CN116672276A - 一种火绒草酸组合物及紧致抗皱的产品中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种包括火绒草酸A和火绒草酸B的火绒草酸组合物及其用于制备紧致抗皱组合物产品中的应用。本发明还提供了一种高山火绒草细胞提取物的制备方法，所述方法包括，以高山火绒草细胞粉为原料，用1,3丁二醇进行回流提取而成，所述1,3丁二醇的质量浓度为10％‑50％。本发明通过控制提取溶剂和高山火绒草细胞粉与1,3丁二醇的料液比，提高了高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B的含量，提取得到的高山火绒草细胞提取物或火绒草酸组合物能够显著抑制HFF细胞中MMP‑1及OPN3分泌，促进ECMs蛋白：胶原蛋白CollagenⅠ/COLⅠ、层粘连蛋白Laminin 332/LM5、纤连蛋白Fibronectin 1/FN1、肌腱蛋白Tenascin C/TNC的分泌，调控时钟基因BMAL1、CLOCK表达，具有较好的紧致抗皱功效。
Description
技术领域
本发明涉及一种组合物，具体讲涉及一种火绒草酸组合物及其紧致抗皱产品中的应用。
背景技术
火绒草属(Leontopodium R.Brown ex Cass.)隶属于菊科(Asteraceae)旋覆花族(Trib.Inuleae)鼠曲草亚族(Subtrib.Gnaphalinae)，火绒草味微苦，性寒，入肾、膀胱二经，多年生草本植物，生长于高海拔地区，火绒草的地上部分入药，具有清热凉血和利尿等功效。火绒草组分为高山亚组(Subsect.Alpinoidea)，紫毛亚组(Subsect.Chromotricha)，密垫亚组(Subsect.Haastioidea)和火绒草亚组(Subsect.
Pseudantennaria)。有研究表明，火绒草可用于治疗急(慢)性肾炎、蛋白尿、尿道炎、尿路感染等肾脏疾病，以及风热感冒、肺热咳嗽、流行性感冒、矿物药中度、创伤出血等，具有疏风解表、清热解毒、凉血止血、益肾利水之功效。
火绒草含有多种化学成分，目前已分离得到挥发油、黄酮类、苯丙素类、倍半萜类、甾体类等化学成分，并发现其具有抑菌、降血糖、利尿、调血脂、抗氧化、抗炎镇痛、预防老年痴呆等药理活性。
CN115089525A号中国专利公开了一种高山火绒草提取物的制备方法，所述的制备方法公开了目标植株上取下的2mm×2mm健康的植物组织小块，经消毒处理组织切片，用一定比例的的细胞分裂素和生长素诱导植物形成愈伤组织；对愈伤组织施加逆境、定向诱导产生活性物，筛选愈伤组织上的功效片段母细胞；在培养液中进行母细胞的大量培养，复制保存母细胞；在温度、湿度、光照等严格控制并保证无菌的条件下，批量生产植物活性细胞；对上述生产细胞的培养液进行过滤，得到纯的植物细胞；以2:8或其他比例称取相应重量的植物细胞及甘油或太阳花油，将二者混合；此为水溶或油溶带细胞膜的植物原生细胞原料；使用超声的方法对上述溶液中的细胞膜进行破碎，得到水溶或油溶不带细胞膜的原料。
CN115531272A号中国专利公开了一种高山火绒草的提取方法，所述提取方法包括将高山火绒草用粉碎机粉碎成粉末并混合均匀，将得到的粉末置于提取罐中，第一次加入提取溶剂，在40-90℃下以400w的功率超声提取1次，提取1-3h后以4000r/min的速度离心5分钟，分离第一次上清液；第二次加入提取溶剂，并加入混合酶，40-80℃酶解1-3h，之后将温度升至85℃，保温15分钟，分离第二次上清液，合并第一次上清液与第二次上清液，得到提取液，将提取液减压浓缩，过滤得到最终的组合物。
上述现有技术中，既未公开从火绒草中提取火绒草酸A和火绒草酸B，也未公开从火绒草中提取火绒草酸A和火绒草酸B用于紧致抗皱的化妆产品中的应用。
发明内容
本发明旨在提供一种包括火绒草酸A和火绒草酸B的组合物，及其在用于紧致抗皱的化妆品产品中的应用
为实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种火绒草酸组合物，所述的火绒草酸组合物中包括火绒草酸A和火绒草酸B；所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为(1-2.5)：1。
优选的，所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为1：1。
优选的，所述的火绒草酸A与火绒草酸B为以高山火绒草细胞粉为原料，用1,3丁二醇进行回流提取而得的火绒草酸A与火绒草酸B。
优选的，所述的1,3丁二醇的质量浓度为10％-50％。
优选的，所述的1,3丁二醇的质量浓度为30％。
优选的，所述的高山火绒草细胞粉的质量与1,3丁二醇的料液的体积比为1/mL：(40-60)g/mL。
优选的，所述的高山火绒草细胞粉的质量与1,3丁二醇的料液的体积比为1/mL：50g/mL。
优选的，所述火绒草酸A与火绒草酸B的提取方法，该法包括以下步骤：
S1、高山火绒草细胞粉中加入1,3丁二醇，得处理液；
S2、将处理液回流提取，过滤，收集滤液，得高山火绒草细胞提取物。
优选的，所述的S2中回流提取的温度为80-120℃；回流提取的时间为2-3h。
优选的，所述火绒草酸组合物在促进ECMs蛋白分泌及调控时钟基因产品中的应用；
其中，所述ECMs蛋白包括：胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、肌腱蛋白。
所述火绒草酸组合物在制备紧致抗皱的产品中的应用。
基于统一发明构思，本发明提供了一种紧致抗皱的产品，所述产品包括权利要求1所述的火绒草酸组合物。
优选的，所述产品中火绒草酸组合物中包括火绒草酸A和火绒草酸B；所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为(1-2.5)：1。
优选的，所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为1：1。
与现有技术相比，本发明提供的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明公开的火绒草酸组合物，通过控制火绒草酸组合物中的火绒草酸A和火绒草酸B的质量比，使得火绒草酸组合物具有较好的紧致抗皱的功效。
(2)本发明公开的高山火绒草细胞提取物的提取工艺，通过控制提取溶剂和提取方式，提高了火绒草酸A和火绒草酸B成分含量。
(3)本发明提供火绒草酸组合物能够显著抑制HFF细胞中MMP-1及OPN3分泌，促进ECMs蛋白：胶原蛋白Collagen 1/COL1、层粘连蛋白Laminin 332/LM5、纤连蛋白Fibronectin 1/FN1、肌腱蛋白Tenascin C/TNC的分泌，调控时钟基因BMAL1、CLOCK表达，具有较好的紧致抗皱功效。
附图说明
图1为高山火绒草细胞提取物对COL-Ⅰ分泌的影响；图中，##P<0.01，表示模型组与空白组对比差异极显著；与模型组对比，样品组*P<0.05，表示差异显著，**P<0.01，表示差异极显著。
图2为高山火绒草细胞提取物对MMP-1分泌的影响；图中，##P<0.01，表示模型组与空白组对比差异极显著；与模型组对比，**P<0.01，表示差异极显著。
图3为高山火绒草细胞提取物对OPN3分泌的影响；图中，##P<0.01，表示模型组与空白组的对比差异极显著；与模型组对比，**P<0.01，表示差异极显著。
图4为火绒草酸组合物对COL-Ⅰ分泌的影响；图中，##P<0.01，表示模型组与空白组的对比差异极显著；与模型组对比，**P<0.01，表示差异极显著。
图5为火绒草酸组合物对MMP-1分泌的影响；图中，##P<0.01，表示模型组与空白组的对比差异极显著；与模型组对比，**P<0.01，表示差异极显著。
图6为火绒草酸组合物对OPN3分泌的影响；图中，##P<0.01，表示模型组与空白组的对比差异极显著；与模型组对比，**P<0.01，表示差异极显著。
具体实施方式
为了便于了解本发明技术方案中的技术手段、创作特征、获得的目的与功效，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明的，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
本发明实施例所用材料的购买厂家及货号：
高山火绒草细胞粉购自安塞博(重庆)生物技术有限公司；
1,3丁二醇购自麦克林公司，货号为B802789；
COL-ⅠELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，货号为#m1057630；
MMP-1ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司，货号为#m1038199。
一、实施例
实施例1
称取5g高山火绒草细胞粉于三口烧瓶中，以料液比细胞粉：30％1，3-丁二醇＝1(高山火绒草细胞粉)：50g/mL(1，3-丁二醇)，加入30％1，3-丁二醇250mL，100℃下回流2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
实施例2
称取5g高山火绒草细胞粉于三口烧瓶中，以料液比细胞粉：50％1，3-丁二醇＝1(高山火绒草细胞粉)：40g/mL(1，3-丁二醇)，加入50％1，3-丁二醇(去离子水：1，3-丁二醇＝50％：50％)200mL，80℃下回流3h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
实施例3
称取5g高山火绒草细胞粉于三口烧瓶中，以料液比细胞粉：10％1，3-丁二醇＝1(高山火绒草细胞粉)：60g/mL(1，3-丁二醇)，加入10％1，3-丁二醇(去离子水：1，3-丁二醇＝90％：10％)300mL，90℃下回流2h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
二、对比例
对比例1
除提取液为75％的乙醇外，其余皆与实施例1的操作相同。具体如下：
称取5g高山火绒草细胞粉于三口烧瓶中，以料液比细胞粉：75％乙醇＝1(高山火绒草细胞粉)：50g/mL(1，3-丁二醇)，加入75％乙醇(去离子水：乙醇＝25％：75％)250mL，100℃下回流2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
对比例2
除提取溶液为去离子水外，其余操作皆与实施例1相同。具体如下：
称取5g高山火绒草细胞粉于三口烧瓶中，以料液比细胞粉：去离子水＝1(高山火绒草细胞粉)：50g/mL(1，3-丁二醇)，加入去离子水250mL，100℃下回流2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
对比例3
除提取方式为超声提取外，其余操作皆与实施例1相同。具体如下：
称取5g高山火绒草细胞粉于锥形瓶中，以料液比细胞粉：30％1，3-丁二醇＝1(高山火绒草细胞粉)：50g/mL(1，3-丁二醇)，加入30％1，3-丁二醇(去离子水：1，3-丁二醇＝70％：30％)250mL，80℃超声提取2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
对比例4
除提取溶剂为30％乙醇外，其余操作与实施例1皆相同。具体如下：
称取5g高山火绒草细胞粉于锥形瓶中，以料液比细胞粉：30％乙醇＝1(高山火绒草细胞粉)：50g/mL(1，3-丁二醇)，加入30％乙醇(去离子水：乙醇＝70％：30％)250mL，100℃热回流提取2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
对比例5
称取5g高山火绒草细胞粉于锥形瓶中，以料液比细胞粉：去离子水＝1(高山火绒草细胞粉)：50g/mL(1，3-丁二醇)，加入去离子水250mL，80℃超声提取2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
对比例6
除高山火绒草细胞粉与1，3-丁二醇的料液比不同外，其余操作皆与实施例1相同。具体如下：
称取5g高山火绒草细胞粉于三口烧瓶中，以料液比细胞粉：30％1，3-丁二醇＝1(高山火绒草细胞粉)：30g/mL(1，3-丁二醇)，加入30％1，3-丁二醇(去离子水：1，3-丁二醇＝70％：30％)250mL，100℃下回流2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
对比例7
该对比例与实施例1的区别在于，提取高山火绒草所用的酶不同，其中中使用的酶为纤维素酶与果胶酶与蛋白酶的混合酶。所述纤维素酶与果胶酶与蛋白酶的质量比为1:1:1。
称取5g高山火绒草细胞粉于三口烧瓶中，添加纤维素酶1.0％，果胶酶1.0％，蛋白酶1.0％，在温度50℃，使用柠檬酸和NaOH调整pH为4.5，酶解预处理150分钟；酶解后，以料液比细胞粉：30％1，3-丁二醇＝1(高山火绒草细胞粉)：50g/mL(1，3-丁二醇)，加入30％1，3-丁二醇，100℃下回流2.5h，冷却后精滤，收集滤液。得到高山火绒草细胞提取物。
三、检测高山火绒草细胞提取物中的火绒草酸A和火绒草酸B的含量
1、检测方法
利用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用，建立UPLC-MS/MS定量分析高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B。具体条件如下：
色谱系统：waters ACQUITY UPLC I-Class；
质谱系统：waters Xevo TQD；
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7μm(2.1×50mm)；
进样量：0.5uL；
流速：0.3mL/min；
流动相：A：0.1％氨水溶液，B：乙腈。
液相条件如下表1所示：
表1液相条件
质谱条件如下表2。
表2质谱条件
2、标准曲线
火绒草酸A和火绒草酸B的标准曲线如下表3所示：
表3火绒草酸A和火绒草酸B标准曲线
3.检测高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B的含量
高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B含量如下表4所示：
表4.
根据上表4的UPLC-MS/MS技术定量分析的数据可以看出，本发明实施例1-3提供的提取方法得到的高山火绒草细胞提取物中含有火绒草酸A和火绒草酸B含量高于对比例1-5中的火绒草酸A和火绒草酸B含量，尤其是实施例1中高山火绒草细胞提取物中的含有的火绒草酸A达183.31μg/mL，含有的火绒草酸B达161.10μg/mL。
对比例1中提取溶剂为75％乙醇，对比例2中提取溶剂为去离子水，均会在一定程度上影响了高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B的含量。
对比例3中溶液的处理方式为超声提取，也会在一定程度上影响火绒草酸A和火绒草酸B含量。
对比例4中使用的提取溶剂为30％乙醇，对比例5中使用去离子水，采用超声提取的方式使火绒草酸A和火绒草酸B含量降低。
对比例6中调整了高山火绒草细胞粉与1，3-丁二醇的料液比为1:30g/ml，其提取得到的高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B含量较低。
四、检测ELISA法检测高山火绒草细胞提取物或火绒草酸组合物对COL-Ⅰ、MMP-1、OPN3、层粘连蛋白Laminin 332/LM5、纤连蛋白Fibronectin 1/FN1、肌腱蛋白Tenascin C/TNC及时钟基因BMAL1/CLOCK的影响
一)、ELISA法检测高山火绒草细胞提取物对COL-Ⅰ、MMP-1和OPN3分泌的影响
检测方法：
1.蓝光损伤成纤维细胞模型的构建：
(1)配制HFF细胞浓度为1×105cells/mL，24孔板每孔接入1mL细胞液，置于培养箱37℃，5％ CO2环境中培养12h至贴壁后，吸去培养液，用PBS清洗一次。
(2)设置空白组、蓝光组及样品组，空白组和模型组分别加入1mL无血清培养基，样品组每孔分别加入1.0％高山火绒草细胞提取物或火绒草酸组合物(20mM)1mL，置于培养箱37℃，5％ CO2环境中孵育6h后进行蓝光照射。
(3)吸去培养液，用PBS清洗一次，再加适量的PBS覆盖细胞，以18J/cm2的辐射剂量进行蓝光辐射。照射结束后立即吸去孔板中的PBS缓冲液，每孔分别加入无血清培养基1mL，置于培养箱37℃，5％CO2环境中培养18h。
2.ELISA法检测COL-Ⅰ、MMP-1的含量：
ELISA法检测COL-Ⅰ的操作步骤：
1)从室温平衡60min后的铝箔中取出所需板条。
2)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
3)样本孔中加待测样本50μl；空白孔加样本稀释液50μl
4)标准品孔、空白孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。
6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
3.ELISA法检测MMP-1的操作步骤：
1)从室温平衡60min后的铝箔中取出所需板条。
2)设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl。
3)样本孔中加待测样本50μl；空白孔加样本稀释液50μl。
4)标准品孔、空白孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μl，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液(350μL)，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。
6)每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7)每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
4.WesternBlot法检测OPN3的含量：
收集细胞蛋白进行蛋白质变性处理后，蛋白质样品采用10％SDS-PAGE电泳分离，转移到PVDF膜上。用5％ BSA在室温下封闭膜1小时，TBST洗涤三次，与β-actin、OPN3一抗(Abcam,Cambridge,UK)在4℃孵育过夜。再次洗涤三次后，用二抗在室温下孵育1小时。最后使用ECL试剂显色，用凝胶显色仪曝光拍照，并通过Image J定量分析蛋白条带。
5.检测结果：
1).COL-Ⅰ检测结果
实施例1-3和对比例1-6中提取的高山火绒草细胞提取物对COL-Ⅰ分泌的影响如图3所示。
从图1中可以看出，与空白组相比，蓝光模型组COL-Ⅰ含量显著降低(P＜0.01)，此次实验模型建立有效。
与模型组相比，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物，促进HFF细胞中COL-Ⅰ分泌显著(实施例1-3，P＜0.01)，其中，实施例1促进作用最显著。对比例1、对比例3和对比例6中的高山火绒草细胞提取物虽然能在一定的程度上促进HFF细胞中COL-Ⅰ分泌，但其作用效果低于实施例1-3的作用效果，对比例2和对比例4-5中的高山火绒草细胞提取物促进COL-Ⅰ分泌的效果不显著(P＞0.05)。
2)、MMP-1检测结果
实施例1-3和对比例1-6中提取的高山火绒草细胞提取物对MMP-1分泌的影响如图2所示。
从图2中可以看出，与空白组对比，蓝光模型组MMP-1含量显著升高(P＜0.01)，此次实验模型建立有效。
与模型组对比，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物抑制HFF细胞中MMP-1的分泌显著(实施例1-3，P＜0.01)，实施例1的抑制作用最显著。对比例1中提取溶剂为75％乙醇，对比例2中提取溶剂为去离子水，对比例4中提取溶剂为30％乙醇，均会在一定程度上影响高山火绒草细胞提取物对MMP-1分泌的抑制作用。对比例3中溶液的处理方式为超声提取，也会在一定程度上影响HFF细胞中MMP-1的分泌。对比例5中使用去离子水，采用超声提取的方式，对比例6中高山火绒草细胞粉与1，3-丁二醇的料液比为1:30g/ml，均使抑制HFF细胞中MMP-1的分泌效果减弱。
3)、OPN3检测结果
实施例1-3和对比例1-6中提取的高山火绒草细胞提取物对OPN3分泌的影响如图3所示。
从图3中可以看出，与空白组对比，蓝光模型组OPN3含量显著降低(P＜0.01)，此次实验模型建立有效。
与模型组对比，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物抑制HFF细胞中OPN3的分泌显著(实施例1-3，P＜0.01)，实施例1的抑制作用最显著。
对比例1中提取溶剂为75％乙醇，对比例2中提取溶剂为去离子水，对比例4中提取溶剂为30％乙醇，均会在一定程度上影响高山火绒草细胞提取物对OPN3分泌的抑制作用。
对比例3中溶液的处理方式为超声提取，也会在一定程度上影响HFF细胞中OPN3的分泌。对比例5中使用去离子水，采用超声提取的方式，对比例6中高山火绒草细胞粉与1，3-丁二醇的料液比为1:30g/ml，均使抑制HFF细胞中OPN3的分泌效果减弱。
以上结果表明，实施例1-3高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B含量高于对比例1-6，尤其是实施例1高山火绒草细胞提取物中火绒草酸A和火绒草酸B含量最高，且实施例1-3高山火绒草细胞提取物能够显著促进HFF细胞中COL-Ⅰ分泌，抑制MMP-1及OPN3分泌，具有紧致抗皱功效。
二)、ELISA法检测高山火绒草细胞提取物对COL-Ⅰ、层粘连蛋白Laminin 332/LM5、纤连蛋白Fibronectin 1/FN1、肌腱蛋白Tenascin C/TNC分泌的影响
检测方法：
1.丙酮醛MGO损伤成纤维细胞衰老模型的构建：
成纤维细胞培养至对数生长期，用含15％胎牛血清的DMEM培养基(含青霉素钠200kU/L，链霉素100mg/L，pH 7.4)重悬细胞，调细胞浓度为每毫升3×105个。24孔板中各加入500μL细胞液，37℃CO2培养箱贴壁培养1天，分别加入4mmol/L的丙酮醛MGO和1％的待测样品(实施例1-3)溶液各1mL，空白组加入2mL无血清培养基，48h后收集细胞培养上清。然后根据ELISA试剂盒说明书测定胶原蛋白Collagen 1/COL1、层粘连蛋白Laminin 332/LM5、纤连蛋白Fibronectin 1/FN1、肌腱蛋白Tenascin C/TNC的表达量。
2.检测结果：
1)、COL-Ⅰ检测结果
实施例1-3中提取的高山火绒草细胞提取物对COL-Ⅰ分泌的影响如表6所示。
表6
从结果可知，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物，均能显著恢复MGO损伤成纤维细胞合成COL-Ⅰ的能力(P＜0.01)。
2)、FN1/纤连蛋白I含量检测结果
实施例1-3中提取的高山火绒草细胞提取物对FN1分泌的影响如表7所示。
表7
从结果可知，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物，均能显著恢复MGO损伤成纤维细胞合成FN1的能力(P＜0.01)。
3)、LM5/层粘连蛋白5含量检测结果
实施例1-3中提取的高山火绒草细胞提取物对LM5分泌的影响如表8所示。
表8
从结果可知，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物，均能显著恢复MGO损伤成纤维细胞合成LM5的能力(P＜0.01)。
4)、TNC/肌腱蛋白C含量检测结果
实施例1-3中提取的高山火绒草细胞提取物对TNC分泌的影响如表9所示。
表9
从结果可知，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物，均能显著恢复MGO损伤成纤维细胞合成TNC的能力(P＜0.01)。
ECMs蛋白支撑结构的破坏和塌陷，会导致皮肤的衰老。实验结果表明，实施例1-3所得火绒草酸组合物能够提升成纤维细胞合成COL-Ⅰ、FN1、LM5、TNC等ECMs蛋白的能力，具有抗皱紧致功效。
三)、ELISA法检测高山火绒草细胞提取物对时钟基因表达的影响
检测方法：采用蓝光诱导成纤维细胞光老化模型，根据一中所示步骤处理细胞，收集细胞后通过RT-PCR常规方法检测时钟基因BMAL1、CLOCK的RNA表达情况。
检测结果：
1、BMAL1检测结果
实施例1-3中提取的高山火绒草细胞提取物对BMAL1基因表达的影响如表10所示。
表10
从结果可知，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物，均能调控蓝光引起的时钟基因BMAL1的表达。
2、CLOCK检测结果
实施例1-3中提取的高山火绒草细胞提取物对CLOCK基因表达的影响如表10所示。
表10
从结果可知，实施例1-3的1.0％高山火绒草细胞提取物，均能调控蓝光引起的时钟基因CLOCK的表达。
实验结果表明，实施例1-3所得火绒草酸组合物能够调控蓝光引起的时钟基因BMAL1、CLOCK的表达紊乱，促进皮肤屏障修复。
四)、ELISA法检测火绒草酸组合物对COL-Ⅰ、MMP-1分泌和OPN3的影响检测方法与“四、一)、ELISA法检测高山火绒草细胞提取物对COL-Ⅰ、MMP-1和OPN3分泌的影响”中的检测方法相同。
其中，火绒草酸组合物中火绒草酸A与火绒草酸B的质量比如下表5所示：
表5火绒草酸组合物比例
| 样品编号 | 火绒草酸A | 火绒草酸B |
| 组1 | 1 | 1 |
| 组2 | 2 | 1 |
| 组3 | 1.5 | 1 |
| 组4 | 0.5 | 1 |
检测结果：
检测火绒草酸组合物1-4对COL-Ⅰ及MMP-1分泌的影响，结果如图4-6所示。
从图4中可以看出，与模型组相比，组1-3比例的火绒草酸组合物，显著促进HFF细胞中COL-Ⅰ分泌(P＜0.01)，其中，组1比例下促进作用最显著，组4中火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为0.5:1，其促进HFF细胞中COL-Ⅰ分泌的作用不具有显著性。
从图5中可以看出，与模型组相比，组1-3比例的火绒草酸组合物，显著抑制HFF细胞中的MMP-1分泌(P＜0.01)，其中，组1比例下抑制作用最显著，组4中的火绒草酸组合物其抑制HFF细胞中的MMP-1分泌的作用不具有显著性。
从图6中可以看出，与模型组相比，组1-3比例的火绒草酸组合物，显著抑制HFF细胞中的OPN3分泌(P＜0.01)，其中，组1比例下抑制作用最显著，组4中的火绒草酸组合物其抑制HFF细胞中的OPN3分泌的作用不具有显著性。
综上，火绒草酸组合物在上述的组1-3中的比例，具有较为显著的紧致抗皱功效。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (14)
1.一种火绒草酸组合物，其特征在于，所述的火绒草酸组合物中包括火绒草酸A和火绒草酸B；所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为(1-2.5)：1。
2.根据权利要求1所述的火绒草酸组合物，其特征在于，所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为1：1。
3.根据权利要求1所述的火绒草酸组合物，其特征在于，所述的火绒草酸A与火绒草酸B为以高山火绒草细胞粉为原料，用1,3丁二醇进行回流提取而得的火绒草酸A与火绒草酸B。
4.根据权利要求3所述的火绒草酸组合物，其特征在于，所述的1,3丁二醇的质量浓度为10％-50％。
5.根据权利要求4所述的火绒草酸组合物，其特征在于，所述的1,3丁二醇的质量浓度为30％。
6.根据权利要求3所述的火绒草酸组合物，其特征在于，所述的高山火绒草细胞粉的质量与1,3丁二醇的料液的体积比为1/mL：(40-60)g/mL。
7.根据权利要求6所述的火绒草酸组合物，其特征在于，所述的高山火绒草细胞粉的质量与1,3丁二醇的料液的体积比为1/mL：50g/mL。
8.根据权利要求3-7任一项所述火绒草酸组合物，其特征在于，所述火绒草酸A与火绒草酸B的提取方法，该法包括以下步骤：
S1、高山火绒草细胞粉中加入1,3丁二醇，得处理液；
S2、将处理液回流提取，过滤，收集滤液，得高山火绒草细胞提取物。
9.根据权利要求8所述的所述火绒草酸组合物，其特征在于，所述的S2中回流提取的温度为80-120℃；回流提取的时间为2-3h。
10.如权利要求1所述火绒草酸组合物，其特征在于，所述火绒草酸组合物在促进ECMs蛋白分泌及调控时钟基因产品中的应用；
其中，所述ECMs蛋白包括：：胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、肌腱蛋白。
11.根据权利要求1所述的火绒草酸组合物在制备紧致抗皱的产品中的应用。
12.一种紧致抗皱的产品，其特征在于，所述产品包括权利要求1所述的火绒草酸组合物。
13.根据权利要求12所述的产品，其特征在于，所述产品中火绒草酸组合物中包括火绒草酸A和火绒草酸B；所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为(1-2.5)：1。
14.根据权利要求13所述的产品，其特征在于，所述的火绒草酸A与火绒草酸B的质量比为1：1。
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| CN102238935A (zh) * | 2008-12-05 | 2011-11-09 | 株式会社爱茉莉太平洋 | 将火绒草酸作为有效成分含有的改善皱纹用皮肤化妆料组合物 |
| CN106924316A (zh) * | 2015-12-30 | 2017-07-07 | 生物Fd&C株式会社 | 含高山火绒草植物细胞培养提取物的皮肤外用剂组合物及其制造方法 |
| CN107106478A (zh) * | 2015-01-13 | 2017-08-29 | 赛德玛公司 | 高山火绒草的植物细胞用于美容处理的用途和相应的活性成分 |
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