 추출물을 함유하는 주름개선 화장료 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2015-0117088 (공개일자 2015.10.19)에는, 마태반 발효물 및 생약성분을 이용한 피부 주름개선용 화장료 조성물이 기재되어 있다. 대한민국 특허공개번호 제10-2016-0129453호 (공개일자 2016.11.09)에는, 마태반 발효물 및 마유를 함유하는 피부 주름개선 화장료 조성물이 기재되어 있다.

본 발명에서는 고분자 물질로 이루어져 있어 피부 침투성이 낮은 말태반 추출물의 문제점을 해결하고자, 이를 적절히 저분자화 시킬 수 있는 기술을 개발하여 제공하고자 한다.

본 발명은 말 태반에 'Alcalase(알칼라아제) 2.4 L'이라는 명칭을 갖는 상업용 효소 및 '브로멜라인(Bromelain) BR 1200'이라는 명칭을 갖는 상업용 효소를 동시에 처리하는 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법을 제공한다.

본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법에 있어서, 상기 'Alcalase(알칼라아제) 2.4 L'과 '브로멜라인(Bromelain) BR 1200'는, 바람직하게 둘 중 어느 하나를 12~24시간 이상 또는 둘 모두를 12~24시간 처리하는 것이 좋다.

본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법에 있어서, 상기 말 태반 가수분해물의 제조방법은, 바람직하게 '플라보자임(flavourzyme)'이라는 명칭을 갖는 효소를 더 처리하는 것이 좋다.

본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법에 있어서, 상기 말 태반 가수분해물의 제조방법은, 상기 'Alcalase(알칼라아제) 2.4 L'과 '브로멜라인(Bromelain) BR 1200'의 처리 후, '플라보자임(flavourzyme)'을 처리하는 것이 좋다.

본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법에 있어서, 상기 말 태반 가수분해물의 제조방법은, 바람직하게 상기 효소 처리 전에 알칼리를 첨가하는 전처리 과정을 수행하는 것이 좋다.

본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법에 있어서, 상기 알칼리는, 바람직하게 KOH인 것이 좋다.

본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법에 있어서, 상기 말 태반 가수분해물은, 바람직하게 2,000~2,500 Da의 분자량을 갖는 것이 좋다.

본 발명에서는 전처리 및 최적의 효소처리방법을 통해, 말태반 추출물을 효율적으로 저분자화 시킬 수 있다. 본 발명에 의해서 저분자화된 말태반 가수분해물은 분자량이 작아 우수한 피부침투성을 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명의 저분자 말태반 가수분해물은 화장품의 원료로써 사용되기에 매우 적합하다 할 수 있다.

도 1은 Alcalase의 RSM 분석 결과이다.
도 2는 Papain T100MG의 RSM 분석 결과이다.
도 3은 FoodPro^®Alkaline Protease RSM 분석 결과이다.
도 4는 Bromelain BR 1200의 RSM 분석 결과이다.
도 5는 복합효소 종류에 따른 프로콜라겐 합성능 측정 결과이다.
도 6은 알칼라아제-브로멜라인 복합효소의 처리시간에 따른 프로콜라겐 합성능 측정 결과이다.
도 7은 엑소 타입 프로테아제인 플라보자임의 처리에 따른 프로콜라겐 합성능 측정 결과이다.
도 8은 효소 처리 전 KOH를 농도별로 처리한 후 프로콜라겐 합성능을 확인한 결과이다.
도 9는 양성대조군(JAPAN)과 실시예 4에서 제조한 본 발명 태반 가수분해물의 분자량을 비교한 결과이다.
도 10은 양성대조군(JAPAN)과 실시예 4에서 제조한 본 발명 태반 가수분해물의 프로콜라겐 합성능을 비교한 결과이다.

말 태반은 분자량이 높기 때문에 피부 침투성이 낮은 문제가 있다. 이는 우수한 피부 활성을 갖는 말 태반의 화장료 소재로써 사용 범위를 제한하는 문제를 유발한다. 따라서, 본 발명에서는 효소 처리 또는 전처리 과정을 통해 말 태반을 고수율로 저분화시키고, 이에 의해 수득된 가수분해물의 프로콜라겐 합성능을 측정함으로써 그 기능성을 확인하고자 하였다.

우선, 본 발명에서는 Alcalase 2.4 L, Papain T100MG, FoodPro^® Alkaline Protease, Bromelain BR 1200라는 명칭을 갖는 엔도 프로테아제 (endo protease) 4종에 의한 말 태반 가수분해물의 최적 추출 조건을 RSM(response surface methodology) 분석을 통해 확립하였다.

RSM에 의한 실험 결과, Alcalase 2.4 L은 효소 농도 0.5%(w/w), 처리 시간 24시간, pH 8.0의 조건에서 최적의 가수분해 수율 72.5446%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 또한, Papain T100MG는 효소 농도 0.2%(w/w), 처리 시간 14.4747시간, pH 5.0의 조건에서 최적 가수분해 수율 29.6816%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 또한, FoodPro^® Alkaline Protease는 효소 농도 1.0%(w/w), 처리 시간 21.4444시간, pH 8.0의 조건에서 최적의 가수분해 수율 74.5883%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다. 또한, Bromelain BR 1200는 효소 농도 0.05%(w/w), 처리 시간 24시간, pH 8.0의 조건에서 최적의 가수분해 수율 26.8868%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

한편, 본 발명에서는 상기 4종의 엔도 프로테아제를 복합 처리하여 가수분해물을 수득한 후, 이것이 갖는 세포 내 프로콜라겐 합성능을 측정하였는데, 실험 결과 'Alcalase(알칼라아제) 2.4 L'과 '브로멜라인(Bromelain) BR 1200'을 동시에 처리해 수득한 가수분해물 샘플이 다른 가수분해물 샘플에 비해 프로콜라겐 합성능이 우수한 것으로 나타났다.

이와 같은 결과를 바탕으로, 본 발명은 말 태반에 'Alcalase(알칼라아제) 2.4 L'이라는 명칭을 갖는 상업용 효소 및 '브로멜라인(Bromelain) BR 1200'이라는 명칭을 갖는 상업용 효소를 동시에 처리하는 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서 사용하는 '말 태반'은 말로부터 유래한 것으로, 말로부터 직접 수득하여 사용하거나, 시판 중인 것을 구입해서 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에서 있어서, 상기 'Alcalase(알칼라아제) 2.4 L'과 '브로멜라인(Bromelain) BR 1200'는, 바람직하게 둘 중 어느 하나를 12~24시간 또는 둘 모두를 12~24시간 처리하는 것이 좋다. 둘 중 어느 하나를 12시간 정도 처리했을 때, 프로콜라겐 합성능이 대조군(100%)보다 높게 나타났기 때문이다. 이때, 24시간을 넘어 처리하면, 처리시간 대비 효능의 증대가 미미하여 경제적으로 바람직하지 않다. 더욱 바람직하게는 이들 둘 효소를 모두 12~24시간 처리하는 것이 좋은데, 이들 효소를 각각 12시간씩 처리한 샘플에서 프로콜라겐 합성능이 가장 우수하게 나타났기 때문이다.

한편, 본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법은, 바람직하게 '플라보자임(flavourzyme)'이라는 명칭을 갖는 효소를 더 처리하는 것이 좋다. 이때, 바람직하게는 상기 'Alcalase(알칼라아제) 2.4 L'과 '브로멜라인(Bromelain) BR 1200'의 처리 후, '플라보자임(flavourzyme)'을 처리하는 것이 좋다. 플라보자임은 엑소(exo) 타입의 프로테아제인데, 이를 추가적으로 처리하였을 때, 그렇지 않은 경우에 비해 프로콜라겐 합성능이 더 높게 나타난 것을 확인할 수 있었다.

한편, 본 발명 말 태반 가수분해물의 제조방법은, 바람직하게 상기 효소 처리 전에 알칼리를 첨가하는 전처리 과정을 수행하는 것이 좋다. 효소처리 전에 알칼리를 첨가하여 전처리를 수행할 경우, 그렇지 않은 경우에 비해 프로콜라겐 합성능이 더 높게 나타나기 때문이다. 이때, 상기 알칼리는, 바람직하게 KOH인 것이 좋은데, 더욱 바람직하게는 0.1~1.0M 정도 처리하는 것이 좋다.

한편, 본 발명의 말 태반 가수분해물은, 바람직하게 2,000~2,500 Da의 분자량을 갖는 것이 좋다. 본 발명의 방법을 적용할 경우, 말 태반으로부터 2,000~2,500 Da의 분자량을 갖는 가수분해물을 얻을 수 있었고, 이 범위의 분자량을 갖는 가수분해물이 대조군 대비 우수한 프로콜라겐 합성능을 발휘하는 것으로 확인되었다.

이하, 본 발명의 내용을 하기 실시예 및 실험예를 통해 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

[ 실시예 1: 엔도 프로테아제 ( endo protease) 4종의 최적 처리 조건 탐색]

1. 실험 목적

국내에서 판매되는 산업용 프로테아제인 Alcalase 2.4 L, Papain T100MG, FoodPro^® Alkaline Protease, Bromelain BR 1200 4종을 구입하여 말 태반으로부터 가수분해물을 수득하는 수율의 최적화 조건을 탐색하였다.

말 태반에 효소처리시, 효소농도, 반응시간, 반응pH를 최적 수준으로 선정하기 위하여 response surface methodology(RSM) computer program(Minitab 17.1.0, Minitab lnc, USA)을 사용하여, Box-behanken 방법에 의해 실험조건을 설정하였다. 실험조건 및 범위는 효소마다 각각 다르게 하여 실험을 진행하였다.

2. 실험방법

(1) 효소 처리

① 효소별 독립변수(효소농도, 반응시간, pH) 설정하여 RSM 실험 계획 수립하였다.

② 조건별로 pH조정 후 효소 첨가하였다.

③ 조건별로 효소처리를 한 후 80℃에서 20분간 실활시켰다.

④ 실활된 효소처리물은 원심분리 8,000rpm, 10분 하여 상등액을 채취하였다.

(2) 수율 측정

① 효소처리 후 채취한 상등액을 필터 Vivaspin Turbo 4(5kDa)를 이용하여 5 kDa 이하 물질을 분리하였다.

② Vivaspin Turbo 4에 효소처리액 3 g을 넣고 7,500 RCF로 60분간 원심분리하였다.

③ 원심분리 후 5 kDa을 통과한 밑(Bottom) 부분을 동결건조하였다.

④ 동결건조된 밑 부분의 무게를 측정하여 실험 전 밑 부분의 무게와 차이를 측정하였다.

⑤ 수율 측정은 하기 수학식 1에 의하였다.

[수학식 1]

3. 실험결과

(1) Alcalase

실험범위 효소농도는 하기 표 1에서 보는 바와 같이 0.2~0.5%(w/w), 시간은 1~24시간, pH는 6.5~8이었다.

StdOrder	RunOrder	PtType	Blocks	효소농도	시간	pH	%
4	1	2	1	0.5	24	7.25	64.59436
2	2	2	1	0.5	1	7.25	27.44709
1	3	2	1	0.2	1	7.25	21.8254
10	4	2	1	0.35	24	6.5	40.23369
12	5	2	1	0.35	24	8	66.57848
8	6	2	1	0.5	12.5	8	63.60229
7	7	2	1	0.2	12.5	8	61.17725
11	8	2	1	0.35	1	8	53.68166
9	9	2	1	0.35	1	6.5	27.44709
5	10	2	1	0.2	12.5	6.5	38.69048
15	11	0	1	0.35	12.5	7.25	52.68959
13	12	0	1	0.35	12.5	7.25	46.51675
6	13	2	1	0.5	12.5	6.5	46.40653
3	14	2	1	0.2	24	7.25	57.20899
14	15	0	1	0.35	12.5	7.25	47.28836

실험결과는 상기 표 1 및 도 1과 같이 나타났다. 이와 같은 실험결과를 바탕으로, 효소 농도 0.5%(w/w), 처리 시간 24시간, pH 8.0의 조건에서 최적 수율 72.5446%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

(2) Papain T100MG

실험범위 효소농도는 하기 표 2에서 보는 바와 같이 0.01~0.2%(w/w), 시간은 1~24시간, pH는 5~7.5이었다.

StdOrder	RunOrder	PtType	Blocks	효소농도	시간	pH	%
5	1	2	1	0.01	12.5	5	9.589947
8	2	2	1	0.2	12.5	7.5	22.48677
11	3	2	1	0.105	1	7.5	7.495591
4	4	2	1	0.2	24	6.25	20.7231
13	5	0	1	0.105	12.5	6.25	18.29806
1	6	2	1	0.01	1	6.25	3.306878
10	7	2	1	0.105	24	5	19.17989
3	8	2	1	0.01	24	6.25	8.818342
2	9	2	1	0.2	1	6.25	15.10141
12	10	2	1	0.105	24	7.5	16.42416
9	11	2	1	0.105	1	5	13.77866
14	12	0	1	0.105	12.5	6.25	22.92769
6	13	2	1	0.2	12.5	5	30.97443
7	14	2	1	0.01	12.5	7.5	8.597884
15	15	0	1	0.105	12.5	6.25	22.48677

실험결과는 상기 표 2 및 도 2과 같이 나타났다. 이와 같은 실험결과를 바탕으로, 효소 농도 0.2%(w/w), 처리 시간 14.4747시간, pH 5.0의 조건에서 최적 수율 29.6816%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

(3) FoodPro^®Alkaline Protease

실험범위 효소농도는 하기 표 3에서 보는 바와 같이 0.25~1%(w/w), 시간은 1~24시간, pH는 7.5~9이었다.

StdOrder	RunOrder	PtType	Blocks	효소농도	시간	pH	%
12	1	2	1	0.625	24	9	54.12257
8	2	2	1	1	12.5	9	63.60229
2	3	2	1	1	1	8.25	25.68342
11	4	2	1	0.625	1	9	29.98236
1	5	2	1	0.25	1	8.25	22.81746
4	6	2	1	1	24	8.25	76.27866
9	7	2	1	0.625	1	7.5	30.09259
14	8	0	1	0.625	12.5	8.25	64.81481
5	9	2	1	0.25	12.5	7.5	53.13051
13	10	0	1	0.625	12.5	8.25	53.4612
15	11	0	1	0.625	12.5	8.25	65.36596
10	12	2	1	0.625	24	7.5	62.72046
7	13	2	1	0.25	12.5	9	43.65079
3	14	2	1	0.25	24	8.25	39.903
6	15	2	1	1	12.5	7.5	61.7284

실험결과는 상기 표 3 및 도 3과 같이 나타났다. 이와 같은 실험결과를 바탕으로, 효소 농도 1.0%(w/w), 처리 시간 21.4444시간, pH 8.0의 조건에서 최적 수율 74.5883%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

(4) Bromelain BR 1200

실험범위는 하기 표 4에서 보는 바와 같이 효소농도 0.005~0.05%(w/w), 시간은 1~24시간, pH는 6~8이었다.

StdOrder	RunOrder	PtType	Blocks	효소농도	시간	pH	%
5	1	2	1	0.005	12.5	6	10.58201
8	2	2	1	0.05	12.5	8	21.8254
7	3	2	1	0.005	12.5	8	15.10141
1	4	2	1	0.005	1	7	7.385362
11	5	2	1	0.0275	1	8	14.77072
12	6	2	1	0.0275	24	8	22.37654
13	7	0	1	0.0275	12.5	7	10.25132
9	8	2	1	0.0275	1	6	8.928571
4	9	2	1	0.05	24	7	21.27425
10	10	2	1	0.0275	24	6	19.06966
3	11	2	1	0.005	24	7	14.10935
2	12	2	1	0.05	1	7	9.14903
15	13	0	1	0.0275	12.5	7	12.12522
6	14	2	1	0.05	12.5	6	16.86508
14	15	0	1	0.0275	12.5	7	15.21164

실험결과는 상기 표 4 및 도 4와 같이 나타났다. 이와 같은 실험결과를 바탕으로, 효소 농도 0.05%(w/w), 처리 시간 24시간, pH 8.0의 조건에서 최적 수율 26.8868%를 얻을 수 있는 것으로 나타났다.

[ 실시예 2: 복합효소의 종류 및 처리 시간에 따른 프로콜라겐 합성능 측정]

1. 실험 목적

본 실시예에서는 복합효소의 종류 및 처리 시간에 따른 프로콜라겐 합성능을 측정해 보고자 하였다.

2. 프로콜라겐 합성능 측정 방법

DOPC (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine) 0.5 g과 콜레스테롤 50 mg, MPB-PE(1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p- maleimidophenyl)- butyramide]) 50 uL를 10 mL 클로로포름에 완전히 용해시킨 뒤 농축기를 이용하여 클로로포름을 제거하였다.

이후, PBS 버퍼 50 mL를 넣고 소니케이션을 이용하여 리포좀(liposome)을 제조하였다. 제조한 리포좀에 저분자 펩타이드 (말 태반에 가수분해효소를 처리하여 수득한 가수분해물)를 용해시킨 뒤 12시간 교반시키고, 리포좀을 세포에 처리하기 전에 10분 정도 소니케이션 후 세포에 처리하였다. 세포처리시 배양배지의 10%를 넘지 않는 용량으로 처리하였으며, 50 mg/mL 농도로 리포좀을 만들고, 1 mg/mL의 농도로 배지에 희석하여 세포에 처리하였다.

한편, WI-38 세포를 MEM(minimal essential medium) 89%, FBS(fetal bovine serum) 10%, PEST(penicillin-streptomycin) 1%의 배지 조성으로, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 세포가 80% 이상 배양되면 trypsin-EDTA를 이용하여 계대배양함으로써 세포수를 충분히 확보하였다. 6 well에 5×10⁵ cell/mL로 분주한 뒤 2일마다 배지를 교환해주며 가득찰 때까지 배양하였다.

소재 (저분자 펩타이드 함유 리포좀) 처리 12시간 전 FBS가 없는 배지로 교환하고 12시간 후 FBS가 없는 배지로 교환하고 소재 처리하였다. PBS로 세척이 완료된 세포에 PBS 500 uL를 넣고 스크레퍼를 이용하여 세포를 긁어낸 후 e-tube에 넣고 4℃, 5,000 rpm에서 원심분리하고 PBS를 제거하여 세포 펠렛 (cell pellet)을 만들었다.

세포 펠렛에 라이시스 버퍼 (lysis buffer) 1mL을 넣고 피펫을 이용하여 10-20회 up/down을 한 뒤 4℃, 10,000 rpm에서 원심분리하여 세포 찌꺼기를 제거하였다. 브래드포드(Bradford) 단백질 정량방법을 통해 단백질을 정량하였고, 키트내 동봉된 마이크로플레이트에 antibody-POD conjugate solution 100 uL와 세포 추출물 20 uL를 혼합하고 37℃에서 3시간 반응시켰다 (shanking 금지).

3시간 뒤 PBS를 400 uL씩 넣고 세척, 4회 반복한 뒤 키트 내 동봉된 기질 용액 (substrate solution)을 100 uL씩 넣고 실온에서 15분간 반응시켰다. 15분 후 황산을 100 uL씩 넣어 반응을 종결시키고, 450 nm에서 흡광도 측정한 뒤 대조군과 비교하여 프로콜라겐 생성량을 계산하였다.

[수학식 2]

프로콜라겐 합성능 = (소재 흡광도)/(대조군 흡광도) × 100

3. 실험 결과

(1) 복합효소 종류에 따른 프로콜라겐 합성능 측정

다양한 종류의 효소를 복합적으로 말 태반에 처리하여 가수분해물을 수득하였다. 이를 세포에 처리한 후 세포 내 프로콜라겐 합성능을 확인하였다. 실험 결과, 양성대조군(JAPAN)은 대조군 대비 118.8%로 프로콜라겐 합성능을 증가시켰으며, 본 발명에서 알칼라아제-브로멜라인(alcalase-bromelain)으로 효소처리한 실험군은 115.5%로 프로콜라겐 합성능을 증가시키는 것으로 확인되었다 (도 5). 도 5는 복합효소의 종류에 따른 프로콜라겐 합성능 측정 결과이다.

(2) 알칼라아제-브로멜라인 복합효소의 처리시간에 따른 프로콜라겐 합성능

상기 실험으로부터 선택된 알칼라아제-브로멜라인 복합효소의 최적 처리시간을 알아보고자 하였다. 알칼라아제-브로멜라인 복합효소의 처리시간에 따른 프로콜라겐 합성능을 확인한 결과, 알칼라아제 12시간, 브로멜라인 12시간 처리 실험군이 가장 높은 프로콜라겐 합성능(115.0 %)을 나타내었다 (도 6). 도 6은 알칼라아제-브로멜라인 복합효소의 처리시간에 따른 프로콜라겐 합성능 측정 결과이다.

[ 실시예 3: 엑소 타입 프로테아제 처리에 따른 프로콜라겐 합성능 측정]

1. 실험목적

본 실험에서는 상기에서 수행한 엔토 타입의 프로테아제 처리에 부가하여 엑소 타입의 프로테아제 처리가 프로콜라겐 합성능을 촉진시킬 수 있는지 확인해 보고자 하였다.

2. 실험방법

실험방법은 기본적으로 상기 실시예 2와 동일하게 하였다. 다만, 샘플로는 알칼라아제-브로멜라인 복합효소를 알칼라아제 12시간, 브로멜라인 12시간 각각 처리하여 수득한 샘플을 대상으로 하였다. 실험군은 이 샘플에 플라보자임(flavourzyme)이라는 엑소 타입의 효소를 추가로 더 처리하였다.

3. 실험결과

엑소 타입 프로테아제인 플라보자임의 처리에 따른 프로콜라겐 합성능을 확인한 결과, 플라보자임 처리 군(129.5 %)에서, 처리하지 않은 군(115.2 %)보다 높은 프로콜라겐 합성능을 확인할 수 있었다 (도 7). 도 7은 엑소 타입 프로테아제인 플라보자임의 처리에 따른 프로콜라겐 합성능 측정 결과이다.

[ 실시예 4: 전처리 추가에 따른 프로콜라겐 합성능 측정]

1. 실험목적

본 실험에서는 상기에서 확인한 엔도 타입의 복합효소 처리 및 엑소 타입의 효소 처리에 앞서, 전처리 (KOH 처리)를 수행하는 것이 프로콜라겐 합성능을 촉진시킬 수 있는지 확인해 보고자 하였다.

2. 실험방법

실험방법은 기본적으로 상기 실시예 2와 동일하게 하였다. 다만, 샘플로는 알칼라아제-브로멜라인 복합효소를 알칼라아제 12시간, 브로멜라인 12시간 각각 처리하고, 엑소 타입의 효소 플라보자임을 처리하여 수득한 샘플을 대상으로 하였다. 다만, 실험군은 엔도 타입의 복합효소 및 엑소 타입의 플라보자임 효소 처리 전에 KOH를 각각 0.1M, 0.5M, 1M 처리하여 전처리한 샘플이었다.

3. 실험결과

효소 처리 전 KOH를 농도별로 처리한 후, 프로콜라겐 합성능을 확인한 결과, 1M KOH 전처리시 프로콜라겐 합성능이 139.7%로 확인되었다 (도 8). 도 8은 효소 처리 전 KOH를 농도별로 처리한 후 프로콜라겐 합성능을 확인한 결과이다.

[ 실시예 5: 본 발명 태반 가수분해물의 분자량 및 프로콜라겐 합성능 측정]

1. 분자량 비교 분석

상기 실시예 4에서 제조한 본 발명 태반 가수분해물의 분자량을 MALDI-TOF를 통해 분석하고자 하였다.

태반 저분자 펩타이드의 질량을 분석하기 위해 성균관대학교 공동기기원의 matrix associated laser desorption ionization - time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF, UltrafleXtreme, Bruker)를 이용하여 측정하였다. 저분자 펩타이드는 5 mg/mL (5,000 ppm)의 농도로 증류수에 녹이고, 매트릭스(matrix)인 HCCA(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid)는 0.1% ACN(acetonitril)과 TFA(trifluoroacetic acid)가 3:7 비율로 혼합된 용액에 20 mg/mL (20,000 ppm)에 녹였다. 시료와 매트릭스는 1:10 비율로 혼합하고, 측정용 플레이트에 올린 뒤 실온에서 건조시킨 후, 기기에 넣어서 측정하였다. 측정조건은 하기 표 5와 같았다.

	Reflector Mode	Liner Mode
Ion source voltage 1	25 kV	25 kV
Ion source voltage 2	22.8 kV	23.2 kV
Reflector voltage 1	26.45 kV	0 kV
Reflector voltage 2	13.4 kV	0 kV
Reflector detector	2.484 kV	2.484 kV
Liner detector	-	2.944 kV
Laser beam attenuation	30	30
Laser beam focus	35	35
Laser repetition rate	1000 Hz	1000 Hz
Test mode	Positive	Positive

실험 결과, 실시예 4에서 제조한 본 발명의 태반 가수분해물은 양성대조군(JAPAN) (3,500 ~ 4,000 Da) 보다 더 낮게 (2,000 ~ 2,500 Da) 분해된 것으로 확인되었다 (도 9). 도 9는 양성대조군(JAPAN)과 실시예 4에서 제조한 본 발명 태반 가수분해물의 분자량을 비교한 결과이다.

2. 프로콜라겐 합성능 비교 분석

양성대조군(JAPAN)과 실시예 4에서 제조한 본 발명 태반 가수분해물을 세포에 처리한 후 프로콜라겐 합성능을 확인하였다. 실험은 상기 실시예 2와 동일하게 하였다.

실험 결과, 본 발명 태반 가수분해물을 처리하였을 때, 프로콜라겐 합성능이 138.2%로 확인되었다 (도 10). 도 10은 양성대조군(JAPAN)과 실시예 4에서 제조한 본 발명 태반 가수분해물의 프로콜라겐 합성능을 비교한 결과이다.

Claims

말 태반에 알칼라아제(Alcalase), 브로멜라인(Bromelain) 및 플라보자임(Flavourzyme)을 처리하는 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법.
제1항에 있어서,
알칼라아제(Alcalase)와 브로멜라인(Bromelain)은,
둘 중 어느 하나를 12~24시간 처리하거나, 또는 둘 모두를 12~24시간 처리하는 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 말 태반 가수분해물의 제조방법은,
알칼라아제(Alcalase)와 브로멜라인(Bromelain)의 동시 처리 후, 플라보자임(flavourzyme)을 처리하는 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 말 태반 가수분해물의 제조방법은,
상기 효소 처리 전에 알칼리를 첨가하는 전처리 과정을 수행하는 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법.
제5항에 있어서,
상기 알칼리는,
KOH인 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 말 태반 가수분해물은,
2,000~2,500 Da의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는 말 태반 가수분해물의 제조방법.