KR102301678B1

KR102301678B1 - 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물이 유효성분으로 함유된 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법

Info

Publication number: KR102301678B1
Application number: KR1020190150063A
Authority: KR
Inventors: 민진우; 한우리자랑; 김지영; 강희철
Original assignee: (주)지에프씨생명과학
Priority date: 2019-11-21
Filing date: 2019-11-21
Publication date: 2021-09-14
Also published as: KR20210062183A

Abstract

본 발명은 효소처리 및 저온 숙성 말태반(Horse placenta, 학명:Equus caballus) 추출물이 유효성분으로 함유된 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 말태반을 효소처리 및 저온숙성하여 추출물로 제조할 경우, 상기 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물로부터 히스타민 저해능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO (Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해능을 확인함으로써, 이를 유효성분으로 함유하여 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션을 포함하는 베이스 화장료 및 색조 화장료 적용에 유용하다.

Description

효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물이 유효성분으로 함유된 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법{COSMETIC COMPOSITION FOR ABIRRITATION, ANTI-OXIDATION, ANTI-INFLAMMATORY AND ANTI-WRINKLING CONTAINING ENZYME AND LOW TEMPERATURE MATURATION TREATED EXTRACTS OF HORSE PLACENTA AND MANUFACTURING METHOD OF EXTRACT}

본 발명은 효소처리 및 저온 숙성 말태반(Horse placenta, 학명:Equus caballus) 추출물이 유효성분으로 함유된 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 말태반을 효소처리하여 추출물로 제조할 경우, 상기 효소처리된 말태반 추출물로부터 히스타민 저해능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능을 확인함으로써, 이를 유효성분으로 함유하여 베이스 화장료 및 색조 화장료 적용에 유용한 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법에 관한 것이다.

태반은 한의학에서는 자하거라고 부르며, 오래전부터 약리 활성을 가진 소재로 사용하여 왔다. 태반에 관한 국내의 기존 연구를 살펴보면, 면역력 강화, 항산화, 항염증 등의 효과가 있어 각종 만성병 및 통증질환, 미용치료 등 다양한 분야에 쓰이고 있다.

말태반 추출물을 활용한 선행문헌으로서, 대한민국 등록특허공보 제10-0987302호는 맡태반 추출물을 활성성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 섬유아세포의 활성과 콜라겐 합성을 촉진시킴으로 주름을 완화시키고 개선하는 효과를 가진다고 보고 하고 있다.

또한, 대한민국 등록특허공보 제10-1755718호는 말태반 효소가수분해물의 제조방법에 관한 것으로, 말태반에 알칼라아제, 브로멜라인, 플라보자임을 처리하는 것을 특징으로 하여 2,000~2,500da의 분자량을 가지는 말태반 가수분해물을 제공하고 있다

이에, 본 발명자들은 말태반의 성능을 극대화하기 위하여 노력한 결과, 말태반에 효소처리 및 저온숙성을 병행하여 추출물로 제조할 경우, 우수한 자극완화, 항산화, 항염 및 주름 개선 효과를 부여할 수 있다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

대한민국 등록특허공보 제10-0987302호 (2010.10.12 공고) 대한민국 등록특허공보 제10-1755718호 (2017.06.30 공고)

효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

상기에서 효소는 프로테인네이즈(Proteinase), 셀룰라아제(Cellulase), 펙티나아제(Pectinase) 및 헤미셀룰라아제(Hemicellulase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 처리된 것이며, 더욱 바람직하게는 프로테인네이즈 및 펙티나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이다.

가장 바람직하게는 상기 효소가 프로테인네이즈 및 펙티나아제 1:1 내지 3:1 중량비로 이루어진 혼합효소인 것이다.

상기의 제조방법에서, 상기 효소처리는 30 내지 55℃에서 30 내지 120분 동안 수행되는 것이다.

상기에서 저온 숙성은 효소처리 된 말태반을 증숙하고 저온에서 숙성 처리된 것이며, 더욱 바람직하게는 효소처리 된 말태반을 80℃에서 1차 증숙하고 72 내지 128시간 동안 16℃에서 숙성 되는 것이다.

상기 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20중량% 함유된 것이며, 상기 상기 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물로부터 히스타민억제활성, DPPH 자유라디칼 소거능, NO(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해능을 확인할 수 있다.

따라서, 상기 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물이 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션, 색조 화장료 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형에 유효성분으로 함유되어, 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용도에 유용한 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

또한, 본 발명은 말태반에 효소를 첨가하여 효소 반응을 하는 단계, 상기 효소반응 말태반을 증숙 및 저온 숙성하는 단계, 상기 효소처리 및 저온숙성 된 말태반을 추출하는 단계로 수행된 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물을 제조할 경우, 상기 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물로부터 히스타민 억제능 DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명은 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물을 유효성분으로 함유하여 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션을 포함하는 베이스 화장료 및 색조 화장료 적용이 유용하다.

도 1은 본 발명의 실시예1에서 제조된 효소처리 및 저온 숙성 말태반 추출물 및 말태반추출물 비교예1, 효소처리 말태반추출물 비교예2, 효소 배합비율이 변경된 효소처리 말태반 추출물 비교예3, 저온숙성 말태반 추출물 비교예4에 대한 세포독성실험 결과이다.
도 2는 본 발명의 실시예1에서 제조된 효소처리 및 저온 숙성 말태반 추출물 및 말태반추출물 비교예1, 효소처리 말태반추출물 비교예2, 효소 배합비율이 변경된 효소처리 말태반 추출물 비교예3, 저온숙성 말태반 추출물 비교예4에 대한 히스타민 억제 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예1에서 제조된 효소처리 및 저온 숙성 말태반 추출물 및 말태반추출물 비교예1, 효소처리 말태반추출물 비교예2, 효소 배합비율이 변경된 효소처리 말태반 추출물 비교예3, 저온숙성 말태반 추출물 비교예4 에 대한 DPPH 자유라디칼 소거능 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예1에서 제조된 효소처리 및 저온 숙성 말태반 추출물 및 말태반추출물 비교예1, 효소처리 말태반추출물 비교예2, 효소 배합비율이 변경된 효소처리 말태반 추출물 비교예3, 저온숙성 말태반 추출물 비교예4 에 대한 NO 생성 저해능 결과이다.
도 5는 본 발명의 실시예1에서 제조된 효소처리 및 저온 숙성 말태반 추출물 및 말태반추출물 비교예1, 효소처리 말태반추출물 비교예2, 효소 배합비율이 변경된 효소처리 말태반 추출물 비교예3, 저온숙성 말태반 추출물 비교예4 에 대한 엘라스타아제 저해능 결과이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하고자 한다.

본 발명은 효소처리 및 저온 숙성 말태반(Horse placenta, 학명:Equus caballus) 추출물이 유효성분으로 함유된 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물 및 그 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에서는 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물로부터 히스타민 억제능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO(Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제(Elastase) 저해능을 확인한 결과, 우수한 항산화, 항염 및 주름 개선 효과를 확인함으로써, 본 발명은 상기 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물을 유효성분으로 함유하는 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명에서 ‘효소 처리 및 저온숙성’이라 함은 말태반에 효소를 가하여 처리한 후, 증숙처리 및 저온에서 숙성단계를 거친 말태반을 추출한 추출물을 의미한다.

상기 효소는 프로테인네이즈(Proteinase), 셀룰라아제(Cellulase), 펙티나아제(Pectinase) 및 헤미셀룰라아제(Hemicellulase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 처리된 것이며, 더욱 바람직하게는 프로테인네이즈 및 펙티나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이다. 상기 효소일 때, 유효성분의 수득 증대를 통한 그로 인한 효능 증대까지 기대할 수 있어 바람직하다.

가장 바람직하게는 본 발명의 실시예에서는 셀룰라아제 및 펙티나아제 1:1 내지 3:1 중량비로 이루어진 혼합효소를 처리하여 제조된 말태반 추출물을 설명하고 있다.

상기 말태반에 효소를 처리할 경우, 수율 증대를 통한 생산량 증대를 달성하기 위하여, 말태반 100 중량부에 대하여, 효소 2 내지 10 중량부로 처리하는 것이 바람직하다.

이때, 효소처리가 되지 않은 말태반을 저온 숙성한 비교예 1은 히스타민억제효과, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능에서 현저히 낮은 활성을 보이며, 효소처리만을 진행 하고 저온숙성을 하지 않은 비교예 2의 경우에도, 히스타민억제효과 및 NO 생성 저해 효과가 실시예 1에 비하여 현저하게 낮은 활성을 가져 바람직 하지 않다.

상기 조건으로 효소 처리 및 저온 숙성 처리된 말태반 추출물로부터, 히스타민 억제능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능 평가에서, 우수한 결과를 제시하고 있다.

따라서, 본 발명은 상기 효소 처리 및 저온 숙성 처리된 말태반 추출물을 유효성분으로 함유하여 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션을 포함하는 베이스 화장료에 바람직하고, 이외 색조 화장료에도 유용한 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 함량은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄하이드록사이드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 1.0 내지 20 중량%, 더욱 바람직하게는 2.0 내지 10.0 중량%, 가장 바람직하게는 3.0 내지 5.0중량%로 함유되는 것이다.

본 발명은 본 발명은 말태반에 효소를 첨가하여 효소 반응을 하는 제1단계, 상기 효소반응 말태반을 증숙 및 저온 숙성하는 제2단계 및 상기 효소처리 및 저온숙성 된 말태반을 추출하는 제3단계로 수행된 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 제1단계에서의 효소는 프로테인네이즈, 셀룰라아제, 펙티나아제 및 헤미셀룰라아제 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상으로 처리된 것이며, 더욱 바람직하게는 프로테인네이즈 및 펙티나아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것이다. 상기 효소일 때, 유효성분의 수득 증대를 통한 그로 인한 효능 증대 측면에서 바람직하다.

가장 바람직하게는 본 발명의 실시예에서는 프로테인네이즈 및 펙티나아제 1:1 내지 3:1 중량비로 이루어진 혼합효소를 처리하여 제조된 말태반을 설명하고 있다.

상기 제1단계에서 말태반에 효소를 첨가하여 효소 반응시킬 경우, 효소반응을 더욱 원활하게 하기 위해 물을 첨가한 후 교반하여 반응시킬 수 있다. 이때, 효소반응은 30 내지 55℃에서 30 내지 120분 동안 수행될 때, 전환 및 추출 효율 측면에서 바람직하다. 이때, 상기 온도 및 시간 범위를 벗어날 경우, 효소전환이 일어나지 않아 충분한 자극완화, 항산화, 항염 및 주름 개선 효과를 나타낼 수 없어 바람직하지 않다.

본 발명의 제조방법에 있어서, 제2단계는 상기에서 저온 숙성은 효소처리 된 말태반을 증숙하고 저온에서 숙성 처리된 것이며, 더욱 바람직하게는 효소처리 된 말태반을 80℃에서 1차 증숙하고 72 내지 128시간 동안 16℃에서 숙성 되는 것이다. 상기 효소처리 및 저온 숙성이 복합적으로 처리될 때, 히스타민 억제능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능이 우수한 추출물을 제공할 수 있다.

이때, 상기 증숙 온도 및 저온 숙성 시간 범위를 벗어날 경우, 말태반의 유효성분 저분자화 되지 않아 충분한 자극완화, 항산화, 항염 및 주름 개선효과를 나타낼 수 없어 바람직하지 않다.

또한, 제3단계는 효소처리 및 저온숙성된 말태반의 추출물을 수득하는 것으로, 상기 교반추출은 80 내지 105℃에서 120 내지 240분 동안 수행한다. 이때, 상기 온도 및 시간 범위를 벗어날 경우, 유효성분이 충분히 용해되지 않아 충분한 자극완화, 항산화, 항염 및 주름 개선 효과가 미흡하다.

상기 수득된 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물은 추출액, 상기 추출액을 건조시킨 분말, 상기 추출액을 농축여과한 농축물 등의 다양한 형태로 가공되어 이용될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.

본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 효소 처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물 제조

말태반 분말(200mesh) 100g에 프로테인네이즈 3g 및 펙티나아제 1g를 물 300㎖을 첨가하여 50℃에서 120분 동안 반응하였다. 상기 처리가 수행된 효소처리 말태반을 바람직하게는 효소처리 된 말태반을 80℃에서 3시간동안 1차 증숙하고 72시간 동안 16℃에서 숙성하였다. 상기 효소처리 및 저온 숙성이 병행 처리되어진 말태반 추출물은 50% 에탄올 3L를 첨가하여 80℃에서 120분간 교반 추출한 다음 감압농축 및 동결건조하여 효소처리 및 저온 숙성 된 말태반 추출물을 수득하였다.

<비교예 1> 말태반 추출물 제조

효소 처리 및 저온 숙성하지 않고 수행한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되, 구체적으로, 말태반 분말(200mesh) 100g에 50% 에탄올 3L을 첨가하여 80℃에서 120분간 추출한 후 감압농축 및 동결건조하여 말태반 추출물을 수득하였다.

<비교예 2> 효소처리 말태반 추출물 제조

저온 숙성하지 않고 수행한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되, 구체적으로, 말태반 분말(200mesh) 100g에 프로테인네이즈 3g 및 펙티나아제 1g를 물 300㎖을 첨가하여 50℃에서 120분 동안 반응하였다. 상기 처리가 수행된 효소처리 말태반을 50% 에탄올 3L를 첨가하여 80℃에서 120분간 교반 추출한 다음 감압농축 및 동결건조하여 효소처리 말태반 추출물을 수득하였다.

<비교예 3> 효소 배합 조건이 변경 된 효소처리 말태반 추출물

효소 배합을 변경하여 수행한 것을 제외하고는, 상기 비교예 2과 동일한 방법으로 수행하되, 구체적으로, 말태반 분말(200mesh) 100g에 프로테인네이즈 1g를 물 300㎖을 첨가하여 50℃에서 120분 동안 반응하였다. 상기 처리가 수행된 효소처리 말태반을 50% 에탄올 3L를 첨가하여 80℃에서 120분간 교반 추출한 다음 감압농축 및 동결건조하여 효소처리 말태반 추출물을 수득하였다.

<비교예 4> 저온숙성 말태반 추출물 제조

효소처리 하지 않고 수행한 것을 제외하고는, 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하되, 구체적으로, 말태반 분말(200mesh) 100g을 80℃에서 3시간동안 1차 증숙하고 72시간 동안 16℃에서 숙성하였다. 저온 숙성이 처리되어진 말태반 추출물은 50% 에탄올 3L를 첨가하여 80℃에서 120분간 교반 추출한 다음 감압농축 및 동결건조하여 저온 숙성 된 말태반 추출물을 수득하였다.

<실험예 1> 세포독성 시험: WST assay

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 이용하여 세포에 대한 자극성여부를 확인하기 위하여 대식세포(RAW 264.7)를 대상으로 세포독성실험을 수행하였다.

대식세포의 일종인 RAW 264.7cell을 1% 페니실린/스크랩토마이신, 10% FBS(Fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24 웰 플레이트에 1.0×10⁴cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 셀에 상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 각 농도별(0%, 0.5%, 1%, 2%, 4%)로 배지와 혼합한 다음, 각 웰에 1㎖씩 첨가한 후 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후 각 웰의 상등액만을 따로 취한 후 각 웰에 WST-1 에세이 용액(ez-cytox)을 첨가하여 배양기에서 2시간 반응시킨 후 ELISA reader기를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

세포 생존율은 시료를 처리하지 않은 처리군(무처리군)과 비교하여 하기 수학식 1을 이용하여 산출하였다.

[수학식 1]

세포 생존율(%) = (시료 처리군의 흡광도 / 시료 무처리군의 흡광도) × 100

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 세포독성실험 결과를 도시한 것이다.

상기 결과, 대식세포(RAW 264.7)에 대한 세포생존율의 경우, 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물이 모든 농도조건에서도 세포 생존에 대한 독성을 나타내지 않아 화장품에 안전한 소재로 사용 가능함을 확인하였다.

<실험예 2> 자극완화시험 시험: 히스타민 저해 활성

베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 비만세포의 과립을 구성하는 물질로서, 비만세포의 탈 과립에 의한 히스타민 분비는 베타-헥소사미니다제 방출량에 비례한다. 따라서, 더덕 사포닌 분획의 탈과립 및 히스타민 분비억제효과를 랫트의 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 베타-헥소사미니다제의 방출량을 측정함으로써확인하였다. RBL-2H3 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 24 well plate에 각 well당 2×10⁵개의 세포를 분주한 다음, 각 well당 0.5 μg/ml DNP-IgE로 감작시킨 후 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 이후 각well의 세포들을 Siraganian 완충액 (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl2, 25 mM HEPES, 40mM NaOH, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)으로 2번 세척한 다음 37℃에서 10분간 Siraganian 완충액으로 전 반응시키고, 시험물질을 첨가한 후 10분간 다시 반응시켰다. 이후 세포를 37℃에서 30분간 항원(DNP-BSA, 10 μg/ml)을 처리하여 탈 과립상태로 만든 후, 얼음에서 10분간 두어 반응을 종결시키고, 상층액 20 μl를 취해 96well plate에 옮긴 후 1mM p-nitrophenyl-N-acetyl- β-D-glucosaminide를 넣고 1시간 동안 배양시킨 다음stop solution (0.1 M Na2CO3/NaHCO3)을 넣은 다음 ELISA로 흡광도 405 nm에서 측정하여 정량하였다.

도 2는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 히스타민 억제 활성 결과를 도시한 것이다.

그 결과, 비교예 1~4 대비 실시예 1에서 수득한 말태반 추출물에서 히스타민 저해능이 현저하게 우수하였으며 농도의존적으로 향상되어 자극완화 효과가 우수함을 확인하였다.

<실험예 3> 항산화 효능 시험: 자유라디칼 생성 저해 활성

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 이용하여 항산화 효과를 평가하기 위해 DPPH의 자유라디칼 소거능 실험을 수행하였다. 상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 50(㎍/㎖)의 농도로 희석한 다음, 0.1M DPPH 250㎕(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액을 혼합한 후 4℃에서 30분 동안 반응시켰다. 반응이 끝나면 각 샘플을 96 웰 플레이트에 담아 ELISA 기록기를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때, 양성 대조군으로 아스코르브산을 사용하였으며, 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 아래의 수학식 2를 이용하여 자유라디칼 소거량(Free radical scavenging activity, %)을 산출하였다.

[수학식 2]

자유라디칼 소거능(%)=[100-(시료처리군의 흡광도/시료무처리군의 흡광도×100)]

도 3은 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 DPPH 자유라디칼 소거능 결과를 도시한 것이다.

그 결과, 비교예 1~4 대비 상기 실시예 1에서 수득한 말태반 추출물의 경우, DPPH 자유라디칼 소거능이 현저하게 우수하고, 농도의존적으로 향상되어 항산화 효과가 우수함을 확인하였다.

<실험예 4> 항염 효능 시험: NO (Nitric oxide) 생성 저해 활성

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물에 대한 항염증 활성도를 측정하기 위하여, 염증 유도반응에 의해 생성되는 NO의 농도를 측정하는 실험을 수행하였다.

대식세포의 일종인 RAW 264.7 셀을 1% 페니실린/스크랩토마이신 및 10% FBS(Fetal bovineserum)가 포함된 DMEM 배지를 이용하여 24 웰 플레이크에 1.0×10⁴cell/well씩 동일하게 계수하여 분주한 후, 3℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양한 셀에 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 50(㎍/㎖)농도로 배지와 혼합한 후, 각 웰에 1㎖씩 첨가하고 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 24시간 반응시켰다. 이때, NO를 발현시키는 염증유발인자인 LPS(Lipo poly saccharide)를 1㎍/㎖의 농도로 같이 처리하고 37℃, 5%의 이산화탄소 조건에서 24시간 동안 반응시켰다. 이후 각 웰의 상등액만을 따로 취한 후 각 웰에 NO 검출키트를 이용하여 배양액 중 100㎖ 를 96웰 플레이트에 취하고 Griess reagent A(N-1-Naphthylethylenediamine (NEDHC)) 50㎕ 및 Griess reagent B(Sulfanilamide) 50㎕를 각각 넣어준 뒤 10분 동안 반응시킨 후, ELISA plate reader를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다.

도 4는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 NO (Nitric oxide) 생성 저해능 결과를 나타낸 것이다.

그 결과, 비교예 1~4 대비 실시예 1에서 수득한 말태반 추출물에서 NO 생성 저해능이 현저하게 우수하였으며 농도의존적으로 향상되어 항염 효과가 우수함을 확인하였다.

<실험예 5> 주름 개선 시험: 엘라스테이즈 저해 활성

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물에 대한 주름 개선 효과를 측정하기 위하여, 엘라스타아제 억제정도를 평가하였다. 상기 실시예 및 비교예 1~4에서 수득한 말태반 추출물을 50(㎍/㎖)의 농도로 희석한 다음, 10mM Tris-HCl 버퍼(pH8.0)에 녹인 0.6 mM 농도의 기질(N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, S4760, Sigma)과 Elastase from porcine pancreas Type Ⅳ(E0258, Sigma) 0.4U/㎖를 혼합하여 25

에서 5분 동안 반응시킨 후 96웰 플레이트에 담아 410nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하여 하기 수학식 3을 이용하여 산출하였다. 이때, 양성 대조군으로 올레오놀산(Oleanolic acid)를 사용하여 수행하였다.

[수학식 3]

엘라스테아제 저해활성(%) = 100-(시료처리군의 흡광도 / 시료무처리군의 흡광도 × 100)

도 5는 본 발명의 실시예 1에서 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물 및 비교예 1~4에서 제조된 추출물에 대한 엘라스타아제 저해능 결과를 도시한 것이다.

그 결과, 비교예 1~4 대비 실시예 1에서 수득한 말태반 추출물에서 엘라스타아제 저해능이 우수하였으며, 추출물 농도에 비례하여 향상된 결과를 확인하였다.

<실험예 6> 효소처리 및 저온숙성 된 말태반 추출물을 함유한 화장료 제조

1) 스킨 조성물 제조

상기 실시예 1에서 제조된 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물을 함유하고, 하기 표 1에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 스킨 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	78.50
메틸프로판디올, DUB DIOL, 프랑스, Stearinerie Dubois	5.00
1,2-헥산디올, HYDROLITE 6 O, 싱가포르, SYMMRISE	2.00
에탄올, 대한민국, 대정화금	5.00
피이지-40하이드로제네이티드캐스터오일, CREMOPHOR RH40, 독일, BASF	0.50
실시예 1에서 제조된 효소 처리 및 저온숙성 말태반 추출물	4.00
소듐하이아루로네이트(1% 수용액), SODIUM HYALURONATE, 대한민국, BIOLAND	5.00

2) 로션 조성물 제조

실시예 1에서 제조된 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물을 함유하고, 하기 표 2에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 로션 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	66.85
메틸프로판디올, DUB DIOL, 프랑스, Stearinerie Dubois	5.00
소듐하이알루로네이트(1% 수용액), 대한민국, BIOLAND	5.00
1,2-헥산디올, HYDROLITE 6 O, 싱가포르, SYMMRISE	2.00
카보머(2% 수용액), CARBOPOL 980, 미국, LUBRIZOL	8.00
하이드로제네이티드폴리(C6-14올레핀), PURESYN 4, 미국, EXXONMOBILCHEMICAL	7.00
호호바씨오일, JOJOBA OIL, 미국, MCY	2.00
폴리글리세릴-3메틸글루코오스다이스테아레이트, TEGO CARE 450, 독일, EVONIK	3.00
트로메타민, TRIS AMINO ULTRA PC, 미국, DOWCHEMICAL	0.15
실시예 1에서 제조된 효소 처리 및 저온숙성 말태반 추출물	4.00

3) 에센스 조성물 제조

실시예 1에서 제조된 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물을 함유하고, 하기 표 3에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 에센스 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	52.8
메틸프로판디올, DUB DIOL, 프랑스, Stearinerie Dubois	8.00
소듐하이알루로네이트(1% 수용액), 대한민국, BIOLAND	10.00
1,2-헥산디올, HYDROLITE 6 O, 싱가포르, SYMMRISE	2.00
카보머(2% 수용액), CARBOPOL 980, 미국, LUBRIZOL	10.00
C₁₄- C₂₂알코올/C₁₂-C₂₀알킬 글루코사이드, MONTANOV L, 프랑스, SEPPIC	3.00
사이클로펜타실록산, SILICONE KF-995, 일본, SHIN ESTU SILICONE	6.00
호호바씨오일, JOJOBA OIL, 미국, MCY	2.00
트로메타민, TRIS AMINO ULTRA PC, 미국, DOWCHEMICAL	0.20
실시예 1에서 제조된 효소 처리 및 저온숙성 말태반 추출물	4.00

4) 크림 조성물 제조

실시예 1에서 제조된 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물을 함유하고, 하기 표 4에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 크림 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
정제수	48.8
메틸프로판디올, DUB DIOL, 프랑스, Stearinerie Dubois	10.00
소듐하이알루로네이트(1% 수용액), 일본, TSUTO	5.00
1,2-헥산디올, HYDROLITE 6 O, 싱가포르, SYMMRISE	2.00
카보머(2% 수용액), CARBOPOL 980, 미국, LUBRIZOL	10.00
하이드로제네이티드폴리(C6-14올레핀), PURESYN 4, 미국, EXXONMOBILCHEMICAL	10.00
호호바씨오일, JOJOBA OIL, 미국, MCY	2.00
사이클로펜타실록산, SILICONE KF-995, 일본, SHIN ESTU SILICONE	2.00
폴리글리세릴-3메틸글루코오스다이스테아레이트, TEGO CARE 450, 독일,EVONIK	4.00
세테아릴알코올, LANETTE 0, 독일, BASF	2.00
트로메타민, TRIS AMINO ULTRA PC, 미국, DOWCHEMICAL	0.20
실시예 1에서 제조된 효소 처리 및 저온숙성 말태반 추출물	4.00

5) 파운데이션 조성물 제조

실시예 1에서 제조된 제조된 효소처리 및 저온숙성 말태반 추출물을 함유하고, 하기 표 5에 기재된 조성으로부터 통상의 방법에 의하여 파운데이션 조성물을 제조하였다.

성분	함량(중량%)
오조케라이트, OZOKERITE WAX 77W, 미국, ROSS	2.00
소르비탄올리베이트, OLIVEM900, 미국, HALLSTAR	1.50
비스-피이지/피피지-14/14 디메치콘사이클로펜타실록산, Abil Em 97, 독일, EVONIK	3.00
에칠헥실메톡시신나메이트, PARSOL MCX, 네덜란드, DSM	4.00
피이지-10 디메치콘, KF-6017, 일본, SHIN ESTU SILICONE	1.00
페닐트리메치콘, DC 556, 미국, DOW CORNING	2.00
사이클로펜타실록산, SILICONE KF-995, 일본, SHIN ESTU SILICONE	25.00
염료	5.00
정제수	40.5
메틸프로판디올, DUB DIOL, 프랑스, Stearinerie Dubois	8.00
소듐클로라이드	2.00
1,2-헥산디올, HYDROLITE 6 O, 싱가포르, SYMMRISE	2.00
실시예 1에서 제조된 효소 처리 및 저온숙성 말태반 추출물	4.00

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

Claims

(a) 프로테인네이즈와 펙티나아제가 3:1 중량비로 이루어진 혼합 효소처리 및 (b) 80℃ 증숙 단계 및 16℃ 저온 숙성 단계가 병행 처리된 말태반 추출물을 유효성분으로 함유한 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 말태반 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 1.0 내지 20중량% 함유된 것을 특징으로 하는 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 말태반 추출물은 히스타민 저해능, DPPH 자유라디칼 소거능, NO (Nitric oxide) 생성 저해능 및 엘라스타아제 저해능을 가지는 것을 특징으로 하는 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 말태반 추출물은 스킨, 에센스, 로션, 크림, 파운데이션, 색조 화장료 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형에 유효성분으로 함유된 것을 특징으로 하는 자극완화, 항산화, 항염 및 주름개선용 화장료 조성물.