CN107106478A - 高山火绒草的植物细胞用于美容处理的用途和相应的活性成分 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了通过体外细胞培养获得的高山火绒草(Leontopodium alpinium)的去分化或未分化植物细胞用于恢复衰老皮肤的细胞的稳态以及提高细胞的代谢和能量活性的非治疗性美容处理的用途。使用这种处理，在已经衰老的皮肤上获得了紧实和光滑的恢复效果，在松垂的颈部皮肤和泪沟上是特别显著的。

Description

高山火绒草的植物细胞用于美容处理的用途和相应的活性 成分
技术领域
本发明涉及白雪火绒草高山亚种(Leontopodium nivale subsp.alpinum Cass)植物，下文中称为高山火绒草(Leontopodium alpinum)用于美容处理(局部或口服途径给药)的用途。
本发明因此涉及化妆品和卫生和个人护理产品工业，用于哺乳动物、动物或人的皮肤及其附属物(如头发、睫毛、眉毛、指甲、体毛)。
背景技术
高山火绒草，也称为雪绒花(Edelweiss)，是菊科(Asteraceae)的草本植物。其生长于比利牛斯山、阿尔卑斯山和喜马拉雅山高于1500m海拔处，生长于相当恶劣的地方，如沟堑、岩石、寒冷，并且高度暴露于UV区域。因此，这种植物能非常好地适应极端条件，因为其含有多种令人感兴趣的分子并且在其花和叶上具有保护性的绒毛。然而，这种植物仍然相对没有很好地分布并且因此相当稀少。
可以通过常规的提取方法，直接从整株植物或其部分或者通过体外培养方法，通过从源自该植物的不同器官的细胞或组织系的细胞培养物或组织培养物获得来自该植物的产品。
更特别地，本发明涉及作为体外细胞或组织培养的结果获得的产品。
通过植物来源的提取物的体外培养获得的制备物具有优于农用工业方式(种植在户外并且随后在设施中提取的植物)的许多优势。由于培养条件的全面控制，通过体外培养获得的提取物不含有毒物质(除草剂、杀虫剂、肥料、重金属和其他污染物，如源自植物寄生物的那些)。此外，体外培养条件的严格控制降低了种系的自发变异的风险并且保证了对应于所需目标分子的次级代谢产物的可重复特征，这与在户外的培养相反，在户外存在与气候、天气和地理条件及其危害相关的变异性问题。再进一步地，这种技术克服了屏障，如植物的天然生物循环和次级代谢产物产生的季节性，允许更好的供应安全性和快速性。此外，环境影响是最小的，因为基本上限制了水消耗、避免了耕地的消耗并且防止了土壤的污染。此外，维持了生物多样性，因为一株植物乃至一粒种子就足以开始新的体外培养。最后，这种技术提供了指引细胞代谢朝向目标分子产生(培养物的引发)和实现受控且相对快速的实验方案以提高某些分子(包括在植物中通常少量产生的那些)的产量的可能性。
迄今为止在体外植物细胞培养领域中已有的技术中，根据本发明可以使用以下的：
-未分化或去分化细胞的培养：这种类型的方法涉及首先在琼脂培养基中形成高度增殖的细胞系，所述细胞系来自分生组织细胞(未分化的细胞)，或来自去分化的细胞(在除去植物的片段、叶、茎、根或其他后作为愈伤组织生长)。然后将这些细胞系在液体培养基中培养，以便实质性地增加生物质。在生长周期结束时并且在限定且优化的环境条件中(找到正确的引发培养基)，细胞生物质将合成目标分子。然后在最佳时间停止培养并进行提取，以获得最大量的目标分子。最初也可以使用已经在商业上可获得的已有细胞系。
-组织或器官的培养：这种类型的培养可以涉及根部分(“根培养”)、气生部分(“茎段培养”)或体细胞胚(“体细胞胚”)培养。在这种类型的方法中，在已经经历了通过发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogens)细菌(根)或通过根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)(茎)基因组转化的培养物之间加以区别。由此转化的根或气生部分的培养物具有高生长率并且在遗传上是非常稳定的。在引发参数优化后，将它们用于合成目标分子。然后将这些培养物通过常规方式进行提取。
优选，本发明更特别地涉及源自未分化或去分化细胞的体外培养(下文中称为植物细胞培养)的产物。
示意地，体外细胞培养方法由以下组成：
-在合适的情况下，最初从植物部分(叶、根、茎、芽等)的切块上获得的愈伤组织(未分化或去分化细胞的簇)建立细胞系；
-根据预先建立的标准(恒定的表型以及选定代谢产物的最佳和恒定产生，增殖的能力)，选择能够大规模产生细胞生物质的细胞系；
-然后从这个选定的系，产生所述细胞生物质，可能具有引发阶段，优选在增殖阶段结束时；和
-第三，处理获得的细胞生物质，以回收完整细胞，通过高压均质破坏细胞聚集物或裂解这些细胞并且随后可能提取所述细胞的内含物。
随后可以将这些提取物和/或完整或破坏的细胞作为活性成分与药物学上可接受的赋形剂和任选与其他另外的活性成分一起用于化妆品组合物中。
EP2319914专利申请描述了这种用于在培养物中获得未分化细胞的体外技术，对于包括高山火绒草的33种植物物种的理论列表，具有高产量的咖啡酸衍生物。这种有关的咖啡酸衍生物包括苯丙素苷以及咖啡酰奎宁酸。对于高山火绒草，呈现了透明质酸酶的抑制活性。通过透明质酸酶保护透明质酸消化预防性地有助于保持真皮的完整性。
发明概述
本发明的目的在于提供通过体外细胞培养方法获得的高山火绒草细胞用于美容处理的新用途。
为此，本发明提供了通过体外细胞培养方法获得的高山火绒草的未分化或去分化植物细胞用于非治疗性美容处理的用途，用于恢复衰老皮肤的细胞的稳态和提高细胞的代谢和能量活性。
衰老真皮的细胞的稳态导致：
1)MMP(真皮基质的“基质金属蛋白酶”)和TIMP(真皮基质的“金属蛋白酶的组织抑制剂”)之间的再平衡，有利于TIMP。
存在大量MMP(超过20种)，以潜伏形式(MMP原)产生，以避免失控上升。它们的产生随着年龄增加，但急性或慢性应激扩大了这种现象。它们的过度产生导致真皮强度的降低、失去其密度并变薄。因此，MMP导致更快和更差的皮肤衰老。尽管年轻皮肤中的真皮纤维是长的、完整和致密的，但在衰老皮肤中的那些相反是片段化的且不太致密。这较低质量的纤维降低了真皮的动态张力，MEC和成纤维细胞之间的相互作用有时候也降低高达80％。
MMP在组织中受到TIMP抑制剂的天然控制，TIMP抑制剂避免了盲目的活性。TIMP相对于MMP的平衡定了MMP的活性水平。TIMP是小的糖蛋白，其的产生与MMP相关的慢性疾病的减少和由于UV引起的光损伤的减少有关。通过将其自身与MMP结合，TIMP中和了它们并因此限制了真皮基质的片段化，真皮基质因此保持其弹性。此外，认为TIMP-1对于成纤维细胞和角化细胞是有利的存活因子。
在UV照射的影响下，以及在成纤维细胞的衰老过程中，观察到TIMP-1产生的降低。这导致了MMP活性的提高。
2)凝血酶敏感蛋白(TSP)的刺激，凝血酶敏感蛋白是由表皮和真皮产生的基质糖蛋白，并且对其的科学兴趣正在提高。TSP-1，一旦在小鼠表皮中实验性地超表达，可以有效地降低UVB照射的有害作用。令人感兴趣地，已经注意到真皮下的胶原蛋白和弹性蛋白纤维组织化的显著提高，以及皮肤上形成皱纹的减少。这可能与促血管生成和蛋白酶因子的控制有关。其相对物，TSP-2，也具有显著的有效抗衰作用。实际上，不能产生这种蛋白的小鼠显示出真皮胶原蛋白纤维不太有序的组织化并且其皮肤更易于拉伸。它们的成纤维细胞也提供了人造真皮，也是不太致密且松弛的，并且不能正常地收缩。
TSP-1和TSP-2似乎作用于衰老的几个关键点，特别是通过抑制MMP活性，包括MMP-9的活性。此外，也已知TSP-1产生的提高能恢复由UVB照射降低的前胶原蛋白的合成。这种恢复需要公知的TGF-β的激活，以刺激胶原蛋白的合成。相反，不能产生TSP-2的成纤维细胞过量产生MMP-9。因此，显然TSP的表达，包括由角化细胞表达的，对于真皮和皮肤的质量体现出有利的益处，并且与TIMP一起，限制其衰老。
真皮成纤维细胞的代谢活性的提高导致收缩能力的改善和真皮大分子产生的增加。关于成纤维细胞的能量活性，依赖于空气中的氧，根据组织的能量需求，生物体的每个细胞从称为线粒体的产生单位或多或少地产生其自身的能量。随着年龄，线粒体与以前相比变得不太有效并且转化较少的氧。与其他细胞类型相反，成纤维细胞具有1至10μm的细丝样线粒体，其他细胞类型的线粒体具有强的倍增力(multiplicative power)，在某种程度上是卵圆形的。然而两种形式，分离的卵圆形形式(分裂体)或丝状网络形式(融合体)，共同存在于每种细胞类型中。从一个状态到另一个状态的动态通道的保持对于线粒体功能的维持是关键性的。如果分裂体对于在子细胞中分裂线粒体集合的细胞分裂是必需的，则融合体允许拉取维持细胞呼吸需要的基因和分子。
观察到衰老细胞富含融合形式，其在此再次允许其存活的延长。
根据本发明，在高压下混合后，可以使用高山火绒草的未分化或去分化细胞，高压是为了匀化培养基并且破坏细胞聚集物。
根据本发明，可以完整或裂解的，或以从这些细胞产生的细胞提取物的形式，来使用未分化或去分化的高山火绒草细胞。
根据本发明，可以通过任何生理上可接受的溶剂或这些溶剂的任意混合物来提取高山火绒草的未分化或去分化细胞。可以通过能够组合的各种已知方法来进行提取：热提取、浸泡、煎煮、泡制、加压浸出、超声波、微波、通过任何合适的化学或物理方法裂解细胞。可以通过过滤或离心进行相分离。或者，可以用超临界或亚临界流体提取生物质。
根据本发明，也可以通过所有工业上可利用的方法、通过液相-液相分配或色谱，例如，使用吸附树脂，以便浓缩目标分子，如两种火绒草酸(leontopodic acid)A和/或B，来考虑细胞提取物的更高纯化。
根据本发明，高山火绒草的未分化或去分化细胞也可以以干燥形式，优选通过雾化或优选通过冷冻干燥来使用。这允许它们长期储存并维持它们的生物活性。
在以下描述中，“植物细胞”包括高山火绒草的未分化或去分化细胞，通过体外细胞培养过程制备，不管是完整的还是裂解的，不管是否已经经历高压均质，不管是新鲜的还是干燥的形式，以及源自这些细胞的提取物。
根据本发明，植物细胞可以掺入(悬浮或溶解于)生理学上可接受的介质中并且用于制备打算用于恢复衰老皮肤的稳态和提高细胞的代谢和能量活性的化妆品组合物。
优选，根据本发明，生理学上可接受的介质是亲水性基质。更优选，本发明的美容处理是局部的。
令人惊讶地，申请人已经通过体内测试表明了由施用包括通过体外细胞培养方法获得的高山火绒草的未分化或去分化细胞的组合物组成的衰老皮肤的美容处理在这些皮肤上诱导了治愈或修复作用、紧实和/或光滑作用，特别是在松垂的颈部区域和泪沟的褶皱。
以下在描述中更详细地呈现这些测试的结果。
最后，本发明提供了以上限定的植物细胞用于制造非治疗性化妆品活性成分的用途，以及包含悬浮和/或溶解于生理学上可接受介质(其可以是亲水性基质)中的所述活性成分的组合物用于恢复衰老皮肤的稳态和提高细胞的代谢和能量活性的用途。
根据本发明，使用富含火绒草酸A和/或B(优选A和B)的植物细胞。蛋白质、氨基酸、植物甾醇、脂质和多肽也已经被鉴别为根据本发明使用的植物细胞中的化合物类别。
最后，根据其他特征，本发明提供了用于根据本发明的用途的化妆品活性成分，在生理学上可接受的基质中包括通过体外细胞培养方法获得的高山火绒草的未分化或去分化植物细胞并包括至少0.04％的火绒草酸A和B。优选，在这种成分中以及如以上解释的，所述植物细胞是完整的和/或裂解的细胞或作为所述完整和/或裂解的细胞的细胞提取物存在。
为了获得根据本发明可以使用的去分化或未分化植物细胞，可以实施以下方法：
1)从选定的高山火绒草系，通过连续预培养和增加大小，产生关键的前-生物质；
2)在生物反应器中从所述前-生物质和合适的培养基产生所述去分化或未分化细胞的生物质；和
3)从所述培养基分离富含火绒草酸的所述生物质，并且因此回收所述去分化或未分化细胞。
根据任选的特征：
1)在生物反应器中的生产步骤包括引发步骤，有利地提高火绒草酸A和/或B的含量或改变相对比例；和/或
2)在7至21天的培养时间后，通过过滤从反应器收集生物质；优选10至14天，允许有利地产生最大量的生物质，具有高生存力；和/或
3)该生物质可以接受高压均质的步骤，以便破坏细胞聚集物；和/或
4)可以增加干燥细胞生物质的附加步骤，用于更好的长期保存；和/或
5)可以提取该细胞，特别是用于富集火绒草酸A和B。
通常，目标化合物的引发可以通过将微生物级分(包括酿酒酵母)加入培养物中，将生物分子(如，例如壳聚糖、茉莉酸甲酯、茉莉酸、水杨酸)加入培养物中，将非生物分子(如，多效唑)加入培养物中，给培养物施加温度、pH或通过不可代谢的糖(如甘露糖醇)诱导的渗透应力的变化，借助于介质中大量元素和糖的甚至更剧烈的贫瘠，将吸附树脂加入培养物中(吸附树脂除了引发目标化合物的产生，还可以捕获它们)来进行。优选，根据本发明，通过改变培养基，特别是营养素水平来实现引发。
用于实施本发明的组合物的制备
化妆品组合物，尤其是局部的，包括生理学上可接受介质中的植物细胞。根据植物细胞中的赋形剂和剂量，所述组合物将是浓缩的活性成分或打算直接用于最终使用者的不太浓缩的最终组合物。
根据本发明，“生理学上可接受介质”表示，不限于，水性或水-醇性溶液、油包水型乳液、水包油型乳液、微乳液、含水凝胶、无水凝胶、精华、囊泡的分散体或粉末。
“生理学上可接受的”表示组合物适用于局部或经皮使用，与哺乳动物(特别是人)的粘膜、附属物(指甲、头发)、头皮和皮肤接触，组合物可以摄入或注入皮肤中，没有毒性、不相容性、不稳定性、过敏反应等的风险。
“生理学上可接受介质”形成通常所称的组合物的赋形剂。
本发明的植物细胞可以与有效浓度的其他活性成分组合，所述其他活性成分可以协同或叠加地起作用，用于增强或实现针对本发明描述的所需效果，所述其他活性成分诸如以下试剂：UVA和/或UVB过滤剂、水合、保湿、湿润、镇静、皮肤放松、消瘦、重建、紧实、丰盈、提升、光滑、作用于血液微循环、炎症、自由基、抗衰老、抗细纹和皱纹、提亮、作用于肤色、抗糖化、抗羰基化、助着色(pro-pigmenting)、作用于角质层、作用于真皮-表皮连接、作用于HSP蛋白产生、皮肤的紧实度、作用于弹性和肤色、作用于头发生长或抗再生长(包括睫毛和眉毛)、作用于眼睛轮廓(黑眼圈和下眼袋)、肽、维生素等。
根据本发明可以将植物细胞施用于脸、身体、颈纹、头皮、头发、睫毛、体毛，以本领域技术人员已知的任何形式或在载体中，特别是以溶液、分散液、乳液、糊状物或粉末的形式，单独地或作为预混物或单独地在载体中或作为载体中的预混物，如大-、微-或纳米-胶囊，大-、微-或纳米-球体，微-或纳米-乳液或吸附于有机聚合物粉、滑石、膨润土、孢子或花粉粒外壁以及其他无机或有机支持物上。
特别地在化妆品中，特别可以在用于脸、身体、头发和体毛的皮肤护理范围，以及在化妆范围，包括睫毛和眉毛，给予施用。
通常，根据本发明的植物细胞可以以任何形式来使用，以结合或掺入大-、微-和纳米颗粒，或大-、微-和纳米胶囊中，或吸附于大-、微-和纳米颗粒，或大-、微-和纳米胶囊之中或之上的形式，用于处理可以用于打算与皮肤接触的白天或晚上的衣服或内衣的织物、天然或合成纤维、羊毛和任何材料，手帕或衣服，以通过这种皮肤/织物接触来发挥其化妆品作用和允许持续的局部递送。
CTFA(由《个人护理用品协会》出版的(《国际化妆品成分词典&手册》)(2014年第15版)，来自《the Cosmetic,Toiletry,and Fragrance Association，Inc.》，Washington,D.C.)，描述了皮肤护理工业中常用的非限制性的各种化妆品和药物成分，其适宜用作根据本发明的组合物中的额外的成分。
更多特别有用的额外的护肤活性物质可以在Sederma的商业文献中和在网站www.sederma.com中找到。
作为实例，还可以提及以下商业活性物质：甜菜碱、甘油、Actimoist Bio 2TM(Active organics)、AquaCacteenTM(Mibelle AG Cosmetics)、AquaphylineTM(Silab)、AquaregulKTM(Solabia)、CarcilineTM(Greentech)、CodiavelaneTM(Biotech Marine)、DermafluxTM(Arch Chemicals，Inc)、Hydra'FlowTM(Sochibo)、Hydromoist LTM(Symrise)、RenovHyalTM(Soliance)、SeamossTM(Biotech Marine)、ArgirelineTM(Lipotec的酰基六肽-3的商业名称)、千日菊醇(spilanthol)或依据商业名称Gatuline ExpressionTM已知的Acmella oleracea的提取物、依据商业名称BoswellinTM已知的齿叶乳香(Boswelliaserrata)的提取物、Deepaline PVBTM(Seppic)、Syn-AKETM(Pentapharm)、AmelioxTM、BioxiliftTM(Silab)、PhytoCellTecTMArgan(Mibelle)、Papilactyl DTM(Silab)、PreventheliaTM(Lipotec)、SubliskinTM(Sederma)、VenuceaneTM(Sederma)、Moist24TM(Sederma)、Vegesome Moist 24TM(Sederma)、EssenskinTM(Sederma)、JuvinityTM(Sederma)、RevidratTM(Sederma)、ResistemTM(Sederma)、ChronodynTM(Sederma)、KombuchkaTM(Sederma)、ChromocareTM(Sederma)、CalmosensineTM(Sederma)、Glycokinfactor STM(Sederma)、BiobustylTM(Sederma)、IdealiftTM(Sederma)、Ceramide 2TM、Ceramide A2TM et Ceramide HO3TM(Sederma)、LeganceTM(Sederma)、IntenslimTM(Sederma)、ProdiziaTM(Sederma)、BeautifeyeTM(Sederma)、NG-乳木果未皂化物(天然级)(Sederma)、ZingerslimTM(Sederma)、MeiritageTM(Sederma)、SenestemTM(Sederma)、SebulessTM(Sederma)、MajestemTM(Sederma)、ApiscalpTM(Sederma)、RubistemTM(Sederma)或其混合物。
在可以与本发明的肽结合的其他植物提取物中，更特别地要提及以下植物的提取物：常春藤，特别是英格兰常春藤(Hedera Helix)、中国柴胡(Bupleurum chinensis)、三岛柴胡(Bupleurum Falcatum)、山金车(Arnica Montana L)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis N)、金盏花(Calendula officinalis)、鼠尾草(Salvia officinalis L)、人参(Panax ginseng)、银杏、圣约翰草(Hyperycum Perforatum)、假叶树(Ruscus aculeatusL)、欧洲绣线菊(Filipendula ulmaria L)、大花贾尔瓦茶(Orthosiphon StamincusBenth)、水藻(Fucus Vesiculosus)、桦树(Betula alba)、绿茶、可乐果(Cola Nipida)、马栗、竹、积雪草(Centella asiatica)、石楠、黑角菜、柳树、鼠耳草、七叶树皂角素(escine)、苍术、金黄洋甘菊(chrysanthellum indicum)、Armeniacea属的植物、AtractylodisPlaticodon、Sinnomenum、牵牛子(Pharbitidis)、千斤拔(Flemingia)、彩叶草属(Coleus)(如C.Forskohlii、C.blumei、C.esquirolii、C.scutellaroides、C.xanthantus和C.Barbatus，如Coleus barbatus的根的提取物)，Ballote、Guioa、骨碎补(Davallia)、Terminalia、玉蕊属(Barringtonia)、山麻黄属(Trema)、antirobia、伞树科(cecropia)、阿甘树(argania)、山药(dioscoreae)的提取物，如淮山药或墨西哥山药，阿密茴(Ammivisnaga)、豨莶(Siegesbeckia)，特别是豨莶草(Siegesbeckia orientalis)的提取物，欧石楠(Ericaceae)科的植物提取物，特别是越橘提取物(矮丛蓝莓(Vacciniumangustifollium))或熊果(Arctostaphylos uva ursi)，芦荟，含固醇(例如，植物固醇)的植物，Manjistha(从茜草属(Rubia)的植物提取，特别是茜草(Rubia Cordifolia))和Guggal(从没药属(Commiphora)的植物提取，特别是穆库尔没药(Commiphora Mukul))、可乐提取物、黄春菊、红三叶草提取物、卡瓦胡椒(Piper methysticum)提取物(来自Sederma的Kava KavaTM)、假马齿苋(Bacopa monieri)提取物(来自Sederma的BacocalmineTM)和海鞭提取物，光果甘草(Glycyrrhiza glabra)、桑椹、白千层(melaleuca)(茶树)、Larreadivaricata、冬凌草(Rabdosia rubescens)、细小裸藻(Euglena gracilis)、Fibraurearecisa Hirudinea、丛林高粱(Chaparral Sorghum)的提取物，太阳花提取物，Enantiachlorantha、Spermacocea属的Mitracarpe、Buchu barosma、散沫花(Lawsonia inermisL.)、Adiantium Capillus-Veneris L.、白屈菜(Chelidonium majus)、丝瓜(Luffacylindrica)、日本柑橘(柑橘(Citrus reticulata Blanco)温州变种)、茶(Cameliasinensis)、白茅根(Imperata cylindrica)、黄海罂粟(Glaucium Flavum)、地中海柏木(Cupressus Sempervirens)、多花黄精(Polygonatum multiflorum)、小蛇莲(loveylyhemsleya)、欧洲接骨木(Sambucus Nigra)、金甲豆(Phaseolus lunatus)、百金花属(Centaurium)、巨藻(Macrocystis Pyrifera)、特纳草(Turnera Diffusa)、知母(Anemarrhena asphodeloides)、多毛马齿苋(Portulaca pilosa)、啤酒花(Humuluslupulus)、阿拉比卡咖啡(Coffea Arabica)、巴拉圭茶(Ilex Paraguariensis)，或心叶球花(Globularia Cordifolia)、合欢花(Albizzia julibrissin)、铃兰树(Oxydendronarboretum)、红球姜(Zingimber Zerumbet Smith)、膜荚黄芪(Astragalusmembranaceus)、白术(Atractylodes macrocephalae)、长叶车前(Plantago lanceolata)、高山火绒草(Leontopodium alpinum)、紫茉莉(Mirabilis jalapa)或芹菜(Apiumgraveolens)。
本发明的组合物可以包括其他肽或肽化合物，包括不限于二-、三-、四-、五-和六肽及其衍生物。根据特定的实施方案，组合物中额外的肽的浓度范围为1×10-7％至20％，优选1×10-6％至10％，优选1×10-5％至5％重量。
根据本发明，术语“肽”是指含有10个或更少氨基酸的肽，其衍生物、异构体以及与其他物质的复合物，所述其他物质诸如金属离子(例如，铜、锌、锰、镁等)。术语“肽”是指天然肽和合成肽。还指含有肽的组合物并且其是在自然界中发现的，和/或是商业上可购得的。
用于本文中的合适的二肽包括但不限于肌肽(β-AH)、YR、VW、NF、DF、KT、KC、CK、KP、KK或TT。用于本文中的合适三肽包括，但不限于RKR、HGG、GHK、GKH、GGH、GHG、KFK、KPK、KMOK、KMO2K(MO2是蛋氨酸亚砜中的二氧化)或KAvaK。用于本文中的合适四肽包括但不限于RSRK(SEQ ID NO:1)、GQPR(SEQ ID NO:2)或KTFK(SEQ ID NO:3)。合适的五肽包括，但不限于KTTKS(SEQ ID NO:4)。合适的六肽包括但不限于GKTTKS(SEQ ID NO:5)和VGVAPG(SEQ IDNO:6)。
用于本文中的其他合适的肽包括但不限于：肽的亲脂性衍生物，优选棕榈酰衍生物，以及上述金属复合物(例如，三肽HGG的铜复合物)。优选的二肽包括例如N-棕榈酰-β-Ala-His、N-乙酰基-Tyr-Arg-六癸酯(CalmosensineTM，来自Sederma的IdealiftTM)。优选的三肽衍生物包括例如N-棕榈酰-Gly-Lys-His和Pal-Gly-His-Lys(来自Sederma的Pal-GKH和Pal-GHK)、HGG的铜衍生物(来自Sigma的LaminTM)、Lipospondin(N-反油酰基-KFK)及其保守置换的类似物、N-乙酰基-RKR-NH2(肽CK+)、N-Biot-GHK(来自Sederma)、Pal-KMO2K(来自Sederma的synthe’)及其衍生物。用于根据本发明的用途的合适的四肽衍生物包括，但不限于，N-Pal-GQPR(SEQ ID NO:7)(来自Sederma)和Ela-KTFK(SEQ ID NO:8)，用于本文中的合适的五肽衍生物包括，但不限于，Pal-KTTKS(SEQ ID NO:9)(可作为从Sederma获得)、Pal-YGGFL(SEQ ID NO:10)或Pal-YGGFP(SEQ ID NO:11)或其混合物。用于本文中的合适的六肽衍生物包括，但不限于，Pal-VGVAPG(SEQ ID NO:12)、Pal-GKTTKS(SEQ ID NO:13)、HLDIIW(SEQ ID NO:14)、HKDIITpi(SEQ ID NO:15)，Tpi是色氨酸-3-羧酸残基，或HLDIIF(SEQ ID NO:16)，或Pal-，及其衍生物。还可以提及Pal-GHK和Pal-GQPR(SEQ ID NO:7)的混合物(3000，Sederma)。
商业上可获得的含有三肽或衍生物的优选组合物包括Sederma的Biopeptide-CLTM、MaxilipTM、BiobustylTM、ProcapilTM和synthe’商业上可获得的优选四肽来源的组合物包括RiginTM、EyelissTM、Reloaded和Matrixyl其含有50至500ppm的Pal-GQPR(SEQ ID NO:7)和赋形剂，由Sederma提出。
以下销售的肽也可以作为其他的活性成分提及：
-由Pentapharm销售的VialoxTM(INCI名称＝五肽-3(包含丙氨酸、精氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和脯氨酸的合成肽))、Syn-akeTM(β-Ala-Pro-Dab-NH-Bzl)或Syn-CollTM(Pal-Lys-Val-Lys-OH)；
-由Lipotec销售的ArgirelineTM(Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2(INCI名称＝乙酰基六肽-3)(SEQ ID NO:17)、LeuphasylTM(Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu)(SEQ ID NO:18)、AldenineTM(Gly-His-Lys)、TrylagenTM(INCI名称＝交替假单胞菌(Pseudoalteromonas)发酵提取物、水解小麦蛋白、水解大豆蛋白、三肽-10瓜氨酸(瓜氨酸和三肽-10(天冬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的合成肽)的反应产物)、三肽-1)、EyeserylTM(Ac-β-Ala-His-Ser-His)(SEQ ID NO:19)、SerilesineTM(Ser-Ile-Lys-Val-Ala-Val)(SEQ ID NO 20)或DecorinylTM(INCI名称：三肽-10瓜氨酸＝瓜氨酸和三肽-10(天冬氨酸、异亮氨酸和赖氨酸组成的合成肽)的反应产物；
-由Vincience销售的CollaxylTM(Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln(SEQ ID NO 21))或QuintescineTM(Cys-Gly)；
-由Les Laboratoires Serobiologiques/Cognis销售的CytokinolTMLS(酪蛋白水解产物)；
-由l’lnstitut Européen de Biologie Cellulaire销售的KollarenTM(Gly-His-Lys)、IP2000TM(Pal-Val-Tyr-Val)或MelipreneTM(INCI名称＝单氟六肽-1：乙酸与包含精氨酸、甘氨酸、谷氨酸、组氨酸、正亮氨酸、p-氟苯丙氨酸和色氨酸的合成肽的反应产物)；
-由Innovations销售的NeutrazenTM(Pal-His-D-Phe-Arg-NH2)；或
-由lnfinitec Activos销售的BONT-L-PeptideTM(INCI名称＝棕榈酰六肽-19：棕榈酸和六肽-19(由天冬酰胺、天冬氨酸、赖氨酸和甲硫氨酸组成的合成肽)的反应产物、Timp-PeptideTM(INCI名称＝乙酰基六肽-20；通过六肽-20(由丙氨酸、甘氨酸、赖氨酸、缬氨酸和脯氨酸组成的合成肽)的乙酰基化获得的反应产物)或ECM ModulineTM(INCI名称＝棕榈酰三肽-28：棕榈酸和三肽-28(由精氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸组成的合成肽)的反应产物)。
更具体地，根据本发明的肽化合物可以与至少一种选自以下的化合物相结合：维生素B3的化合物、如烟酰胺或生育酚这样的化合物、类维生素A化合物(如视黄醇)、己脒定、α-硫辛酸、白藜芦醇或DHEA、透明质酸、肽，特别是N-乙酰基-Tyr-Arg-O-六癸酯、Pal-VGVAPG(SEQ ID NO:12)、Pal-KTTKS(SEQ ID NO:9)、Pal-GHK、Pal-KMO2K和Pal-GQPR(SEQID NO:7)，这些是局部化妆品或皮肤药物组合物中广泛使用的活性成分。
本发明还包括美容或皮肤局部处理的方法，用于改善皮肤及其附属物的外观和状况，包括将生理学上可接受载体中有效量的植物细胞或包含植物细胞的组合物局部施用于受试者的皮肤。
根据本发明，“局部处理”或“局部使用”表示打算在其施用的地方：皮肤、粘膜和/或附属物起作用的施用。
包含根据本发明的植物细胞的组合物可以局部施用于靶向区域。
“有效”量取决于各种因素，如患者的年龄、状况，失调或病理的严重性，给药方式等。有效量表示足以实现所需效果的无毒量。
根据本发明的其他特征：
-生理学上可接受介质是亲水性基质，所述植物细胞悬浮和/或溶解于其中；和/或
-活性成分包括增稠剂；和/或
-活性成分包括相对于成分总重至少0.04％的火绒草酸A和B。这种成分此后可以以所述制剂的0.1％至10％，优选1至5％，更优选2至3％和通常2％重量用于化妆品制剂中；这对应于相对于组合物总重，化妆品制剂中0.00004％至0.004％，优选0.0004％至0.002％，更优选0.0008％至0.0012％和通常至少0.0008％的火绒草酸A和B水平。
本文中使用的所有百分比和比例都是基于总组合物的重量，并且所有测量都是在25℃下进行的，除非另外指出。
例如，对于脸部的美容处理，欧洲化妆品指示(European Cosmetics Directive)设定了标准量，对于霜的施用，为2.72mg/cm2/天/人，对于身体乳，为0.5mg/cm2/天/人。
根据其他特定的特征，根据本发明的美容处理方法可以与一种或多种针对皮肤的其他方法，如鲁米诺(lumino)-疗法、热或芳香疗法相结合。
根据本发明，可以推荐具有几个隔室或药盒的设备，以应用上述方法，其可以包括例如且非限制性地含有包含根据本发明的活性细胞的组合物的第一隔室，以及在第二隔室中，为另一种活性成分和/或赋形剂，在这种情况下，认为所述第一和第二隔室中所含的组合物是用于时间上同时、分开或逐步使用的组合组合物，特别是在上述处理方法中的一种中。
根据本发明的处理方法特别适合于用于修复衰老皮肤的紧实和光滑处理的美容处理，更特别是在颈部松垂和泪沟褶皱的水平上。
详述
从以下植物细胞的制备实施例以及对这些细胞实现的体外和体内测试的详细描述，将更好地理解本发明并将清楚其他优势。
A)植物细胞的制备实施例
细胞系的形成
收集选定的高山火绒草叶块，洗涤，并切成几mm的小块，以提供200至1500个外植体。一系列去污处理以及随后灭菌后，将小块置于营养培养基存在下的含有诱导愈伤组织形成的植物生长激素的琼脂培养基上。在合适的时间段后，形成去分化细胞的团块或愈伤组织，转移至能够扩增的较大区域和新鲜培养基中。进行一些继代培养(转移至新鲜培养基)，以稳定细胞系，也就是说，直至细胞系具有高而恒定的增殖速度、表型的维持、含量恒定的目标生物活性化合物(初级和次级代谢产物)。
然后使细胞系接受选择步骤，所述选择步骤由以下步骤组成：培养细胞合适的时间、收集形成的细胞聚集物并将其接种在液体培养基中一段时间，用于获得细胞聚集物的扩增。最佳细胞系将是尽可能快且可重复地获得重要生物质的细胞系，所述生物质具有最佳含量的选定代谢产物、最佳生物活性和均一的表型。
还可以针对产生火绒草酸A和B的能力来选择细胞系，火绒草酸A和B的量相对于细胞干重为约5％重量，通过HPLC测量。
用于制备高山火绒草的未分化或去分化细胞的生物质的工业方法和这种生物质 的处理
将如上制备的细胞系或现有的细胞系用于开始。
为了进行大规模生产步骤，首先将高山火绒草细胞系扩增，以获得足够量的去分化细胞的生物质。
实施以下步骤：
a)在液体培养基中接种选定的细胞系并在足够的时间过程中培养，以获得至少300％的生物质增加；
b)任选，将步骤a)中获得的悬浮液转移至新鲜培养基中并再次在足够的时间过程中培养，以获得300％的生物质增加；
c)任选，重复步骤b)；
d)将步骤a)至c)获得的细胞悬浮液转移至含有新鲜液体培养基的生物反应器中，并在这样的条件下进行培养并持续足够的时间，以获得含有目标代谢产物，也就是说，足量的苯丙素苷和火绒草酸的细胞生物质，在生物反应器中的这个生产步骤包括通过改变培养基营养素的比率实现的引发阶段。
生物反应器：
体积：比用作接种物的生物质的体积大5至50倍；生物反应器的内表面是光滑和均一的(没有会引起细胞壁破裂的边缘或拐角)。
生长条件：
培养基：含有矿物盐(大量元素和微量元素的溶液)、维生素、植物激素以及蔗糖的培养基。在固体培养基中，添加植物琼脂。
温度：15℃至35℃，优选20℃至30℃，并且再更优选25℃。
持续时间：7至21天，优选10至14天。
生物质的搅拌：生物质得到最佳通气，并且同时，通过内部装置，或通过外部装置保持搅拌是重要的。需要搅拌尽管是小的，但有效，尤其是在生物质是大量时的最后阶段。对于本发明的目的，内部合适的装置是20至120rpm，优选60rpm的搅拌螺旋旋转，或外部轨道旋转装置优选以40至200rpm和优选以约120rpm旋转。
通氧：对于10升生物质的体积，通常使用0.5至4升/分钟，优选2至2.5升/分钟速率的无菌空气来进行。或者，可以使用含有10％至100％v/v氧的气体混合物。优选使用用于扩散空气或氧的具有喷嘴的装置，所述喷嘴具有10ml/分钟至600ml/分钟和优选50ml/分钟至350ml/分钟的流速。
获得的生物质的处理
过滤以除去培养基并回收细胞生物质。可以通过冻干细胞的当量来表征这种生物质。
细胞生物质的高压均质：允许细胞聚集物的尺寸减小；一些细胞可以被破坏，并且随后可以获得完整细胞和破碎细胞的混合物，优选保持10％的完整细胞。
通过分析测定由培养产生的初级和次级代谢产物(包括蛋白质、苯丙素苷，包括火绒草酸A和B)来表征细胞中含有的活性化合物。
任选：
1)干燥细胞，包括通过冻干或雾化，以允许目标化合物更高的稳定性，改进长期储存，而不需要添加防腐剂。
2)通过研磨/裂解/分解细胞并分离液相和固相(通过离心或过滤或其他方式)提取细胞的内含物，以获得特定的细胞提取物。
3)纯化细胞提取物，以提高火绒草酸的含量。
B)用于根据本发明的用途的活性成分的制备
可以将以上过滤后获得的，或干燥形式的，要不然所得到的提取物的细胞生物质与形成赋形剂的生理学上可接受介质混合。
作为优选实例，生理学上可接受介质是细胞悬浮于其中的亲水性基质，例如，在化妆品组合物的情况下，为甘油和/或丁二醇。如果需要，还可以添加添加剂，如抗微生物剂、抗氧化剂、稳定剂、作用于pH的试剂、乳化剂或增稠剂，包括如黄原胶的增稠剂，其将促进细胞保持悬浮状态。
由此可以形成用于实施本发明的美容用途的活性成分，其在生理学上可接受赋形剂混合物中包含例如20％重量的完整去分化细胞的新鲜的生物质(对应于约1％的干细胞)，所述赋形剂混合物由甘油(大约80％)和黄原胶(0.3％重量)组成，所述成分具有约0.05％火绒草酸A和B(约15％酸A和85％酸B)的最终含量。
所述成分可以用于制备化妆品制剂，如以下在盖伦(Galenic)段落F中所讨论的。
根据本发明，当然可以使用包含不同含量的火绒草酸的植物细胞，尤其是较高含量的，其通过体外方法直接获得(例如，使用合适的引发，用于提高比率)，或通过所获得细胞的纯化/浓缩步骤获得(例如，通过提取细胞内容物后的浓缩步骤)。
例如，可以产生包含高比例的火绒草酸的纯化提取物形式的植物细胞，例如，相对于干物质25％的比率，所述细胞自身被用于制备如上所述的活性成分。
C)体外测试结果
使用高山火绒草细胞培养物的冻干细胞的乙醇/水提取物(70/30)，进行了体外测试(在溶剂混合物中根据以上实施例获得的21％的冻干细胞)。这种溶液是储液。如果将0.2％的这种溶液加入测试基质中，所得到的溶液将是420ppm细胞等价物。下文中将使用表述“X细胞等价物的细胞提取物”。
1)真皮细胞稳态的修复
当需要时，使用加速衰老(通过UVA或UVB照射)的实验模型进行了以下测试，以证明根据本发明的产品用于恢复真皮细胞的稳态的优势。
a)凝血酶敏感蛋白合成(TSP)
原理：使培养物中的正常人角化细胞(NHK)与本发明的140和280ppm细胞等价物的细胞提取物接触48小时。通过ELISA方法评价细胞培养基中的TSP-1和-2合成。
表1：+/-本发明的细胞提取物，NHK的TSP-2产生(n＝3)
这些结果表明根据本发明的280ppm细胞等价物的细胞提取物显著诱导了NHK中的TSP-2的产生(+57％，p<0.01)。
这种TSP提高限制MMP活性，结果是改善了真皮的质量。
b)应激诱导的MMP合成的降低
原理：在根据本发明的细胞提取物(70、140和280ppm细胞等价物)存在下，将真皮人成纤维细胞(DHF)培养24小时。然后，在冲洗后，将层暴露于UVA照射，以提高这些细胞的MMP集中产生，并因此建立加速细胞衰老的模型。然后使细胞返回培养基中与根据本发明的提取物接触24小时。使用Multiplex/ELISA方法监控培养基中的MMP产生。
表2：接触根据本发明的细胞提取物的成纤维细胞在UVA照射后的MMP产生变化(n＝4)。
施加于用于建立衰老模型的成纤维细胞上的UVA应激提高了MMP-1(+292％，p<0.01)、MMP-7(48％，p＝0.08)和MMP-9(+51％；p<0.01)的产生。使细胞与根据本发明的280ppm细胞等价物的提取物接触很大程度上降低了MMP-1(-53％，p<0.01)、MMP-7(-59％，p<0.02)和MMP-9(-25％；p＝0.02)的诱导。因此，根据本发明的提取物可以限制将真皮胞外基质片段化的蛋白酶的形成。
c)应激诱导的TIMP合成的提高
原理：与之前的测试平行，使用Multiplex/ELISA方法测定了细胞培养基中的TIMP产生。
表3：对与本发明的细胞提取物接触的成纤维细胞UVA照射后的TIMP产生变化(n＝4)。
细胞与根据本发明的280ppm细胞等价物的细胞提取物接触可以重新激活TIMP-1(+170％，p<0.01)、TIMP-2(141％，p<0.01)、TIMP-3(+75％，p<0.01)和TIMP-4(37％，p<0.01)的诱导。因此，根据本发明的产品可以高度诱导MMP的特异性抑制剂。
d)根据本发明的提取物对真皮大分子的基础产生的作用
-胶原蛋白I
培养真皮人成纤维细胞(DHF)。在达到汇合后，使细胞与维生素C+/-根据本发明的140ppm细胞等价物的提取物接触并返回培养72小时。除去上清液并提取细胞层来定量细胞数。通过ELISA对上清液进行I型胶原蛋白的测定。与对照相比，没有观察到毒性。
表4：DHF上的胶原蛋白I合成(n＝5)
-胶原蛋白IV
程序与以上胶原蛋白I的相同。
表5：HDF上的胶原蛋白IV合成(n＝5)
-透明质酸
培养真皮人成纤维细胞(DHF)。达到汇合后，使细胞与根据本发明的210ppm和420ppm细胞等价物的细胞提取物接触并返回培养72小时。然后取出上清液并提取细胞层来定量细胞数。通过ELISA方法对上清液进行透明质酸含量的测定。与对照相比，没有观察到毒性。
表6：HDF的透明质酸(HA)的合成(n＝5)
[HA]ng/10E6细胞 变化(％)
对照 2546±373 参照
210ppm 3068±190 20.5；p<0.05
420ppm 4067±1123 59.7；p<0.05
对于测试的3种大分子，在根据本发明的细胞提取物的存在下，存在成纤维细胞对其产生的刺激。
2)细胞的充沛活力的改善
a)建模的真皮的收缩
原理：使用H2O2以加速方式老化培养物的FHD。然后使细胞返回其培养基24小时。然后，将这些细胞包括在真皮模型中，并且在聚合后，接收根据本发明的细胞提取物(140或280ppm细胞等价物)。追踪真皮模型的收缩4天。使用照片来通过图像分析定量差异。
表7：FHD+/-根据本发明的细胞提取物对真皮模型的收缩的调节(n＝6)。
这些结果证实了将细胞接触H2O2可以降低这些细胞的收缩能力(-33％；p<0.01)。根据本发明的280ppm细胞等价物的提取物以剂量依赖性方式降低加速衰老对细胞收缩能力的影响(与对照相比，+54％收缩，p<0.01)。
b)线粒体活力
原理：衰老细胞比年轻细胞收缩更多。保持细胞形状及其线粒体网络的特征因此是其活力的良好指示。用UVB暴露应激培养物中的真皮人成纤维细胞(DHF)，以获得收缩的表型和片段化的线粒体网络。照射后立即，随后将细胞返回与根据本发明的细胞提取物(280ppm细胞等价物)一起的培养基中，并在18小时后固定。然后用Mitotraker特异性染料标记细胞并且使用特定计算机工具通过提取事先的网络连接，从照片定量网络。
照片显示了暴露，即使少量的DHF暴露于UVB，引起它们收缩及其线粒体网络的片段化(较少丝状的线粒体，更多刺破的结构)。接触根据本发明的细胞提取物，只在照射后收缩，可以通过维持其非收缩的表型并将较少片段化的特征恢复成线粒体网络来标准化细胞的特征。
表8：HDF+/-本发明的细胞提取物对线粒体连接的调节(n＝28)。
因此，这些结果表明在UVB照射后几小时，线粒体网络被高度破坏，即使是低照射(少22％连接；p<0.02)。照射后与根据本发明的细胞提取物接触可以维持网络和连接至未照射的对照的水平(+31％，相对于UVB单独p<0.05)。因此根据本发明的细胞提取物可以恢复细胞和线粒体活力。
D)盖伦
以下描述各种化妆品制剂。当适当的支持时和/或除了根据本发明的含有高山火绒草的未分化或去分化细胞的活性成分，还可以根据其疏水性或亲水性性质，在正确的制剂相中添加其他活性成分。这些成分根据其功能、施用部位(身体、脸、颈部、胸部、手等)、所需的最终和目标消费者，可以是任何类别的，例如，特异性抗皱、保湿、抗黑眼圈、紧实、抗糖化、丰盈、安慰、肌肉放松、抗红血丝、排毒等。
以下给出了在盖伦制剂中使用的活性成分：20％重量的本发明的新鲜的未分化或去分化细胞(生物质)(对应于约1％干细胞)，基于成分组合物的总重，所述成分在生理学上可接受赋形剂混合物中具有约0.05％的火绒草酸A和B的最终含量，所述赋形剂混合物由甘油、黄原胶和当适当时调节pH的柠檬酸组成。
这种成分为0.1％至10％，优选1至5％，更优选2至3％，和通常为2％。
1)《霜剂》形式，特别是非常适用于颈部
实验方案：称重相A，使其膨胀30分钟，没有搅拌。将相A在75℃水浴中加热。称重相B，并在水浴中加热至75℃。充分混合。称重并将相C在45℃下熔化。将相D加入事先冷却的相C中。在Staro搅拌v＝500rpm下，将相C+D倒入相A中。充分混合。在Staro搅拌v＝1000rpm下，将相B倒入之前的相中。充分混合。临时地，添加相E，均质。添加相F，均质。在低于45℃下，添加相G，均质1小时。添加相H，充分混合。
可以加入这个制剂中的成分的实例：
· synthe’ 由Sederma销售的基于肽的抗皱成分(WO2010/082175)，其帮助修复由衰老引起的皮肤损伤。
· 3000：由Sederma销售的基于肽的抗皱成分(WO2005/048968)，包含两种matrikine Pal-GHK和Pal-GQPR，其协同帮助修复由衰老引起的皮肤损伤。
·PRODIZIATM ：由SEDERMA销售的活性成分(WO2013/046137)，包含合欢花(Albiziajulibrissin)提取物，对抗皮肤疲劳的迹象：黑眼圈、下眼袋、面色黯淡和憔悴的面色，通过修复和保护皮肤对抗由糖化和羟基化引起的损伤。
2)《精华》形式
实验方案：在推进器v＝300rpm下称重相A。称重并均质相B。在快速推进器搅拌v＝600rpm下，将相B加入相A中。将其均质1小时。用相C将pH调节至6.00±0.10。将相D加入之前的相中并均质。
可以加入此制剂中的成分的实例：
·KOMBUCHKATM ：由Sederma(WO2004/012650)销售的活性成分，作用于肤色、糖化、使脂肪细胞群体重新增加密度和改善皮肤的质量(光滑性、肤色)。
·REVIDRATETM ：由Sederma(WO2011/086532)销售的活性成分，特别是改善表皮的粘连及其水合。
·IDEALIFT TM：由Sederma(WO2010/136965)销售的活性成分，-丁二醇(和)水(和)山梨聚糖月桂酸酯(和)羟乙基纤维素(和)乙酰基二肽-1鲸蜡酯，其对抗脸部的松弛并改善对重力的抵抗力。
3)《乳液》形式，特别是非常适用于颈部
实验方案：称重相A。称重并混合相B。在推进器v＝800rpm下，将相B加入相A中。充分混合。将相A+B在75℃水浴中加热。称重并在75℃水浴中加热相C。在非常强的Staro搅拌v＝1000rpm下，将相C倒入相A+B中；充分混合。用相D在低于35℃下将pH调节至5.60±0.10。加入相E；充分混合。加入相F；充分混合。
可以加入此制剂中的成分的实例：
·PACIFEEL TM：由Sederma销售的活性成分actif，包含Mirabilis jalapa植物(也称为秘鲁的奇迹)的天然提取物，其减轻皮肤的不适，减淡敏感和易反应皮肤的红血丝，以及强化和水合表皮。
·RESISTEM TM：由Sederma销售的抗衰老成分(WO 2012/104774)，基于心叶球花(Globularia cordifolia)植物的细胞培养物获得的提取物，帮助皮肤构建起自身抗衰老防御系统。
·MEIRITAGETM ：基于三种植物提取物(Astragalus membranaceus(黄芪)、Bupleurum falcatum(柴胡)和Atractylodes macrocephala(白术))的抗衰老活性成分，其改善皮肤的均一性和光泽。
4)用于眼部轮廓的《凝胶》形式，特别适用于《泪沟》
实验方案：称重相A并均质。称重相B并均质。在缓慢推进器搅拌v＝600rpm下，将相B加入相A中，搅拌持续30分钟。称重相C并混合。在强烈staro搅拌v＝3000rpm下，将相C加入相A+B中。用相D将pH调节至5.50±0.10。将相E加入之前的相中并均质。
可以加入此制剂中的成分的实例：
· synthe’ 如上所述。
·HALOXYL TM：由Sederma销售的用于黑眼圈的活性成分(WO2005/102266)。HaloxylTM结合了Pal-GHK和Pal-GQPR matrikine与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和白杨素黄酮。Pal-GHK和Pal-GQPR增强了眼部轮廓的紧实度和肤色，白杨素和N-羟基琥珀酰亚胺激活了引起黑眼圈的颜色以及局部炎症的血液来源色素的消除。
·EYELISSTM ：由Sederma销售的活性成分(WO2003/068141)，其帮助防止对抗眼睛下方的眼袋的出现。其结合了三种成分：降低毛细血管渗透性的甲基查尔酮橙皮苷、促进淋巴循环的缬氨酰-色氨酸(VW)二肽和改善紧实度、弹性和减轻炎症的Pal-GQPR脂肽。
5)具有防晒作用的《遮瑕》精华形式
实验方案：称重相A并且放置在推进器搅拌v＝500rpm下。称重相B并均质。在推进器搅拌v＝800rpm系，将相B加入相A；混合充分。将相A+B在75℃水浴中加热。称重相C并使用水浴在75℃下加热。在staro搅拌v＝1000rpm下，将相C加入相A+B中。均质30分钟。在低于35℃下，用相D调节pH至5.80±0.1。加入相E，均质。加入相F，均质。
Eusolex 4360TM 是UVA过滤剂，而Eusolex2292TM 是UVB过滤剂。
可以加入此制剂中的成分的实例：
·DERMAXYL TM：由SEDERMA销售的抗衰老活性成分(WO2004/101609)，其抚平皱纹并修复皮肤屏障。
·VENUCEANE TM：由Sederma销售的活性成分(WO2002/066668)，其包含嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)生物技术提取物，其防止光老化(斑点、皱纹、干燥...)的可见迹象，保护细胞结构免受UV引起的损伤并增强皮肤完整性。
·MELASLOW TM：由Sederma销售的活性成分，其促进肤色提亮以及斑点的褪色(日本柑橘(reticulata Blanco var.unshiu Citrus)的提取物)。
6)酸性pH霜剂形式
实验方案：称重相A并放置在推进器搅拌v＝130rpm下。称重并均质相B。在推进器搅拌v＝400rpm下，将相B加入相A中；充分混合30分钟。将相A+B在75℃水浴中加热。称重相C并在水浴中加热至75℃。在staro搅拌v＝1000rpm下，将相C加入相A+B中；均质30分钟。在低于35℃下，用相D调节pH至5.60±0.10。将相E加入之前的相中，充分混合。加入相F，均质。用相G调节至pH3.50±0.10。
FruitbioTM 是由Sederma销售的活性成分，由结合绿茶提取物的α-羟基酸的复合物组成。
可以加入此制剂中的成分的实例：
·CALMOSENSINE TM：由Sederma销售的用于敏感肌肤的舒缓活性物质(WO1998/07744)，其包含Tyr-Arg lipo-二肽。其降低不舒适感。
·PHYTOTONINETM ：由Sederma销售的活性成分，其包含三种植物活性物质的协同组合物，山金车(Arnica montana)花的类黄酮、多花黄精(Polygonatum multiflorum)(Solomon's Seal)根茎的皂素和地中海柏木(Cupressus sempervirens)(Cypress)球果的原花色素；显著改善“斑点”皮肤的外观。
·CHROMOCARETM ：由Sederma销售的抗衰老活性成分(WO2010/119423)，其结合了富含冬凌草甲素的冬凌草(Rabdosia rubescens)提取物和富含豨莶甙的豨莶草(Siegesbeckia orientalis)提取物，其使肤色均匀并年轻。
7)稠的霜剂形式，特别用于晚霜
实验方案：称重相A。称重相B并混合。将相B加入相A中，并充分混合。将相A+B在75℃水浴中加热。称重相C并在水浴中加热至75℃。充分混合。将相A在热板上加热至90℃，同时用刮刀混合。在75℃水浴下，将相D加入相C中。在75℃水浴下，将相A加入相A+B中。在强烈搅拌(v＝2500rpm，然后在水浴外1500rpm)下，缓慢地将相A+B+E加入相C+D中。加入相F。
Ceramide 2TM 是Sederma销售的活性成分，由与皮肤中存在的神经酰胺相同的纯物质组成，其构成皮肤脂质的40至50％。这种成分具有重建功能，保持皮肤屏障的水合和完整性。
E)体内测试
在颈部和泪沟的褶皱上进行了本发明处理的体内效果的评价。
原理
对59岁平均年龄(41-71ans)的女性进行了研究，她们具有几个可见的衰老特征：
-在颈部，使用松垂表面的测量，通过标准化照片的图像分析，以及对这些照片的专家评价。
-在泪沟的褶皱(在滚落脸颊前眼泪通过其移动的细纹)上，通过光栅投射测量其表面。
对于颈部，基于松垂表面的可见重要性，选择了一组31名平均年龄60岁(45-71岁)的人群。
对于泪沟，在这种类型的褶皱的可见程度的基础上，包括了21名年龄超过55岁(平均年龄64岁)[56-71岁]的人群。
实验方案
特定入选标准
需要志愿者具有明确松垂的颈部皮肤表面和称为泪沟区域中明显可见的褶皱。女性必须在测试前三个月以及测试过程中具有激素一致性。需要七天清洗期，在该过程中，志愿者只可以在脸上使用简单的保湿霜。在测试过程中，要求受试者只将自身暴露于适度的阳光下并且只使用提供的产品。
研究类型和持续时间
研究是在颈部和脸部的简单盲试。每位志愿者施用根据本发明的霜(2％盖伦的实施例1的配方)和安慰剂霜并且是在其脸的对侧，除了颈部，其中为了实施原因，只施用2％根据本发明的霜。将两种霜按摩至皮肤中，每日两次，持续6周。
研究概要显示于下图中。
使用Student’s检验进行了统计学测试，或如果需要，使用Wilcoxon符号秩检验。对配对的系列进行检验。对于自我评价，使用Chi2检验。
颈部的松垂表面和光滑的研究
根据本发明的产品对颈部的效果包括通过标准化照片的图像分析，以及对这些照片的专家评价测量颈部的松垂部分。
使用配备了高清晰度数码相机、特殊照明以及志愿者的约束系统的摄影台(来自Orion Concept Company，法国)，在T0和3周拍摄了照片。将脸部的位置、照片和照明参数标准化并进行控制，以随着时间加以重复。
通过图像分析，对侧脸照片测量了颈部的松垂表面。使用解剖学不能移动的标记(疤痕、斑点等)来精确限定颈部表面，包括松垂的表面的轮廓。
表9：
这些结果显示出颈部松垂表面在3周时的减少；这种减少达到了在T0时测量的表面的11％(p<0.01)。平行地，观察到了强的响应者比例(77％)。关于颈部皮肤的光滑作用，得到了观察了28名在颈部具有褶皱的志愿者的照片的七名专家小组的认可。专家们发现了在6周后56％的情况具有光滑作用。
泪沟褶皱的研究
泪沟是眼泪滚落脸颊前流过的空洞。这种眼窝下的空洞与下眼睑是连续的并且有时候将在脸颊和颊骨之间延伸。这种空洞随着年龄愈加明显，因此增加其容积。涉及的因素通常是脂肪熔化和松弛。
为了测试本发明的处理对这个部位的效果，使用了无接触FOITS系统(“快速光学体内拓扑系统(Fast Optical In vivo Topometry System)”)。这种系统是基于光栅在所研究皮肤区域(在本文中为泪沟)的投射。使用的装置(来自Dermatop公司；Eotech，法国)由连接的并形成特定角度的投影仪和相机组成，允许三角测量。通过部位减轻的光栅变形的研究允许减轻的3D重建。
使用AevaTM软件(Eotech，法国)，通过对由其圆周测量的泪沟程度的数据分析，进行了根据本发明的作用的客观化。平行地，通过相同程序获得了泪沟的容积参数。
表10：应用本发明后泪沟的程度和容积的变化(N＝21名志愿者；>55岁)
dns：非显著性差异。
结果显示了根据本发明的处理导致泪沟程度9％的降低(以圆周测量)，这种降低与安慰剂相比是显著的(p<0.01)。在对侧，施用安慰剂没有产生显著变化。此外，超过55岁人群的泪沟的容积降低8.8％，与安慰剂相比，这种降低是显著的(p<0.01)。
序列表
<110> SEDERMA
<120> 高山火绒草的植物细胞用于美容处理的用途和相应的活性成分
<130> LEONTO PCT
<150> FR1550239
<151> 2015-01-13
<160> 21
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 1
Arg Ser Arg Lys
1
<210> 2
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 2
Gly Gln Pro Arg
1
<210> 3
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 3
Lys Thr Phe Lys
1
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 4
Lys Thr Thr Lys Ser
1 5
<210> 5
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 5
Gly Lys Thr Thr Lys Ser
1 5
<210> 6
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 6
Val Gly Val Ala Pro Gly
1 5
<210> 7
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 通过N末端上的棕榈酰链酰胺化
<400> 7
Gly Gln Pro Arg
1
<210> 8
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 通过N末端上的反油酰链酰胺化
<400> 8
Lys Thr Phe Lys
1
<210> 9
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 通过N末端上的棕榈酰链酰胺化
<400> 9
Lys Thr Thr Lys Ser
1 5
<210> 10
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 通过N末端上的棕榈酰链酰胺化
<400> 10
Tyr Gly Gly Phe Leu
1 5
<210> 11
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 通过N末端上的棕榈酰链酰胺化
<400> 11
Tyr Gly Gly Phe Pro
1 5
<210> 12
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 通过N末端上的棕榈酰链酰胺化
<400> 12
Val Gly Val Ala Pro Gly
1 5
<210> 13
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 通过N末端上的棕榈酰链酰胺化
<400> 13
Gly Lys Thr Thr Lys Ser
1 5
<210> 14
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 14
His Leu Asp Ile Ile Trp
1 5
<210> 15
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MISC_特征
<222> (6)..(6)
<223> Xaa是色氨酸-3-羧酸残基（Tpi）
<400> 15
His Lys Asp Ile Ile Xaa
1 5
<210> 16
<211> 0
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 16
000
<210> 17
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> N末端上的乙酰化
<400> 17
Glu Glu Met Gln Arg Arg
1 5
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 18
Tyr Ala Gly Phe Leu
1 5
<210> 19
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 19
Ala His Ser His
1
<210> 20
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 20
Ser Ile Lys Val Ala Val
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成肽
<400> 21
Gly Pro Gln Gly Pro Gln
1 5

Claims (14)

1.通过体外细胞培养方法获得的高山火绒草(Leontopodium alpinium)的未分化或去分化植物细胞用于恢复衰老皮肤的细胞的稳态和提高细胞的代谢和能量活性的非治疗性美容处理的用途。
2.完整和/或裂解的植物细胞的根据权利要求1的用途。
3.所述完整和/或裂解的植物细胞的细胞提取物的根据权利要求2的用途。
4.干燥形式的植物细胞的根据权利要求1至3任一项的用途。
5.包含悬浮和/或溶解于生理学上可接受介质中的所述植物细胞的化妆品组合物的根据权利要求1至4任一项的用途。
6.根据权利要求5的用途，其中所述生理学上可接受介质是亲水性基质。
7.根据权利要求1至6任一项的用途，其中所述处理是局部的。
8.根据权利要求1至7任一项的用途，用于对衰老皮肤的紧实和光滑修复处理。
9.根据权利要求8的用途，用于颈部的松垂表面和/或泪沟褶皱的美容处理。
10.通过体外细胞培养方法获得的高山火绒草(Leontopodium alpinium)的未分化或去分化植物细胞用于产生恢复衰老皮肤的细胞的稳态和提高细胞的代谢和能量活性的非治疗性美容活性成分的用途。
11.根据权利要求10的用途，其中所述活性成分包含至少0.04％的火绒草酸A和B。
12.美容活性成分，用于根据权利要求1至9任一项的用途，包含通过体外细胞培养方法获得的高山火绒草(Leontopodium alpinium)的未分化或去分化植物细胞并在生理学上可接受基质中包含至少0.04％火绒草酸A和B。
13.根据权利要求12的成分，其中植物细胞是完整和/或裂解的。
14.根据权利要求13的成分，包含所述完整和/或裂解的植物细胞的细胞提取物。
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