KR20210068366A

KR20210068366A - 흰점박이꽃무지 유충의 효소 가수분해물을 함유하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR20210068366A
Application number: KR1020210071402A
Authority: KR
Inventors: 배성문; 이슬비; 김지혜; 이영한; 장영호
Original assignee: 경상남도
Priority date: 2018-08-07
Filing date: 2021-06-02
Publication date: 2021-06-09
Anticipated expiration: 2039-08-07
Also published as: KR102265019B1; KR102486956B1; KR20200016813A

Abstract

본 발명은 흰점박이꽃무지 유충의 효소 가수 분해물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 조성물은 우수한 멜라노마 세포 내 멜라닌 생성 억제 효과를 나타내었는바, 피부 미백 용도로 화장품과 같은 피부 외용제 조성물에 활용될 수 있다.

Description

흰점박이꽃무지 유충의 효소 가수분해물을 함유하는 피부 미백용 조성물{A composition for skin whitening comprising enzymatic hydrolysates of protaetia brevitarsis larva}

본 발명은 흰점박이꽃무지 유충의 효소 가수분해물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

사람의 피부색은 크게 멜라닌의 양, 헤모글로빈, 카로틴 등에 의해 결정되는데, 이 중에서 멜라닌이 가장 중요한 역할을 한다. 멜라닌은 사람의 피부색을 결정할 뿐만 아니라 피부 보호 작용[자외선 흡수 작용, 자유 라디칼 소거(Free Radical Scavenger)]의 역할을 하지만 자외선의 과량 노출, 대기오염, 스트레스 등 외부 환경 변화에 의해 과다하게 피부 내에 생성되면 색소 침착 현상이 일어나게 되어 피부색이 검게 되거나 기미, 주근깨 등의 원인이 된다. 상기 외부 자극 요인 중 자외선은 가장 큰 멜라닌 생합성 자극원으로서, 멜라닌 생성과 관련된 여러 가지 과정에 영향을 줄 수 있다. 즉, 자외선은 멜라닌 생성 세포인 멜라노사이트의 활성 촉진, 멜라닌 생합성 자극 호르몬 분비 촉진, 멜라닌의 산화 촉진, 또는 티로시나아제 활성 촉진 등을 통해 멜라닌 과다 생성을 유도하는 주요 요인으로 작용한다.

이러한 멜라닌 생성 메카니즘의 가장 큰 특징은 티로시나아제라는 단 한 개의 효소가 관여한다는 것으로, 상기 티로시아나제 활성을 억제하여 멜라닌 생성을 방지하게 되면 미백 효과를 기대할 수 있다.

지금까지 개발된 미백제는 멜라닌 생합성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 효소인 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 저해하여 멜라닌 양을 줄이는 것이 대부분이다. 구체적으로, 타이로시나제 저해제로 알려져 있는 하이드로퀴논(hydroquinone), 하이드록시아니솔(hydroxyanisole), 아스코르빅산(ascorbic acid) 유도체, 코직산(kojic acid), 아제락산(azelaic acid), 코티코스테로이드(corticosteroids), 레티노이드(retinoids), 알부틴(arbutin) 등이 있으나, 안전성, 경제성 등의 문제로 사용에 어려움이 있다. 특히, 하이드록시아니솔 및 하이드로퀴논 등은 강력한 멜라닌 생성 저해 활성은 있으나 동시에 색소 세포의 변성 또는 치사를 유발하고 세포 본래의 기능을 손상시키는 등의 부작용을 나타낸다. 또한, 코직산은 사용 중의 변색, 물질 자체의 불안정성 등의 문제점이 있다.

최근 국제식량농업기구(FAO)에서는 질병이나 환경오염으로 인한 식량부족 문제를 해결하기 위한 정책으로 미래 식량자원으로서의 식용곤충의 활성화 방안을 발표한 바 있고, 이에 대한 관심이 전 세계적으로 증대되고 있다. 이와 발맞추어 국내에서는 농림수산식품부가 "곤충산업육성 5개년 종합계획"을 발표하였고, 그에 따라 곤충 산업에 대한 지원이 이루어져 왔다.

곤충은 약 100만 종 이상 보고되었음에도 100만 종 이상이 아직 보고되지 않은 상태로 남아있다고 예측될 정도로 지구상에서 가장 다양성이 풍부한 종이다. 예로부터 곤충은 약용으로 사용해 왔으며, 그 중 누에, 메뚜기, 굼벵이, 지네 등은 당뇨, 염증성 질환, 간질환 및 동맥경화 등의 만성 질환 치료에 효과적이라는 연구결과가 보고되었다. 뿐만 아니라, 곤충을 미백 용도 등의 화장료 조성물로도 이용가능함을 확인한 연구결과도 계속 보고 되고 있다(대한민국 등록특허 제10-1429679호).

이에 본 발명자들은 생체에 부작용이 없으면서 미백 효과가 우수한 새로운 소재로 천연물질을 모색하던 중, 곤충 추출물에 주목하여 그 기능을 실험해 본 결과, 특히 곤충의 가수 분해 효소 추출물이 멜라닌 생성 억제 효과가 우수함을 발견하여 천연소재로서의 활용 가능성을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

상기 곤충의 효소 가수분해물은 장수풍뎅이, 집파리, 흰점박이 꽃무지, 갈색거저리, 동애등에, 누에, 메뚜기 및 귀뚜라미로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 곤충으로부터 수득된 것 일 수 있다.

곤충의 효소 가수분해물은 Pepsin(PS), trypsin(TS), Alcalase(AC), Neutrase(NT), Protease NP(PNP), Protamex(PMX), Pancreatin(P), Alphalase NP(ANP), Food Pro Alkaline protease(AK), 및 Promod 278P(PM)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질 가수분해 효소에 의해 제조된 것 일 수 있다.

본 발명에서 사용된 "효소 가수분해물"은 상기 언급된 1종 이상의 가수분해 효소에 의해 가수분해된 후의 생성물을 의미한다. 구체적인 일 실시예에서, 상기 곤충의 효소 가수분해물은 동결건조된 곤충의 분쇄물에 상기 언급된 효소를 처리하여 가수분해시킨 결과물을 피부 미백용 조성물에 사용하였다.

본 발명에서 사용된 "피부 미백"은 피부색에 영향을 미치는 멜라닌, 산화-환원 헤모글로빈, 카로틴, 멜라노이드 등 다양한 생체 분자의 생성을 억제함으로써 잡티, 주근깨, 기미 등의 피부 색소 침착 현상을 완화시키고, 피부 누런기, 붉은기를 완화시켜 피부 밝기 및 균일도를 향상시키는 효과를 의미한다.

상기 본 발명의 피부 미백용 조성물의 유효성분인 곤충 효소 가수분해물은 다음과 같은 단계를 거쳐 제조될 수 있다:

곤충을 동결건조시킨 후 분쇄하여 곤충분말을 제조하는 단계;

곤충 분말을 증류수에 용해시킨 후 배양하는 단계;

배양된 곤충 분말에 효소를 처리하여 가수분해하는 단계; 및

가수분해 결과물을 원심분리 후, 상청액을 여과한 뒤, 동결건조하여 최종 시료를 제조하는 단계를 포함하는 피부 미백용 곤충의 효소 가수 분해물 제조방법을 제공한다.

상기 가수분해하는 단계 이후에 실활 처리함으로써 효소를 불활성화시켜 최종시료가 피부에 적용시 내재된 효소가 더이상 활성을 나타내지 않도록 할 수 있다.

또한, 본 발명은 곤충의 효소 가수 분해물을 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

상기 조성물에서 곤충의 효소 가수분해물과 관련한 내용은 전술한 바와 동일하므로, 중복된 내용에 대해서는 기술을 생략한다.

상기 화장료 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 화장품과 같은 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 화장료 조성물은, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

본 발명은 곤충의 효소 가수분해물을 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 조성물은 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하여 미백효과를 나타내므로, 피부 미백을 위한 화장료 조성물의 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 장수풍뎅이, 집파리, 꽃무지, 갈색거저리, 등애등애, 누에, 메뚜기 및 귀뚜라미의 효소 가수분해물 처리에 따른 멜라노마 세포(melanoma cell) 내 멜라닌 생성량을 측정한 결과를 그래프화한 것이다.
도 2는 장수풍뎅이, 집파리, 꽃무지, 갈색거저리, 등애등애, 누에, 메뚜기 및 귀뚜라미의 효소 가수분해물 처리에 따른 멜라노마 세포(melanoma cell) 내 멜라닌 생성량을 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 3은 농도별 알부틴 처리에 따른 멜라노마 세포(melanoma cell) 내 멜라닌 생성량 변화를 나타낸 결과이다.
도 4는 집파리(AC), 꽃무지(PNP), 꽃무지(Trypsin), 갈색거저리(Trypsin) 및 누에(Trypsin) 5종의 곤충 효소 가수분해물을 농도별로 처리하여 멜라노마 세포(melanoma cell) 내 멜라닌 생성량 변화를 나타낸 결과이다.
도 5는 꽃무지(PNP) 효소 가수 분해물을 분자량별로 처리하여 멜라노마 세포(melanoma cell) 내 멜라닌 생성량 변화를 확인한 결과이다.
도 6은 꽃무지(PNP) 효소 가수 분해물을 농도별, 분자량별로 처리하여 멜라노마 세포(melanoma cell) 내 멜라닌 생성량 변화를 현미경으로 관찰한 사진이다.
도 7은 꽃무지(PNP) 효소 가수 분해물을 분자량별로 처리하여 멜라노마 세포(melanoma cell)에 대한 세포 독성을 확인한 결과이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실험예 ]

실험예 1. 실험 재료 및 실험 방법

1-1. 시료준비

시험에 사용된 곤충은 성충 2종(메뚜기, 귀뚜라미), 유충 6종(갈색거저리, 동애등에, 흰점박이꽃무지, 장수풍뎅이, 집파리, 누에) 등 총 8종의 곤충을 사용하였으며, 이들은 농업회사법인 나비 마을로부터 구입하여 사용하였다. 시료는 세척 후 동결된 상태로 구입하였으며, 동결 건조하여 시험시료로 사용하였다. 분쇄기를 이용하여 분쇄 후 분말을 이용하여 시험에 사용하였다.

1-2. 단백질 분해 효소의 처리 및 가수분해물의 수득

단백질 분해 효소는 단일 효소인 Pepsin(PS)과 trypsin(TS)는 시그마알드리치 사 제품을 사용하였고, 산업용 효소인 Alcalase (AC), Neutrase (NT), Protease NP (PNP), Protamex (PMX), Pancreatin (P), Alphalase NP (ANP), Food Pro Alkaline protease(AK), Promod 278P(PM)를 구입하여 사용하였다.

상기 실험예 1-1에서 제조된 곤충분 10mg을 400ml의 증류수에 용해시킨 후 진탕배양으로 6시간 배양하였다. 하기 표 1의 처리조건으로 단백질 분해 효소로 실활을 거친 효소처리액을 2000 rpm에서 원심 분리 후, 상청액을 진공감압여과기를 이용하여 여과한 뒤, 동결건조를 통하여 시료를 제조하였다. 각 시료에 대한 구체적인 정보는 하기 표 2에 나타내었다 (PS : pepsin, TS : Trypsin, AC: Alcalase, P: Pancreatin, ANP : Alphalase NP, NT : Neutrase, PNP : Protease NP, PMX : Protamex , AK : Food Pro Alkaline protease, PM : Promod 278P)

단백질 분해 효소 처리 조건

구분	처리온도 (℃)	시료 pH	처리농도 (%)	처리시간 (h)	효소실활조건
무처리	50	7	-	6	80℃, 10min
PM (Promod 278P)	50	7	1	6	80℃, 10min
Alphalase NP (AP)	50	7	1	6	80℃, 10min
Alcalase (AC)	50	7	1	6	80℃, 10min
Neutrase (NT)	50	7	1	6	80℃, 10min
pepsin (PS)	38	2	1	6	pH 7.5
Protamex (PMX)	50	7	1	6	80℃, 10min
Pancreatin (P)	50	7	1	6	80℃, 10min
Protease NP (PNP)	50	7	1	6	80℃, 10min
trypsin (TS)	38	7	1	6	80℃, 10min

효소 처리한 시료 라벨

No.	Name	No.	Name	No.	Name	No.	Name
1	장수풍뎅이(무)	14	꽃무지(펩신)	27	동애등애(무)	40	메뚜기(펩신)
2	장수풍뎅이(AC)	15	꽃무지(PMX)	28	동애등애(AC)	41	메뚜기(PMX)
3	장수풍뎅이(펩신)	16	꽃무지(AK)	29	동애등애(펩신)	42	메뚜기(AK)
4	장수풍뎅이(PMX)	17	꽃무지(PNP)	30	동애등애(트립신)	43	메뚜기(PNP)
5	장수풍뎅이(AK)	18	꽃무지(트립신)	31	누에(무)	44	메뚜기(트립신)
6	장수풍뎅이(PNP)	19	갈색거저리(무)	32	누에(AC)	45	귀뚜라미(무)
7	장수풍뎅이(트립신)	20	갈색거저리(AC)	33	누에(펩신)	46	귀뚜라미(AC)
8	집파리(무)	21	갈색거저리(NT)	34	누에(PMX)	47	귀뚜라미(PMX)
9	집파리(AC)	22	갈색거저리(펩신)	35	누에(AK)	48	귀뚜라미(AK)
10	집파리(펩신)	23	갈색거저리PMX)	36	누에(PNP)	49	귀뚜라미(PNP)
11	집파리(트립신)	24	갈색거저리(AK)	37	누에(트립신)	50	귀뚜라미(트립신)
12	꽃무지(무)	25	갈색거저리(PNP)	38	메뚜기(무)
13	꽃무지(AC)	26	갈색거저리(트립신)	39	메뚜기(AC)

1-3. 한외여과법을 이용한 곤충가수분해물의 정제 곤충의 단백질 가수분해물을 membrane filter(molecular weight cut-off : 100kDa, 10kDa, 5kDa, 1kDa)가 장착된 ultrafiltration kit(Amicon사 제품)에 넣고 질소 가스로 5bar 압력을 가하여 분자량 100kDa이상, 100kDa~10k.Da, 10kDa~5kDa, 5kDa~1kDa, 1kDa 이하로 분획하여, 여과 하고 분획물을 동결건조 하였다.

1-4. B16F10 melanoma cell의 멜라닌 생성 저해 확인( 미백활성 평가)

(1) B16F10 melanoma 배양

B16F10 melanoma(KCLB No. 80008)은 한국 세포은행으로부터 구매하였다. 세포는 열불활성화된 10% FBS와 100unit/ml penicillin-streptomycin을 첨가한 DMEM배지에서 배양하였다. 배양조건은 37℃, 5% CO2농도 대기에서 배양하고 배지는 2일마다 교체하였다.

(2) B16F10 melanoma내의 Melanin 함량 분석

α-MSH와 IBMX에 의해 유도되는 B16F10 세포의 멜라닌합성에 대한 시료의 저해활성을 측정하기 위해서 B16F10 melanoma를 12-well 세포 배양 플레이트에서 배양하였다.

B16F10 melanoma의 멜라닌 축적은 1μM α-MSH와 200μM IBMX, 시료를 첨가하여 72시간 동안 처리하여 진행하였다. 배지는 세포 외 멜라닌 정량을 위해서 수집되고 PBS를 이용하여 세포 세척 후, 세포는 200μL trypsin-EDTA로 배양하였다. 세포 내 멜라닌함량을 측정하기 위하여, 수거한 세포는 27,237 g에서 5분간 원심분리 하였다. 또한, 세포 펠렛은 1N NaOH와 10% DMSO 200μL에 100℃에서 10분간 녹였다. 세포 내-외 멜라닌 함량의 흡광도는 micro plate reader로 405nm에서 측정하였다. 멜라닌 함량은 무처리 세포에 대한 퍼센트로 계산하였다.

1-5. 곤충 효소 가수분해물의 B16F10 melanoma cell에 대한 세포독성 평가

시료에 대한 세포 생존율을 측정하기 위해서, B16F10 melanoma에 대한 MTT 분석을 실시하였다. 세포분열을 충분히 시킨 후, 세포에 시료를 농도별(10, 50, 100, 200 μg/mL 등의 농도로) 24시간 처리한 후 배지를 제거하고, 0.2mg/ml MTT-배지(10% FBS와 100unit/mL penicllin-streptomycin을 첨가한 DMEM과 PBS에 녹인 MTT 시약(pH 7.4)를 웰당 1mL첨가하고 세포를 30분간 배양하였다. 반응배지는 제거한 뒤 세포내의 불용성 formazan을 300μL DMSO로 녹였다. micoroplate reader로 570nm에서 각 세포의 흡광도를 측정하였다. 세포 생존율은 무처리구 세포대비 퍼센트로 계산하였다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 시료 50종의 미백활성 (멜라닌 생성 억제 능력) 확인

8종의 곤충을 효소 가수분해하여 제조한 50종의 시료에 대하여 B16F10 Melanoma cell에 50㎍/ml의 농도로 처리하여 멜라닌 색소의 생성 억제능을 확인하였다. 50종의 시료 중 집파리를 AC로 가수분해하였을 때 대조구 대비 -22.2%, 흰점박이꽃무지를 PNP로 가수분해하였을 때 -3.3%, 트립신으로 가수분해하였을 때 0.4%, 갈색거저리를 트립신으로 가수분해하였을 때 3.2%, 누에를 트립신으로 가수분해하였을 때 1.1%의 멜라닌 색소가 생성되어 강력한 미백효능을 확인하였다(표 3, 도 1 및 도 2).

곤충 효소가수분해물의 미백활성 ( B16F10 Melanoma cell내 멜라닌 생성량)

	멜라닌 색소 함량( % of control)
	장수풍뎅이	집파리	꽃무지	갈색거저리	동애등에	누에	메뚜기	귀뚜라미
무처리	29.5	34.3	17.6	17.4	32.9	35.5	24.3	15.3
AC	29.5	-22.2	40.8	57.3	31.7	34.7	33.0	25.6
펩신	26.9	52.8	8.0	43.6	33.6	34.7	34.4	-
PMX	12.2	-	23.3	68.0	-	28.2	29.9	31.8
AK	43.1	-	9.8	53.5	-	27.3	30.5	35.2
PNP	35.1	-	-3.3	51.4	-	10.0	28.7	30.3
트립신	14.2	10.2	0.4	3.2	29.3	1.1	18.5	29.3
NT	-	-	-	96.7	-	-	-	-

실시예 2. 미백활성 우수 5종과 알부틴의 미백활성 비교

실시예 1에서 멜라닌 색소 생성 억제력이 우수하였던 5종의 시료(집파리-AC 가수분해물, 흰점박이꽃무지-PNP 가수분해물, 흰점박이꽃무지-트립신 가수분해물, 갈색거저러-트립신 가수분해물, 누에-트립신 가수분해물)를 B16F10 Melanoma cell에 10, 25, 50 μg/mL의 농도로 처리하여 멜라닌 색소 생성 억제를 실험하였고, 대표적인 미백소재인 알부틴을 농도별로 처리한 멜라닌 색소 생성억제율을 분석하여 비교하였다.

알부틴은 13.6 μg/mL 농도에서 73.5%, 27.2 μg/mL의 농도에서 71.1% 멜라닌 색소의 생성율을 보인 알부틴과 비교해서(표 4 및 도 3), 흰점박이꽃무지 PNP는 10μg/mL농도에서 27.9%, 25 μg/mL농도에서 0.6%의 멜라닌 생성율을 보였고, 집파리 AC는 10μg/mL에서 35.4%. 25 μg/mL농도에서 -23.0%의 멜라닌 생성율을 보였으며, 흰점박이꽃무지 트립신은 10μg/mL에서 53.2% 25 μg/mL 농도에서 13%, 누에 트립신은 10μg/mL 농도에서 56.2%, 25 μg/mL 농도에서 7.2%, 갈색거저리 트립신은 10μg/mL 농도에서 87.1%, 25 μg/mL농도에서 20.2% 멜라닌 색소 생성비율을 보였으며(표 5 및 도 4), 대조구로 사용된 알부틴과 비교해서 미백효능(멜라닌 색소 생성 억제율)이 더 우수한 것으로 나타났다.

알부틴의 농도별 멜라닌 색소 생성 저해능 (( B16F10 Melanoma cell내 멜라닌 생성량)

Melanin content(% of control)
알부틴 농도 (㎍/ml)	0.3	1.4	2.7	6.8	13.6	20.4	27.2	68.0	136	272
멜라닌 생성량( % of control)					73.5	76.0	71.1	36.3	19.9	13.4

곤충효소가수분해물 5종의 농도별 멜라닌 색소 생성 저해능 ( B16F10 Melanoma cell내 멜라닌 생성량)

	Melanin content(% of control)
	10(μg/mL)	25(μg/mL)	50(μg/mL)
집파리(AC)	35.4	-23.0	-30.7
흰점박이꽃무지(PNP)	27.9	0.6	-12.8
흰점박이꽃무지(Trypsin)	53.2	13.0	-3.6
거저리(Trypsin)	87.1	20.2	2.6
누에(Trypsin)	56.2	7.2	1.6

실시예 3. 흰점박이꽃무지 - PNP 효소가수분해물의 분자량별 분획물의 미백활성 비교

흰점박이꽃무지-PNP 효소 가수분해한 시료는 시료농도 50 μg/mL에서 멜라노마 세포 내의 멜라닌 생성량은, 1KDa 이하에 79.7%, 1~5 KDa에서 66.6%, 5~10 KDa에서 69.6%, 10~100 KDa에서 46.4%, 100KDa 이상에서 68.8%로서, 10~100 KDa에서 멜라닌 생성을 억제하는 미백활성이 가장 우수하였다(표 6, 도 5 및 도 6).

흰점박이꽃무지 - PNP 효소가수분해물의 분자량별 미백활성 ( B16F10 Melanoma cell내 멜라닌 생성량)

	Melanin contents(% of control)
	10(μg/mL)	50(μg/mL)
~ 1 KDa	79.1 ± 0.83	79.7 ± 0.62
1~5 KDa	105.2 ± 0.46	66.6 ± 0.95
5~10 KDa	76.3 ± 0.61	69.6 ± 0.82
10~100 KDa	79.2 ± 0.44	46.4 ± 0.09
100KDa ~	75.7 ± 0.19	68.8 ± 0.54

실시예 4. 흰점박이꽃무지 - PNP 효소가수분해물의 미백세포 독성 검사

흰점박이꽃무지 PNP의 효소 가수분해물을 한외여과를 통하여 1 KDa 이하, 1~5 KDa, 5~10 KDa, 10~100 KDa, 100KDa 이상으로 5단계로 분리하여 10, 50, 100, 200 μg/mL농도에서 세포독성 검사를 한 결과 세포 생존율이 최저 83.2% 이상으로 세포독성이 없음을 알 수 있었다(표 7 및 도 7).

흰점박이꽃무지 - PNP 효소가수분해물의 분자량별 세포독성 검사 결과 ( B16F10 Melanoma cell에 대한 세포독성 검사)

분자량별 분획물	Cell vialbillity(% of control)(μg/mL)
분자량별 분획물	10(μg/mL)	50(μg/mL)	100(μg/mL)	200(μg/mL)
~ 1 KDa	88.9 ± 1.21	83.2 ± 4.25	86.6 ± 7.47	86.0 ± 10.09
1~5 KDa	93.1 ± 5.41	97.8 ± 6.71	94.5 ± 2.34	109.1 ± 8.49
5~10 KDa	102.4 ± 6.04	101.1 ± 9.21	95.1 ± 8.14	90.4 ± 5.26
10~100 KDa	92.8 ± 3.76	87.8 ± 5.22	89.1 ± 9.10	87.5 ± 5.65
100KDa ~	91.3 ± 6.34	90.3 ± 4.32	93.0 ± 9.76	102.7 ± 7.74

상기의 실험결과를 종합하면, 본 발명의 곤충들에 따른 효소 가수분해물은 각각 멜라노마 세포 내 멜라닌 생성을 효과적으로 억제시킬 수 있었는바, 피부 미백 용도로 활용될 수 있을 것이다.

Claims

흰점박이꽃무지 유충의 효소 가수 분해물을 유효성분으로 포함하고, 상기 효소는 Pepsin(PS), trypsin(TS), Protease NP(PNP) 및 protease(AK)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 피부 미백용 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 멜라노마 세포 내 멜라닌 색소의 생성을 저해하는 것인, 피부 미백용 조성물.
제 1항 또는 제 2항의 조성물을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물.
흰점박이꽃무지 유충을 동결건조시킨 후 분쇄하여 분말을 제조하는 단계;
상기 분말을 증류수에 용해시킨 후 배양하는 단계;
배양된 분말에 Pepsin(PS), trypsin(TS), Protease NP(PNP) 및 protease(AK)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 효소를 처리하여 가수분해하는 단계; 및
상기 효소 가수분해물을 원심분리 후, 상청액을 여과한 뒤, 동결건조하여 최종 시료를 제조하는 단계를 포함하는 피부 미백용 조성물 제조방법.