CN103796633B - 球花属植物源提取物的新用途，以及通过离体植物培养获得所述提取物的方法 - Google Patents

Abstract

根据本发明，球花属的植物源提取物用于皮肤和/或附器的非治疗性化妆品处理。作为首选，物种是心叶球花，提取物通过离体植物培养获得。提取物尤其能用于通过毒物刺激型响应来刺激解毒反应和细胞再生而预防和/或处理皮肤老化，有于改善面色的透明度和光亮度，用于预防或处理过敏性和反应性皮肤，用于预防或处理发红，用于预防蛋白质糖化，用于增加和/或维持皮肤干细胞的数量，用于增加和/或维持皮肤大分子，尤其是胶原蛋白和弹性蛋白，用于增大真皮的体积，用于预防和/或处理细线和皱纹，用于皮肤定形，用于预防脱发和/或刺激头发再生。本发明也提出了通过球花属未分化细胞的离体植物培养获得提取物的原始方法，以及能通过此方法获得的植物源提取物。

Description

球花属植物源提取物的新用途，以及通过离体植物培养获得所述提取物的方法

技术领域

本发明的主题是球花属（Globularia）植物源提取物的新用途，以及通过离体（invitro）植物培养获得所述提取物的首选方法。

本发明一般主要涉及化妆品工业；它生产和/或使用植物源提取物来预防并处理动物或人类哺乳动物的皮肤、头皮、粘液和附器（比如头发、睫毛、眉毛、指甲或毛发）的紊乱。

根据本发明，“植物源提取物”意思是从植物上直接获得的、或者通过植物细胞或组织的培养而获得的提取物。

背景技术

在化妆品中，有许多方式来改善皮肤、头发和指甲的总体条件。这包括给予或恢复肤色、水合作用、着色或褪色；防止外部攻击行为，比如UV辐射或寒冷、平静刺激、发红、痤疮；减少微水肿（比如眼袋）；减少黑眼圈，老化迹象，比如皱纹、细线、着色；恢复柔软度和弹性；处理脱发；作用于脂肪组织；增加体积、密度；改善质地等。长期以来，在全球各地，植物王国是一个丰富、并被广泛使用的生物活性物质来源，尤其是在制药和化妆品领域。

球花属种类属于车前草科，Globularioideae亚科，由若干个物种组成，包括已知的那些品种：Globularia alypum（南欧球花），Globularia bisnagarica（植物名称），Globularia cordifolia（心叶球花），Globularia nudicaulis（植物名称），Globularia vulgaris（球花属寻常），Globularia gracilis（植物名称），Globularia repens（球花属棕）和Globularia valentina（球花属瓦伦蒂娜）。

它们是小型草本植物，单叶，互生，具有球头形花朵，分布地从亚热带到温带地区。它们主要能在欧洲和北美找到。

EP0006059发明了一种提取Globularia alypum（南欧球花）和Globularia vulgaris（球花属寻常）的过程；其中，利用两种极性不同的萃取溶剂来处理整个植物、茎、或叶子。由此过程获得的提取物在人类和兽医治疗方面都有用，尤其在布鲁氏杆菌病的治疗当中。

特定的黄酮、类黄酮、环烯醚萜和苯酚化合物都已经在球花属中找到，尤其是在Globularia cordifolia（心叶球花）物种当中（参考文献：“6-羟基木犀草素和野黄芩黄素作为高等植物中的种系标记”，在期刊“植物化学”中，第10卷，第2号，1971-02，p.367-378；“Globularifolin，来自心叶球花的一种新酰基环烯醚萜苷”，HelveticaChimica Acta，第63卷，第1号，1980-01-23，p.117-120；“来自心叶球花的酚类化合物”，Turk J Chem，第28卷，2004，p.455-460以及“来自心叶球花的环烯醚萜和双环烯醚萜糖苷”，生物科学期刊，第58c卷，2003，p.337-341）。

发明内容

本发明的目的是，为始终需要新型活性成分的化妆品工业提供一种新的植物源提取物。

为此，本发明提出，使用球花属的植物源提取物，用于皮肤和/或附器的非治疗性化妆品处理。

皮肤会遭受许多外部应力：UV，电磁波，氧化剂，污染物，生物制剂等。在其它有害影响当中，这些应力包括或多或少慢性的微发炎现象，以及在表皮细胞中或者在它们的周围有毒产物的形成。

在这些产物当中，有预发炎的介质和一些生长因素；它们能造成与对外部刺激物反应过度相关的表皮神经末梢的局部过度增浓。这导致皮肤针对这些刺激物的阈值下降。它变得非常敏感，产生不适感，而且在大多数时间都会伴随短时发红。

此外，皮肤逐步积累各种起源的碎屑，其组成有蛋白质、碳水化合物及改变的脂质。这些组分（羰基化的蛋白质，脂质过氧化物，脂褐素等）也将充当毒素；它们能干扰生理学和细胞的内环境稳定，并改变脆弱的代谢平衡。

随着时间的推移，它们改变线粒体呼吸、薄膜完整性、酶的活性、以及解毒机理，比如蛋白酶体。此类改变能导致某些细胞行为的变化，比如干细胞。实际上，后者处于一种具体环境；其中，改变可能导致削弱它们的特性和它们的原本表型（细胞尺寸变大，多层能力下降等），使得它们保持其在角质化细胞更新中的能力下降。

实验数据显示，早期接收的适度应力能延缓降级，从而延缓皮肤的老化，帮助身体在以后应对更加严重的应力（外部事件）。这种现象称为毒物刺激作用。它基于作为对适度应力的响应、或者作为对据说具有毒物刺激效应的物质（称为毒物刺激剂的分子）的响应，解毒机理和细胞防御的激活。毒物刺激作用将有助于细胞、从而也就是身体对后续应力的更好适应，允许它更加有效地抵抗上面提到的有害影响。

这样，从化妆品观点出发，非常有趣的是，通过模拟毒物刺激作用来改善皮肤的生理学，允许它更好地抵抗将来的应力，从而防止皮肤老化。

为了更好地理解这种毒物刺激效应，可以将它说成是一种抗老化疫苗。毒物刺激效应虽然显示了它的长期效应（抗老化），但是，通过降低皮肤对外部应力的敏感性、并通过给皮肤提供更多透明度和亮度（或光亮度），它也将在短期内快速改善皮肤条件。通过一系列试验（下面具体描述），针对球花属提取物，已经特别显示了这一组原始的、和意想不到的性质。

这样，下面给出的详细描述显示，尤其利益于对皮肤毒物刺激防御的模拟，这种提取物具有完全意想不到的、在目标技术领域中原始的体内（in vivo）性质；包括提高皮肤透明度和皮肤反应，在皮肤的视觉质量方面产生明显影响：光亮度，清晰度，纯度和颜色均匀性，光滑性等。

另外，本发明的球花属提取物已经显示了在皮肤干细胞上的功效。

在毛囊的愈合、形态发生和发展过程中，都涉及到皮肤干细胞。其它性质都与皮肤干细胞有关：它们是真皮层的前体，维持并形成一个细胞库；这利益于它们区分成若干细胞类型的潜力。

增加的和维持的皮肤干细胞数量意味着真皮中更多处于良好状态的成纤维细胞，从而有更多的大分子和纤维（胶原蛋白，弹性蛋白等）。能够设想与真皮重新丰满相关的所有化妆品应用；例如，皱纹和细线的处理，或者是稳固性的处理。另一个应用是能够增强的毛发再生和/或脱发预防，因为我们知道，完整毛囊的形成是通过真皮细胞诱导的。

下面给出的详细活体外（in vitro）示例研究表明，本发明尤其适用于：

-通过模拟毒物刺激型响应的解毒反应和细胞再生，预防和/或处理皮肤老化；和/或

-改善面色的光亮度和/或透明度；和/或

-用于预防和/或处理过敏的、和/或反应性皮肤；和/或

-用于预防和/或处理发红；和/或

-用于预防蛋白质糖化；和/或

-用于增加和/或维持皮肤干细胞的数量；和/或

-用于增加和/或维持皮肤大分子，尤其是胶原蛋白和弹性蛋白；和/或

-用于增加真皮的体积（真皮的重新丰满）；和/或

-用于预防和/或处理细线和皱纹；和/或

-用于固化皮肤；和/或

-用于预防脱发和/或刺激头发再生。

其它使用也是可能的；例如，增白，增湿，减重，表皮体积增大，痤疮，抗发炎等。尤其是化妆品中，能够提供的应用示例范围是：增湿剂，清洁剂，净化，抗老化，抗氧化剂，保护剂，恢复剂（手，足，唇），轮廓（面部，眼睛，颈部，唇），补充皮肤护理和用于附器，包括睫毛、唇部产品、防阳产品、重新塑造、丰满、整形、充脂（例如在手上、胸部、乳房），毛发用产品等。

更明确地说，本发明指的是展示了特别感兴趣结果的心叶球花物种。心叶球花（也称为heart leaf globe daisy——中文意思也是“心叶球花”）是在海拔高达2000m处生长的小型山岩植物。它在-30°C的温度下都能存活，在恶劣的白垩质土壤中能茁壮成长。它来自欧洲和中亚的山区。

根据其它特点，本发明使用的提取物最好是通过离体植物培养来获得，更加尤其是通过植物细胞培养，或者通过来自细胞基质的组织培养、或来自不同植物器官的组织线。

本发明也涵盖了从整个植物或其特定部位、更加首选的是从叶子中获得的提取物的使用。

与农业产业路径相比（在露天土地中植物培养，随后在工厂中萃取），通过离体培养获取植物源提取物具有许多优点。获得的提取物没有毒性物质（除草剂，农药，化肥，重金属和其它污染物，比如可能来自植物寄生虫的那些污染物）。另外，离体培养条件的严格控制能减少应变轮廓自发变异的风险，并保证对应于寻求利益分子的可再生的二次代谢物轮廓；这与露天土地种植不同。在那里，由于天气和地理的原因，存在可变性的问题。还有，这种技术能克服其它障碍，比如植物的天然生物周期、以及二次代谢物生产的季节性，从而允许更好的安全性和快速供应能力。

此外，环境影响非常小，避免了耕地消耗与土壤污染。还有，由于只需要一株植物、甚至是一粒种子就能开始离体培养，所以生物多样性得到保留。最后，这项技术提供了朝着生产有用分子的直接细胞新陈代谢（培养的激发）的能力，而且能够实现一些受控的、相对快速的协议，以便使产率最大化。

在离体植物培养领域的现有技术当中，下列技术能根据本发明使用：

未分化细胞的培养：这种方法涉及首先在琼脂培养基中形成高度增殖的细胞株。这些株接着在液体培养基中生长，以便实质性地增大生物体量。在生长周期和待定义并优化的环境条件（针对合适的激发参数搜索）结束时，细胞生物体量将合成感兴趣分子。然后，在最佳时间培养停止并提取，以获得我们称之为植物源的提取物，包含最多数量的感兴趣分子。最初也可以使用已经存在的原有的细胞株。

组织或器官的培养：这类培养能关注根部分（“根培养”）或地上部分（“苗条培养”）。在这类方法中，有一些培养已经通过基因组细菌发根土壤杆菌（根）或根癌土壤杆菌（茎）转变而来。这样转变的根或苗条部分培养具有高生产速率，而且基因非常稳定。在优化激发参数之后，使用它们来合成感兴趣分子。然后，通过常规方法提取这些分子。

通过无性繁殖的离体微体繁殖，尤其是体细胞胚胎发生：此技术的第一步是，选择具有优化特征（在有用代谢物的生长和生产方面）的亲本植株。在胚胎发生中，下一步是从来自亲本植株的外植体引入愈伤组织。这些未分化细胞能产生众多体细胞胚；它能可能通过连续的培养周期而增多并扩大。从最有增殖和生产能力的植株，籽苗在合适的培养基中再生，并在针对有用代谢物最佳生产的合适时间提取。第二步是在合适的培养基中，引入来自亲本植株外植体的带叶子的茎；这利益于它的激素组成。在诱导根的生根阶段之后，跟着多叶茎的放大阶段。然后，可以大量再生小植物，以便在合适的培养基中种植它们，并提取感兴趣分子。

根据未分化细胞植物培养的第一种技术，本发明择优地提供了一种制造方法。

尤其是，此方法属于包括来自未分化植物细胞的植株的类型：

-一个预培养步骤，用于增大生物体量，

-在生物反应器中的一个培养步骤，包括增殖阶段和之后的激发阶段，以及

-所述提取物的回收步骤。

根据其它特点：

-预培养步骤包括完成增大体积的预培养，较小规格的每个预培养；用于大量生成细胞的生物体量，以便接种较大规格的预培养。

-生物反应器中的后续培养步骤是在生物反应器中实现，利用在预培养步骤中生产的生物体量进行接种。在基础培养基中的细胞增殖的初始阶段后，将二次代谢物的激发培养基加到生物反应器中。当二次代谢物已经达到所需的水平时，停止培养。更可取的是，为了达到这个水平，根据本发明，使用在蔗糖和常量营养素中缺乏的激发培养基。

-回收步骤（也称为收获步骤）包括该生物体量的提取阶段；通过任何生理上可以接受的溶剂，或者这些溶剂的任何混合物。提取可以通过不同已知方法的组合来完成：加热，浸渍，煎熬，注入，加压，浸析，超声波，微波，通过用任何化学或物理上合适的方法来溶解细胞。通过过滤或离心处理，能实现相位分离。或者，也可以利用超临界或亚临界流体来提取生物体量。还有一种替代方法，即可以使用吸附树脂、色谱法或液液分割实现提纯。

根据首选的具体做法，细胞被溶解，目的是将细胞内容转移到水中。更加首选的是，根据本发明，溶菌是通过下降到酸性pH值来进行。在若干过滤后，获得无菌提取物。然后，根据提取物的后续使用，方便地调节其pH值；例如，对于下面描述的化妆品应用，pH值调节到4。

根据本发明，细胞株可以是原有的株，或者是在预备步骤中创建的株，利用及时单独执行的所述步骤。

根据本发明，创建细胞株包括以下步骤：1）引入愈伤组织（未分化细胞的束）；2）选择最好的愈伤组织株；3）转移到细胞悬浮物，优化生长参数，并生产感兴趣分子（例如，激发）。

尤其是：

1)愈伤组织的引入能利用植物的所有部位来完成，包括：叶，果实，根，芽，种子，茎，枝，及分生组织，尤其是形成层；根据本发明，未分化细胞培养最好是利用植物的叶子来实现。

2)在液体培养基中转移之前，最佳株的选择根据本发明执行；尤其是包括下列准则：高增殖能力，温柔和脆性结构，均匀的颜色，以及在液体培养基中的良好分散和这些参数的长期稳定性。

3)对于选择的株，通过在第一个步骤中选择最合适的培养基来保证生物体量的快速生长、以及第二次在细胞指数生长期结束时允许二次代谢物合成的最大效率，在液体培养基中优化二次代谢物生长和生产特征。这样的第二阶段对应于培养激发，能以熟练人员可用的诸多不同方式来实现。这些方式包括：给培养中添加微生物分数，给已知分子加压、以指导细胞实现它们的二次新陈代谢，在培养中采用温度或pH值、或渗透压力的变化，环境贫化的使用，给培养基中增加吸附树脂；除了激发以外，感兴趣的化合物能捕捉它们。根据本发明，激发的首选方法是在常量元素和糖中使培养基枯竭。

因此，本发明的另一个目的是，获取球花属的植物源提取物的方法；尤其是实施根据本发明的离体植物培养的使用，包括来自未分化植物细胞的植株：

-预培养步骤，设计用于增大生物体量；

-生物反应器中的培养步骤，包括激发阶段后的增殖阶段；以及

-所述提取物的回收步骤。

其中，生物反应器步骤中的激发阶段利用蔗糖和常量营养素培养基中的不足来实现；而在所述提取物的具体回收步骤中，包括酸性pH细胞溶菌。

这样就获得了用于生产本发明中实施的植物源提取物的原始细胞株；这在研究领域中是原始的和活跃的，正如下面给出的功效试验显示，尤其是心叶球花的细胞株。

因此，本发明的另一个目的是能够利用上文所述本发明中的方法获得的提取物。

本发明还有一个目的是局部成分；包括球花属提取物，首选的是心叶球花提取物，更加首选的是通过本发明上文披露的未分化植物细胞离体培养而获得的心叶球花提取物。此类局部成分可能包括生理上可接受的培养基和附加活性物质（这将在下文的草本制剂示例中提到）。局部成分可以用于化妆品应用或皮肤制药应用。

本发明也涵盖了用常规方法获得的植物源提取物，例如通过整个植物或植物的特定部位的溶剂提取，通过超临界流体、微波或超声波；但是，比较结果表明，从细胞株获得的提取物要远优于常规溶剂提取物。这些结果将在下文详细描述。

实现本发明的球花属提取物能在生理上可接受的培养基中以纯净或稀释方式使用，构成赋形剂或胞间质。

根据本发明的其它先进特点，球花属提取物至少能与一个附加活性成分组合，目的是提供具有更加广大性质范围的终端产品。例如，附加活性成分可以选自：增白剂，防发红，UV防晒霜，增湿，润湿剂，防脱落，抗老化，抗皱，减小体积，增大体积，改善弹性，防痤疮，防发炎，抗氧化剂，抗自由基，去色，增色，脱毛剂，防生长或促进头发生长，肽，维生素剂等。这些活性成分能从植物材料获得，比如植物提取物、或植物培养或发酵的产品。

更加特别的是，在化妆品组分中，本发明的植物源提取物能组合至少一种化合物，它们可选自下列化合物：B3维生素化合物，比如烟酰胺和生育酚；类维生素A化合物，比如松香油，去氧苯经妥，α-硫辛酸，白藜芦醇或DHEA，肽，包括N-acetyl-Tyr-Arg-O-hexadecyl，Pal-VGVAPG（SEQ ID NO：1），Pal-KTTKS（SEQ IDNO：2），Pal-GHK，Pal-KMO2K和Pal-GQPR（SEQ ID NO：3）；它们是在局部化妆品或皮肤制药组分中使用的常规活性成分。

为了更好地理解本发明，我们给出下面的描述。

下列示例展示的本发明并不意味着将它限制在仅有的那些应用。

具体实施方式

组分制备

根据本发明，表达术语“生理上可接受的培养基”意思是，但不限于，水性或水-醇溶液，水在油中乳化液，油在水中乳化液，微乳化液，水性凝胶，无水凝胶，浆液，泡囊或粉末的分散液。

“生理上可以接受”意思是，组分适合于局部使用，可以接触哺乳动物、尤其是人类的粘膜、指甲、头皮、毛发、头发和皮肤，不存在毒性、不兼容性、不稳定性、过敏反应等等其它方面的风险。

“生理上可接受的培养基”构成了我们常说的组分的赋形剂。

本发明提到的植物源提取物的有效数量、也可说是它的剂量，取决于很多因素；比如患者的年龄、状态、疾病的严重程度、或管理的条件和模式。有效数量指的是足以实现所需效果的没有毒性的数量。

在本发明的化妆品组分中，以有效数量存在的球花属提取物一般采用的数量范围是从组分总重的0.000001%到15%，更加首选的是在0.0001%到10%之间，取决于组分的运用目的地和希望更加明显或不太明显的效果。

此处使用的所有百分比和比例都指的是与总组分的重量比；所有测量都是在25°C时进行，除非另外注明。

组分中赋形剂的选择是根据球花属活性提取物的约束条件（稳定性，溶解性等）；而且，如果必要，还根据组分中打算进一步运用的剂型。

本发明的球花属提取物可以采用水性溶液的方式组合到组分中；或者通过常规生理上可接受的助溶剂溶解，例如（但并不限于）这个清单：乙醇，丙醇，异丙醇，丙二醇，丙三醇，丁二醇，或聚乙二醇；或者是它们的任意组合。用乳化剂溶解提取物它也可能是有趣的。也能使用粉末培养基。

本发明的组分通常可通过常规方法来制备；在制造局部和口服组分及注射组分领域熟练的人员都知道这些方法。此方法可能涉及在一个或多个步骤中配料的混合物，以获得均匀状态，可以利用、也可以不用加热、冷却等。

可以包含本发明球花属提取物的不同草本制剂形态是指下面的一切形态：即，面霜，乳液，奶或霜膏，凝胶，乳化液，分散液，溶液，悬浮液，清洁剂，衬底，无水制剂（棒，尤其是唇膏，身体和洗浴油），淋浴和泡澡凝胶，洗发水和头发护理液，用于皮肤护理或头的奶或霜膏，净化洗液或奶液，防晒洗液，奶或霜膏，人工晒黑洗液，奶或霜膏，剃须前、中或后霜剂，泡沫，凝胶或洗液，化妆品，唇膏，染睫毛油或指甲抛光，皮肤香精，浆液，粘结或吸附材料，透皮贴剂，或软化剂粉末，洗液，奶或霜膏，喷剂，身体和洗浴油，衬底基础，软膏，乳化液，胶质，压实悬浮液或固体，铅笔，可喷涂配方，可刷物，刷子，红颜料，描眼膏，描唇膏，润唇膏，面或身体粉末，定形凝胶或摩丝，指甲调节，唇膏，皮肤调节器，增湿剂，清漆，肥皂，去角质剂，收敛剂，脱毛剂，永久成波浪溶液，防头屑配方，止汗或防排汗组分，包括棒，“卷起的”除臭剂，空气清新剂，鼻子喷剂等。

这些组分也可以采用唇膏的形式，意图是给嘴唇上色、或防止它们皲裂；或者是用于眼睛、眼影的化妆品，以及面部的衬底。本发明的组分能包括化妆品，个人护理产品和制药制剂。也能考虑采用泡沫形式的组分，或者采用气凝胶组分，也包括加压的推进剂。

本发明的提取物也可以采用下列形式：溶液，分散液，乳化液，膏，或粉末，单独或作为预混或赋形的，在媒介物中单独或作为预混，比如宏-、微-或毫微囊剂，宏-、微-或纳米级囊剂、脂质体、油质体或乳糜微粒，宏-、微-或纳米级颗粒，或宏-、微-或纳米级海绵、孢子或外膜，微或纳米级乳化液、或吸附在有机聚合物粉末、滑石、膨润土、或其它无机或有机载体上。

本发明的球花属提取物可以采用任何形式使用；采用的形式可以是粘到或组合进或吸附到下列物质其中或上面：宏-、微-和纳米颗粒，或者宏-、微-和钠米-胶囊，用于处理织物、天然或合成纤维、木材、以及可以用于打算与皮肤接触的日用或夜用衣服或内衣的任何材料，手帕或布子，用于通过这种皮肤/织物接触来施加它们的化妆品效果，并允许持续的局部输出。

附加配料

《CTFA国际化妆品配料词典和手册（第13次修订，2010年）》（出版商：Cosmetic，Toiletry，and Fragrance Association，Inc.，Washington，D.C.）描述了能在本发明的组分中作为附加配料/化合物使用的、皮肤护理行业中常用的无限广泛的化妆品和制药配料。这些配料类别的示例包括，但不限于：愈合剂，皮肤抗老化剂，抗皱剂，抗萎缩剂，皮肤增湿剂，皮肤平滑剂，抗菌剂，抗寄生虫剂，抗真菌剂，杀真菌剂，真菌静态剂，杀菌剂，抑菌剂，抗微生物剂，消炎剂，止痒剂，麻醉剂，抗病毒药物，角质层分离剂，自由基清除剂，反皮脂溢剂，去头屑剂，调节皮肤变异、繁殖或着色的试剂，渗透加速剂，脱鳞片剂，黑色素合成刺激或抑制剂，增白、去色或发光剂，前着争剂，自行晒褐剂，NO-合酶抑制剂，抗氧化剂，自由基清除剂和/或防大气污染剂，活性羰基物种清除剂，抗糖化剂，收紧剂，刺激真皮或表皮大分子合成和/或能够抑制或预防它们降级的试剂，比如胶原蛋白合成刺激剂，弹性蛋白合成刺激剂，核心蛋白聚糖合成刺激剂，层粘连蛋白合成刺激剂，防卫蛋白合成刺激剂，伴护合成刺激剂，水通道蛋白合成刺激剂，透明质酸合成刺激剂，粘连蛋白合成刺激剂，去乙酰化酶合成刺激剂，角质层（神经酰胺、脂肪酸等）脂类和组分合成的刺激剂，胶原蛋白降级抑制剂，弹性蛋白降级抑制剂，成纤维细胞增殖，角质化细胞增殖刺激剂，脂肪细胞增殖刺激剂，黑素细胞增殖刺激剂，角质化细胞变异刺激剂，脂肪细胞变异刺激剂，乙酰胆碱酯酶抑制剂，葡糖胺聚糖合成刺激剂，DNA修复剂，DNA保护剂，抗痒剂，过敏皮肤处理和/或护理剂，固化剂，防妊娠纹剂，收敛剂，皮脂生产调节剂，皮肤松驰剂，愈合辅助剂，表皮再植刺激剂，表皮再植联合辅助剂，细胞因子生长素，镇静剂，消炎剂，毛细管循环和/或微循环作用剂，血管形成刺激剂，血管渗透性抑制剂，细胞新陈代谢作用剂，真皮-表皮接合改善剂，生发诱导剂，毛发生长抑制或阻燃剂，肌肉松驰剂，抗污染和/或抗自由基剂，脂解刺激剂，减肥剂，抗臀腿脂肪剂，微循环使用剂，细胞能量新陈代谢作用剂，清洁剂，头发调节剂，头发定形剂，头发生长促进剂，防晒霜剂，完全防晒剂，化妆剂，去污剂，制药产品，乳化剂，软化剂，有机溶剂，防腐剂，除臭剂活性成分，生理上可接受的载体，表面活性剂，粘结剂，吸附剂，美学组分，比如香料、颜料、染料、着色剂、天然着色剂、香料油，触摸剂，化妆品收敛剂，抗痤疮剂，抗凝结剂，消泡剂，抗氧化剂，粘结料，生物添加剂，酶，酶抑制剂，酶诱导剂，辅酶，螯合剂，植物提取物，植物衍生品，香料油，海洋提取物，从生物发酵或生物技术过程获得的制剂，矿物盐，细胞提取物，防晒霜（防紫外A和/或B射线的有机或矿物光保护剂活性成分），神经酰胺，肽，缓冲剂，增容剂，螯合剂，化学添加剂，着色剂，化妆品杀生物剂，变性剂，医用收敛剂，外部镇痛剂，成膜剂，比如聚合物、用于加强组分的成膜性质和直染性，第四纪衍生品，亲和力增加剂，乳浊剂，pH值调节剂（例如三乙醇胺），推进剂，还原剂，螯合剂，褪色和/或增亮剂，皮肤调节剂（例如，润湿剂，包括混杂物和闭合剂），保湿剂，α羟基酸，β羟基酸，增湿剂，表皮水解酶，愈合和/或镇静剂，皮肤处理剂，抗皱剂，减少或处理眼袋的制剂，脱落剂，增稠剂，软化剂，凝胶化聚合物，维生素及它们的衍生物，湿润剂，剥皮剂，安慰剂，皮肤固化剂，木酚素，防腐剂（例如苯氧乙醇和对羟基苯甲酸脂类），抗UV剂，细胞毒素剂，抗赘生物剂，粘度改良剂，不挥发溶剂，珠光剂，抗排汗剂，脱毛剂，疫苗，香水，皮肤重组剂（例如，豨莶草提取物），赋形剂，装料，矿物质，抗真菌剂，抗过敏剂，H1或H2抗组胺药，抗刺激剂，免疫系统刺激剂，免疫系统抑制剂，驱昆虫剂，润滑剂，颜料或染料，定影剂，防腐剂，光稳定剂，以及它们的混合物，只要它们以物理或化学方式与组分的其它配料、尤其是本发明的活性成分兼容。

另外，这些附加配料的性质不应该改变本发明活性成分的好处达到不可接受的地步。这些附加配料可以是合成的或天然的，比如植物提取物，或者来自生物发酵过程。附加示例能在《CTFA化妆品配料手册》中找到。

此类附加活性成分/化合物能够从下面的组中选择：糖胺，氨基葡萄糖，D-氨基葡萄糖，N-乙酰基氨基葡萄糖，N-乙酰基-D-氨基葡萄糖，甘露糖胺，N-乙酰基甘露糖胺，氨基半乳糖，N-乙酰基氨基半乳糖，B3维生素及其衍生物，烟酰胺，去氢醋酸钠，去氢醋酸及其盐，植物甾醇，水杨酸化合物，去氧苯经妥，二烷酰基羟基脯氨酸化合物，大豆提取物和衍生物，牛尿酚，异黄酮，黄酮类似物，植烷三醇，法呢醇，香茅醇，没药醇，肽和它们的衍生物，二-、三-、四-、五-和六肽及它们的衍生物，KTTKS（SEQ标识号：4），PalKTTKS（SEQ标识号：2），肌肽，N-酰基氨基酸化合物，类维生素A，视黄基丙酸，松香油，棕榈酸视黄酯，视黄醇乙酸酯，视黄醛，视黄酸，水溶性维生素，抗坏血酸，维生素C，抗坏血酸基葡糖甙，抗坏血酸基软脂酸盐，镁抗坏血酸基磷酸盐，钠抗坏血酸基磷酸盐，维生素B和它们的衍生物，B1维生素，B2维生素，B6维生素，B12维生素，K维生素和衍生物，泛酸及其衍生物，泛酸醇乙基醚，泛酰醇和衍生物，泛醇，生物素，氨基酸和它们的盐及衍生物，水溶性氨基酸，天冬酰胺，丙氨酸，吲哚，谷氨酸，水不溶的维生素，A维生素，E维生素，维生素F，D维生素和单-、双-和三-类萜化合物，β-亚诺抗氧化剂，雪松醇和它们的衍生物，水不溶的氨基酸，酪氨酸，色胺，颗粒材料，二叔丁对甲酚，叔丁对甲氧酚，尿囊素，生育酚烟酸盐，生育酚，生育酚酯，pal-GHK（三胜肽），植物甾醇，羟酸，羟基乙酸，乳酸，乳糖酸，酮酸，丙酮酸，植酸，溶血磷脂酸，二苯乙烯，肉桂酸盐，白藜芦醇，呋喃甲基腺嘌呤，玉米素，二甲基氨基乙醇，天然肽，大豆肽，糖酸的盐类，Mn葡糖酸盐，Zn葡糖酸盐，吡啶酮乙醇胺盐，3,4,4'-三氯二苯脲，三氯二苯脲，Zn羟基吡啶硫酮，对苯二酚，曲酸，抗坏血酸，镁抗坏血酸基磷酸盐，抗坏血酸基葡糖甙，吡哆醇，芦荟，萜烯醇类，尿囊素，没药醇，甘草酸二钾，甘油酸，山梨醇酸，季戊四醇酸，吡咯烷酮酸和盐，二羟基丙酮，赤藓酮糖，甘油醛，酒石醛，丁香油，薄荷醇，樟脑，桉叶油，丁香酚，薄荷基乳酸，金缕梅精华，二十烯和乙烯基吡咯烷酮共聚物，碘丙基丁基氨基甲酸酯，多糖，基本脂肪酸，水杨酸盐，甘草次酸，类胡萝卜素，神经酰胺和假-神经酰胺，类脂络合物，一般处于天然来源状态的油品，比如牛油脂、杏仁油、野驴油、李油、棕榈油、依菁萃油，对苯二酚，HEPES，丙半胱氨酸，O-辛酰基-6-D-麦芽糖，甲基甘氨酸二醋酸的二钠盐，类固醇，比如薯蓣皂苷配基和DHEA的衍生物，DHEA或脱氢表雄甾酮和/或它们的前体或化学或生物衍生物，N-乙氧其羰基-4-对-氨基苯酚，蓝莓提取物，植物激素，酵母、“酵母菌属”酵母，藻类的提取物，大豆、羽扇豆、玉米和/或豌豆、阿尔维林及其盐类的提取物，尤其是柠檬酸阿尔维林，屠夫扫帚和马栗树的提取物，以及它们的混合物，金属蛋白酶抑制剂。

具体有用的更多皮肤护理和头发护理活性成分能在SEDERMA商业文献中找到，也请登录网站：www.sederma.fr.。

也会提及下列商业活性物质，例如：甜菜碱，甘油，Actimoist Bio2^TM（活性有机物），AquaCacteen^TM（Mibelle AG化妆品），Aquaphyline^TM（Silab），AquaregulK^TM（Solabia），Carciline^TM（Greentech），Codiavelane^TM（Biotech Marine），Dermaflux^TM（Arch Chemicals，Inc），Hydra'Flow^TM（Sochibo），Hydromoist L^TM（Symrise），RenovHyal^TM（Soliance），Seamoss^TM（Biotech Marine），Essenskin^TM（Sederma），Moist24^TM（Sederma），Argireline^TM（Lipotec公司乙酰基六肽-3的商品名），以名称Gatuline Expression^TM著名的千日菊酰胺或Acmella oleracea（金钮扣）的提取物，以名称Boswellin^TM著名的Boswellia serrata（鲍达乳香蟹）的提取物，Deepaline PVB^TM（Seppic），Syn-AKE^TM（Pentapharm），Ameliox^TM，Bioxilift^TM（Silab），Juvinity^TM（Sederma），Revidrat^TM（Sederma），或它们的混合物。（译注：本段中，带TM标记的是商品名称，后面括号中是其生产商名称。）

在能够与本发明提取物组合的其它植物提取物当中，尤其可以有提到的常青藤提取物，尤其是英国常青藤（常春藤），下列物质的提取物：柴胡黄连，银柴胡，山金车（Arnica Montana L，译注：括号中内容与前面名称相同），迷迭香（Rosmarinus officinalisN），金盏花（Calendula officinalis），鼠尾草（Salvia officinalis L），人参（Panaxginseng），银杏亨，圣约翰麦芽汁（Hyperycum Perforatum），屠夫扫帚（Ruscus aculeatusL），欧洲绣线菊属植物（Filipendula ulmaria L），大花Jarva茶（Orthosiphon StamincusBenth），藻类（Fucus Vesiculosus），桦树（Betula alba），绿茶，可乐豆（Cola Nipida），马栗树，竹子，积雪草，石南属植物，墨角藻，柳树，鼠耳草，七叶树，仓术，黄金洋甘菊，Armeniacea属的植物，Atractylodis Platicodon，Sinnomenum，牵牛子，千斤拔属，薄荷科植物，比如C.Forskohlii，C.blumei，C.esquirolii，C.scutellaroides，C.xanthantus和C，Barbatus（髯毛属），比如髯毛鞘蕊花的根提取物，Ballote的提取物，Guioa，Davallia（骨碎补属），Terminalia（榄仁树属），Barringtonia（玉蕊属），Trema（山黄麻属），antirobia，cecropia（蚁栖树属），argania（树叶多酚），dioscoreae（薯蓣属），比如山药或墨西哥菜，Ammi visnaga（阿米芹）的提取物，Siegesbeckia（豨莶属），尤其是豨莶草，Ericaceae（杜鹃花科）的植物提取物，尤其是欧洲越桔提取物（Vaccinium angustifollium）或Arctostaphylos uva ursi（熊果），aloe vera（芦荟），含甾醇类的植物（例如，植物甾醇），Manjistha（从茜草属植物中提取的，尤其是红根），以及Guggal（从没药属植物中提取的，尤其是穆库尔没药），柯拉子提取物，白花春黄菊，红三叶草提取物，卡瓦胡椒提取物（Kava Kava^TM，来自SEDERMA），Bacopamonieri（假马齿苋）提取物（Bacocalmine^TM，来自SEDERMA）和海鞭提取物，提取物来自光果甘草，桑葚，白千层属灌木（茶树），极叉开拉瑞阿，冬凌草，纤细裸藻，Fibraurea recisa Hirudinea，丛林高粱，向日葵提取物，绿花恩南蕃茄，Spermacocea属的Mitracarpe，Buchu barosma（南非香木布枯），散沫花，Adiantium Capillus-VenerisL.，白屈莱，丝瓜，日本桔（Citrus reticulata Blanco var.unshiu），茶树植物，白茅，黄花海罂粟，地中海柏木，多花黄精，罗锅底，欧洲接骨木，种豆科，百金花属，巨藻，透纳树叶，知母，毛马齿苋，啤酒花藤，咖啡树或Ilex Paraguariensis（巴拉圭茶）。本发明的组分可能包括肽，包括、但不限于，二-、三-、四-、五-和六-肽及它们的衍生物。根据具体体现，组分中附加肽的浓度范围是1x10^-7%到20%，最好是1x10^-6%到10%，特别首选的是1x10^-5%到5%重量比。

根据本发明，术语“肽”指的是含10氨基酸或以下的肽，它们的衍生物，异构体和与其它物种的络合物，比如金属离子（例如，铜、锌、锰、镁和其他）。术语“肽”同时包括天然肽和合成肽。它也指在自然界能发现的、和/或通过商业途径可获得的含肽组分。

此处使用的合适的二肽包括、但不限于：肌肽（β-AH），YR，VW，NF，DF，KT，KC，CK，KP，KK或TT。此处使用的合适的三肽包括、但不限于：RKR，HGG，GHK，GKH，GGH，GHG，KFK，GKH，KPK，KMOK，KMO2K或KAvaK。此处使用的合适的四肽包括、但不限于：RSRK（SEQ标识号：5），GQPR（SEQ标识号：6）或KTFK（SEQ标识号：7）。合适的五肽包括，但不限于：KTTKS（SEQ标识号：4）。合适的六肽包括，但不限于：GKTTKS（SEQ标识号：8），VGVAPG（SEQ标识号：9）。

此处使用的其它合适的肽包括，但不限于：肽的亲脂性衍生物，首选棕榈酰衍生物，以及前面提到的金属络合物（例如，三肽HGG的铜铬合物）。首选的二肽衍生物包括N-棕榈酰-β-Ala-His，N-乙酰基-Tyr-Arg-己癸烯酯（CALMOSENSINE^TM，来自Sederma公司）。首选的三肽衍生物包括N-棕榈酰-Gly-Lys-His，（Pal-GKH，来自Sederma），HGG的铜衍生物（Lamin^TM，来自Sigma），Lipospondin（N-Elaidoyl-KFK）及其存性置换的类似物，N-乙酰基-RKR-NH₂（肽CK+），N-Biot-GHK（来自Sederma），Pal-KMO₂K（Sederma）和它们的衍生物。根据本发明使用的合适的四肽衍生物包括，但不限于，N-棕榈酰-GQPR（SEQ标识号：3）（来自Sederma）。此处使用的合适的五肽衍生物包括，但不限于，N-棕榈酰-KTTKS（SEQ标识号：2）（可作为胞间质YL^TM获得，来自Sederma），具有X Met或Leu的N-棕榈酰-Tyr-Gly-Gly-Phe-X（SEQ标识号：10），或它们的混合物。此处使用的合适的六肽衍生物包括，但不限于，N-棕榈酰-VGVAPG（SEQ标识号：1）及它们的衍生物。也能涉及Pal-GHK和Pal-GQPR（SEQ标识号：3）（Matrixyl^TM3000，Sederma）的混合物。

商业上可获得的含三肽或衍生物的首选组分包括生物肽-CL^TM，Maxilip^TM，Biobustyl^TM和MATRIXYL^TM，synthe’6^TM（生产商为Sederma）。商业上可获得的四肽首选来源的组分包括RIGIN^TM，EYELISS^TM，MATRIXYL^TMRELOADED和MATRIXYL3000^TM；它们含有50到500ppm的棕榈酰-GQPR（SEQ标识号：3）和载体，这是由Sederma公司提出的。

能够涉及下列市场上销售的肽，以及附加活性成分：Vialox^TM，Syn-ake^TM或Syn-Coll^TM（Pentapharm），Hydroxyprolisilane CN^TM（Exsymol），Argireline^TM，Leuphasyl^TM，Aldenine^TM，Trylgen^TM，Eyeseryl^TM，Serilesine^TM或Decorinyl^TM（Lipotec），Collaxyl^TM或Quintescine^TM（Vincience），BONT-L-肽^TM（lnfinitec Activos），Cytokinol^TMLS（Laboratoires Serobiologiques/Cognis），Kollaren^TM，IP2000^TM或Meliprene^TM（lnstitutEuropéen de Biologie Cellulaire），Neutrazen^TM（Innovations），ECM-Protect^TM（AtriumInnovations），Timp-肽^TM或ECM Moduline^TM（lnfinitec Activos）。（译注：本段中，带TM标记的是商品名称，后面括号中是其生产商名称。）

化妆品处理方法

本发明也涉及化妆品处理方法，其目的是改善皮肤的整体条件；包括在皮肤和/或附器上局部应用有效数量的上文提到的球花属提取物。

本发明的球花属提取物可以局部运用于下列区域：脸、嘴唇、脖子、颈线、手、脚或身体。本发明的主要优点之一表现在这样的能力：无论何时必要时或希望时，能够通过这种局部的、非侵略性方法施加局部选择性的“轻柔”处理。对于防皱运用，例如，它可以使用注射器或微套管非常局部地运用。

不过，也可以考虑将含有本发明提取物的组分实施皮下注射。

根据其它具体特点，根据本发明的化妆品处理方法能够组合一种或多种以皮肤为目标的处理方法，比如照射治疗、加热或芳香疗法处理。

根据本发明，可以提出具有若干隔间或套件的装置来运用上面描述的方法；它们可以包括，例如，但不限于，第一个隔间中放置含有球花属提取物的组分，第二个隔间中放置含另一种活性成分和/或赋形剂的组分。在此情况下，装在所述第一和第二个隔间中的组分可以考虑成是组合组分；供及时同步、单独或分阶段使用，尤其是在上面提到的处理方法之一中。

本发明的处理方法尤其适用于，通过刺激解毒反应和/或通过毒物刺激类响应的细胞再生、防止和/或处理皮肤老化，尤其是用于改善皮肤的光亮度和/或透明度，用于预防和/或处理过敏和/或反应性皮肤，用于预防和/或处理发红和/或预防蛋白质的糖化。

本发明的处理方法也特别适用于增加和/或维持皮肤干细胞的数量，和/或增加和/或维持表皮大分子，尤其是胶原蛋白和弹性蛋白，和/或从而用于增大真皮的体积（重新丰满），和/或用于预防和/或处理细线和皱纹，和/或用于让皮肤定形，和/或用于预防脱发和/或刺激头发再生。

A)通过心叶球花的未分化细胞培养，获得本发明植物源提取物的示例

1)细胞株的创建

心叶球花植物是从种子获得的。

收集叶子，随后清理和用水漂洗，去除污染，再次漂洗。

a)引入未分化细胞或愈伤组织的步骤

叶片被切割，放在营养琼脂的表面；它含有可同化的碳源，微量和常量元素的溶液，以及适应的荷尔蒙与维生素的组合。利益于它的组分，这种营养培养基将在叶子的愈合部位上触发未分化细胞束的生产，我们称之为愈伤组织。

使用的固体营养培养基的组分（根据Gamborg）：常量元素和微量元素、蔗糖、琼脂植物、植物激素和维生素的溶液。

pH值调节到5,5和6之间。

以后，这个培养基将被称为“基本培养基”。这个引入步骤持续1到4个月。培养在25°C的黑暗条件下进行。

b)琼脂培养基中培养物的稳定化和选择步骤。

每隔3个星期，在新鲜培养基上进行了后续移植后，获得愈伤组织稳定化。利益于它们的表型特征（颜色，易碎性，增殖），从而获得稳定并均匀的培养物。

从早期开始的数十个当中，选择最好的愈伤组织培养物用于液体培养基中的转移。选择的系的特征是：高生长率，柔软和易碎的质地，均匀的颜色，在液体培养基中的良好分散性，以及这些参数在传代培养期间的稳定性。

这个步骤持续6个月到1年。

c)液体培养基中的转移和二次代谢物生产的优化

选择的系在液体培养基中转移，目的是在初始阶段优化它们的生长参数。

通过定期测量培养细胞占据的体积百分比、也称为“细胞压积”（PCV），评价不同阶段（潜伏状态，指数生长阶段，固定生长阶段）的细胞生长和增值。

来自愈伤组织的不同悬浮液被放在定轨摇晃器上，以110rpm的转速、在时间中25°C条件下搅拌（在各自装有100ml培养基和10克均匀质地、颜色和生长愈伤组织的三角烧瓶中）。测试并比较若干培养基和激素组合，以便优化生长曲线。也尝试优化接种体的初始密度，以缩短滞后阶段，从而减小培养的整个持续时间。

另外，选择的接种体的初始密度对应于10%的PCV。

下一个步骤是确定最佳环境条件，以便在培养的生长阶段结束时，朝着生产二次代谢物的方向引导细胞的新陈代谢。这些二次代谢物和提取物培养基的其它组分一起，将参与在结束时获得的提取物的活性。

这样，在培养基中，识别出高比例的极性分子，包括糖、氨基酸、一次代谢物、肉桂酸和咖啡衍生物，以及苯乙醇糖苷的混合物。选择苯乙醇糖苷作为二次代谢物生物体量生产的指示剂；它们总剂量能通过Arnow的方法容易地实现。这是一种分光光度计法，基于通过亚硝酸钠和钼酸钠，让全部多酚在碱性培养基中氧化（在510nm波长处的读数）。假设培养基中存在其它类别的分子，比如类黄酮或环烯醚萜，但不能识别。显然，所有这些分子都将负责最终提取物的活性。

然后，将根据本发明选择的用于引导二次代谢物生产的引导剂放在缺乏蔗糖和常量营养素的培养基的细胞中，最好是以相同比例。

液体培养基中的这个转移阶段、以及生长和生产的参数优化能持续6个月到1年。

这个步骤之后，将选择能给出最佳结果的系。

它被交付给DSMZ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkuturenGmbH），位于参考号DSM25009之下。

本发明涵盖了从编号DSM25009之下记录的细胞株中获得的心叶球花物种的提取物。

2)提取物获得

a)生物反应器中预培养物的生产

实现了细胞株的连续预培养；选择量为1升，接着是5升，接着是25升，最后是100升。各自都在10%PCV中种植，然后长到50%的PCV。这样生产的细胞生物体量用于接种较大规格的培养。这个阶段能持续1到3个月。

b)转移到生物反应器，包括激发阶段

然后，在5到20%PVC之间。种植一次性使用的袋式生物反应器（600升总容积，300升总培养容积）。

生物反应器特别配备了：

-摇臂系统，用于细胞搅拌和充氧，也用于培养温度调节；这是特别选择的，因为与常规生物反应器的剪切相比，它在植物细胞的易碎性方向更加适合；

-配备不同传感器（氧，pH和温度）的控制塔，用于培养步骤的跟踪和调节；

-用于细胞培养的一次性无菌袋，配备不同传感器（pH，氧）；用于取样或接种无菌流体的气体供应和交换系统的过滤器。

在生物反应器中培养10-15天后，培养达到大约30到45%的PCV。然后添加缺乏的培养基，以触发二次代谢物的生产，这里包括苯乙醇糖苷。新鲜培养基的添加量是10到50%的最终培养体积。3-5天后，培养停止于35-50%的PCV，这时培养物中的苯乙醇糖苷大约是每升2克。

生物反应器的这个阶段总共持续2到3个星期。

c)提取物的回收

这个后续步骤的目的是，生产水性和澄清的提取物。

实现细胞溶菌，导致在液相中释放二次代谢物。这个溶菌通过酸化来进行。然后进行级联过滤；首先是深入的，随后是无菌过滤，以获得本发明的水性提取物。这个步骤旨在让提取物稳定。

以这种植物细胞培养方法获得的提取物是透明的，无色到淡黄色，与“经典”植物提取物的亮黄色截然不同。对于化妆品配料或其它当中提取物的直接后续配制，这是一个优点。

这个过程有变体存在，包括：

1）对于感兴趣分子的提取：

-细胞溶菌步骤能通过生物体热处理来执行，例如通过将蒸汽注入生物体内。它也能通过将细胞与微珠一起研磨来进行。

-在细胞溶菌步骤后，可以提纯原始提取物，以增大其中感兴趣分子的浓度。据此，首先通过过滤或离心分离取出生物体。接着，让获得的澄清液相与专门针对它与感兴趣分子的亲和性而选择的吸附树脂接触。然后，将这些树脂装入玻璃色谱柱。利用合适的混合物洗提树脂，产品的洗出物被浓缩。

-根据本发明的提取物的回收能使用脂质体来实施。

2）关于感兴趣分子的激发模式：

感兴趣化合物的激发也能通过下列方式完成：向培养物中添加微生物馏分；添加生物起源的分子，比如，壳聚糖、茉莉酸酸甲酯、茉莉酸、水杨酸；添加非生物起源的分子，比如多效唑；给培养运用不同的温度，不同的pH值，和/或通过非代谢糖诱导的渗透应力，比如甘露醇；使用常量元素和糖更加激烈的贫化环境；向培养物中添加吸附树脂。除了激发感兴趣化合物的生产以外，树脂还能捕捉它们。

3）对于细胞株创建阶段的替代，也能使用已经根据本发明制备并保存的细胞株。在此情况下，创建细胞株的步骤被取代。而是变成一个常规步骤，从琼脂和液体培养基中首先存在的所述细胞株进行未分化植物细胞的放大。

本发明方法也能利用球花属的其它物种来实现。

B)实现本发明的组分的配方示例；它是一种“活性成分”，化妆品工业的原材料

活性成分是含有心叶球花植物源提取物的化妆品组分，溶解在从皮肤学上可以接受的培养基或胞间质中。这种活性成分打算用于化妆品工业，用于制备化妆品，比如霜剂、凝胶等（参见下面给出的草本制剂示例）。

在上述示例A）中获得的水性提取物可能更好是以20到80%的比例混合任何亲水的胞间质，作为凝胶、水性缓冲剂、甘油或生理上可以接受的其它短链多元醇。

例如，也为了实现研究和下文展示的草本制剂，最选使用不超过33%的提取物。

当然，没有赋形剂的纯提取物也能用作活性成分。

C)离体和ex-vivo（还愿物）研究

申请人已经展示了下面展示的球花属提取物的多个明显化妆品效应。

按照上面的示例B）制备的不超过33%的水性提取物进行离体试验，显示了各种化妆品活性，涉及皮肤生理学的若干区域。这些试验全部是利用2%的此类心叶球花提取物进行的。

对比试验

首先，与整个植物的水醇提取物相比，通过细胞培养获得的提取物已经显示出优越性。这些第一批试验的执行方法是，将两种物质进行比较。一种是按照上面的示例B）制备的水性提取物，不超过33%，稀释到2%；另一种是整个植物的水醇提取物。在苯乙醇糖苷中处于相当的浓度。

1)BSA的非酶糖化

这个样品试验以离体形式再现了常规皮肤蛋白质承受的应力：通过非酶糖化现象造成的它们功能改变。

使用的研究模型是牛血清清蛋白（BSA）；它与生理还原糖（即果糖）接触，给出两个分子之间的自发的和缓慢的反应。此反应能通过温度来加速。在本试验中，BSA和果糖在没或没有试验产品存在的条件下培养，温度50°C，持续7天。糖化最终产物具有天然荧光，能使用荧光计（λex=360nm和λem=460nm）来量化。

使用0.03%的氨基胍作为糖化抑制的正对照物。

数据在下面的表1中给出。

表1：

糖化抑制	%变化，相对于对照物
		心叶球花水醇植物提取物	+8%（dns*）
心叶球花细胞培养提取物	-64%（p<0.01）

*：dns=无意义数据

相对于对照物，正对照物具有的糖化抑制是-85%。

2)DPPH抗自由基试验

DPPH（1,1-二苯基-2-苦基偕腙肼）是一种稳定的自由基；它广泛用于自由基清除剂的探测。通过丧失其自由基特征，这个分子转化成DPPH2（1,1-二苯基-2-苦基联氨）。这个转换是通过褪色（紫→黄）而实现的；这能利用517nm波长下的分光光度法持续地监视。

没有抗自由基活性的对照物保持恒定的DO。使用0003%的咖啡酸作为抗自由基活性的正对照物。数据在下面的表2中给出。

表2：

抗自由基活性	%变化，相对于对照物
		心叶球花水醇植物提取物	-1%（dns）
心叶球花细胞培养提取物	+53%（p<0.01）

相对于对照物，正对照物具有-85%的抗自由基活性。

3)抗单态氧试验

作为呼吸链终端电子的接受体，分子氧（O₂）扮演一个重要角色。不过，这种新陈代谢和其它、以及外部因素，比如UV照射，能导致尤其活跃的某些衍生物的发生（单态氧，羟基自由基，过氧离子）；即使在健康人体中，它也能导致对脂类、蛋白质和核酸的氧化性损坏。单态氧是氧气的这些非常有能量和高度活跃形式之一。利用染料和UVA光子或可见光，可能以离体实验的形式产生单态氧。后面展示的试验使用玫瑰红（一种染料）和可见光。

本试验的目的是，评价在可见光作用下由玫瑰红形成的单态氧对尿酸的降级。通过跟踪尿酸在292nm波长下的破坏，获得对单态氧生成的直观化。在有能够中和单态氧的化合物存在时，这种破坏将是缓慢的。

使用0002%的咖啡酸作为抗单态氧活性的正对照物。

数据在下面的表3中给出。

表3：

抗单态氧活性	%变化，相对于对照物
		心叶球花水醇植物提取物	+14%（dns）
心叶球花细胞培养提取物	+33%（p<0.01）

相对于控制器，正对照物具有+73%的抗单态氧活性。

这三个试验显示了通过细胞培养获得的球花属提取物在化妆品方面的意义；与从植物获得的水醇提取物相比，它也具有高得多的效率。

对心叶球花细胞培养提取物的研究

这些研究的执行是利用按照上面的示例B）制备的水性提取物，不超过33%，稀释到2%。

面对机械和氧化双重应力，本发明提取物对培养物中角质化细胞的保护

在培养基中，将合流的角质化细胞层放置成接触（试验）或不接触（对照）2%的本发明提取物，持续24小时。接着，以一种可再现的方式将这些层“弄伤”；在暴露到UVB之后，立即评价它们抵抗皮肤通常遭受的两种应力的能力。然后，通过图像分析，通过量化没有细胞的表面，评估细胞层的恢复情况（结果在下面的表4中给出）。

目测观察表明，控制层经历了它们完整性的深刻变化（具有某些细胞死亡），而且非常难以再度移植受伤表面。与之相反，与心叶球花植物细胞提取物接触的层则变化较少，较快地重新构成一个紧密和均匀的层。

这个预备试验充当展示了球花属提取物存在时具有毒物刺激现象。据推测，在施加应力之前，与提取物预先接触的细胞导致建立了多条防线，包括抗氧化剂，然后细胞使用它们来抵抗应力的有害影响，并再生正常细胞层。

通过研究下列三个截然不同的轴（4-6），心叶球花提取物的这种毒物刺激效应已经得到离体展示和量化。

4-表皮原粒子的保存

原理

表皮是持续再生的，以便产生有效的皮肤阻挡层。

这种效果随着年龄而下降。这个过程开始时的细胞被称为干细胞或原粒子细胞。它们的数量很少；但利益于将它们与周围环境相联系的分子链的质量，使它们保持了再生的潜力。

有害处理（比如氧化剂）会改变这些细胞的环境，使得它们进化成不同的表型，导致它们后续增殖能力的改变。在已经丧失了它们增殖能力的In vitro（活体外），这些细胞形成小的菌落；作为在相当大的这些菌落中的子细胞，可能用肉眼看不到它们。与之相反，原粒子细胞能广泛地增殖，以便再生皮肤，并利用较小的细胞产生较大的菌落。通过克隆功效法，测量这种再生潜力，从而也就是培养物中的原粒子细胞密度。这种方法涉及，在种植了低密度的细胞、并培养了规定的时间后，数出肉眼能看到的菌落的数量。获得的数量被用作初始细胞群体的原粒子活力的尺度。

在心叶球花提取物存在或不存在的条件下，将合流的人类表皮原粒子角质化细胞放置成与最佳培养基接触，以迫使它们转化成可区分的角质化细胞（从而使它们丧失其原本表型）。接触之后，将两个系列的细胞以1000个细胞/25cm2（n=5）的浓度重新种植到区分培养基中。

结果

在培养了12天后，在固定和染色后，测量菌落的数量和大小。结果表明，对照案例给出5.4±1.5菌落/1000种植细胞；菌落在尺寸小。在平行试验中，与心叶球花提取物接触的细胞给出比对照物多2.3倍的菌落（12.6菌落±4.3菌落/1000种植细胞；是对照物的+133%；p<0.01）；而且菌落尺寸较大。

这显示，心叶球花提取物能防止原粒子细胞转化到不同的阶段，从而维持它们的增殖能力。据此，它保存了自身再生的表皮能力。

5-高能电位的刺激

a.去乙酰化酶-1

毒物刺激效应（比如卡路里限制或接触毒物刺激分子）能增加去乙酰化酶酶和不同有机体的平均寿命期。去乙酰化酶尤其能作用于FOXO因素脱乙酰作用，防止触发凋亡蛋白质的生产。去乙酰化酶也刺激细胞的抗氧化剂防御和提纯机理（解毒），并帮助保存线粒体功能，从而保存能量生产。这提高了成活率和对应的抵抗力。

在心叶球花提取物存在或不存在的条件下，将人类角质化细胞培养6天；然后研磨，使用ELISA方法测量去乙酰化酶-1的细胞内水平。通过总蛋白质（BCA）的平行测量，实现结果的标准化。结果在下面的表5中给出。

500μm时的正对照物水溶性维生素E：+27%；p<0.05。

平行地，腹部皮肤外植体（58岁女性）接受6天每天一次的含本发明的心叶球花提取物或其安慰剂（还原物试验）的乳剂局部应用。

这种处理后，外植体被准备，并利用荧光抗体标记，以量化去乙酰化酶-1。这种量化使用摄影（50张照片/每个案例）之后的图像分析系统。结果在下面的表6中给出。

b.肌酸激酶

肌酸激酶是一种普遍存在的酶；它以两种异构形式存在于皮肤中。它用于在细胞中储存能量，使得组织能够响应紧急能量要求。这种酶使用ATP将肌酸转化成磷酸肌酸；而ATP则被转化回ADP。必要时，酶反向工作，返回到能量。其活性随着年龄而下降，因为它是反应性氧基团的首选目标之一。因此，我们希望能够维持和增高这种酶的活性。

将人类皮肤成纤维细胞放置成与本发明的心叶球花提取物接触3天。接着，在没有所述提取物的情况下，将细胞暴露到氧化应力（过氧化氢）。在与心叶球花提取物的另外3天接触后，细胞再次暴露到相同的氧化应力；然后被均匀化，以测量残余的细胞内肌酸激酶活性。活性的测量是根据从磷酸肌酸生成的ATP及ADP。接着，根据能导致NADPH形成的酶反应，在340nm时获得读数，测量ATP。通过测量总蛋白质（BCA），实现结果的标准化。结果在下面的表7中给出。

500μm时的正对照物水溶性维生素E：+28%；p<0.05。

将已经用于去乙酰化酶-1的外植体利用荧光抗体标记，以评价线粒体表皮肌酸激酶的数量。这种量化使用摄影（50张照片/每个案例）之后的图像分析系统。结果在下面的表8中给出。

c.线粒体薄膜电位

线粒体是反应性氧基团形成中涉及的一个主要部位；随着时间的推移，它能干扰呼吸链的功能。这导致线粒体薄膜电位（ΔΨ）的下降，造成ATP生产减少。

这个薄膜电位的下降是老化和细胞死亡的警告标志；因此，必须维持这个电位，以保存线粒体生产ATP的能力。

使用对线粒体质子微小变化敏感的特定标签，来测量薄膜电位。标签以两种形式存在，单体的和聚合的；它们具有不同的发射光谱。高薄膜电位有利于聚合形式。单体/聚合物比例（520nm/590nm）的增大从而能导致ΔΨ的减小。

因此，与低比例相比，高比例不利于细胞存活。

使用与上面肌酸激酶中使用的相同成纤维细胞培养。结果在下面的表9中给出。

500μm时的正对照物水溶性维生素E：+36%；p<0.05。

（*）%变化=100x[（对照物–心叶球花提取物/对照物]

因此，利用本发明的心叶球花提取物，能非常明显地改善薄膜电位（+40%，p<0.01）。

此项研究补充了展示本发明心叶球花提取物抗老化保护能力的以前两项研究。它自发地刺激去乙酰化酶-1的数量。它维持肌酸激酶的活性，保护作为对气体应力响应的ATP的生产。

6-抗击有害产物

a.内源过氧化物

传统上用来评价细胞群体活力的指示剂之一是氧化应力的水平。

使用称为DCFH-DA的探头，能可靠地测量这个因素；其特征是，一旦它进入细胞，与过氧化物接触时就会发出荧光。

协议

将合流人类角质化细胞放置成接触或不接触（负对照物）心叶球花提取物达24小时，直到它们长到合流。接着，将细胞暴露到缓冲剂中的DCFH标签，并使之新陈代谢。接着，标签能与两种细胞内过氧化物反应。接着，将培养基换成含有或不含心叶球花提取物的培养基，以及氧化剂模型过氧化氢（培养基或心叶球花提取物都不能与直接与H₂O₂反应）。读取荧光，目的是估计已经与标签反应的细胞内过氧化物的水平。使用核标记法（烟酸己可碱33258）来量化细胞的数量。结果在下面的表10中给出。

AFU：任意荧光单位；500μm时的正对照物水溶性维生素E：-91%；（p<0.01）。

根据过氧化氢诱导的过氧化物的上升，根据本发明的心叶球花提取物能保护细胞内的内容。这个结果反映了在心叶球花提取物存在时由氧化应力之后的自由基或反应性氧物种生成的损坏的减少。

b.SOD和过氧化氢酶

我们身体产生的抗氧化剂酶（比如过氧化氢酶或SOD）、以及从我们血液中抽取的抗氧化剂、维生素E和C、类胡萝卜素等有助于抵抗自由基和反应性气体物种的有害影响。因此，通过刺激它们的合成来增加它们的数量是我们很感兴趣的。

关于抗氧化剂皮肤电位的预备试验已经表明，与心叶球花提取物存在时的负对照物相比，利用氧化应力模型（即过氧化氢）处理过的人类角质化细胞将它们SOD（超氧化物歧化酶）的细胞内活性提高了22%*（p<0.01）。

*正对照物水溶性维生素E at0.012%：SOD21%；p<0.01.

此外，腹部皮肤外植体（58岁女性）接受6天每天一次的含本发明的心叶球花提取物或其安慰剂的乳剂局部应用。

在这种处理结束时，外植体被准备；一方面利用抗SOD荧光抗体标记，或者另一方面用抗过氧化氢酶进行标记。这种量化使用摄影（50张照片/每个案例）之后的图像分析系统。结果在下面的表11和12中给出。

因此，心叶球花能刺激SOD和过氧化氢酶生产，与任何应力无关。在毒物刺激作用中发现的这些“自发的”刺激使得皮肤能够准备合适的防御，抵抗以后可能发生的应力。

c.蛋白酶体和糖化

在老化期间，被糖化、氧化（羰基化的蛋白质）损坏的蛋白质、或者与脂类过氧化物接合的蛋白质倾向于在细胞中积累。蛋白酶体定期将它们除去，从而减小它们对细胞内环境稳定性的有害影响。不过，蛋白酶体的活性会通过这些积累、以及通过脂褐素（脂蛋白废品）的及时积累而减小，导致被恶性循环损坏的蛋白质的数量进一步增大。

维持蛋白酶体的活性是毒物刺激作用有利的后果之一，因为它能补充细胞抗老化防御物质。它帮助除去在细胞中积累的废物，导致生产使细胞变得不透明的前炎性物质。

将人类皮肤成纤维细胞放置成接触或不接触（负对照物）心叶球花提取物，直到它们长到合流。接着，将心叶球花提取物除去，让细胞暴露到氧化剂模型过氧化氢，以产生加速老化。在这个阶段后，细胞再次暴露到心叶球花提取物3天，然后重新种植，并接受进一步的氧化应力，以放大初始应力的影响。

接着，将细胞均匀化；通过监视模型荧光肽的开裂，测量残余的蛋白酶体活性。通过蛋白质的平行测量，实现结果的标准化。结果在下面的表13中给出。

AFU：任意荧光单位；500μm时的正对照物水溶性维生素E：+24%；（p<0.05）。

我们研究了心叶球花提取物的抗糖化效果；需要使用蛋白质模型、BSA和天然还原糖（果糖）；它能以非酶的形式与蛋白质起糖化反应，即结合。这种结合的产物能发出荧光，可利用记录系统监视。结果在下面的表14中给出。

处于0.03%的正对照物氨基胍：-85%；p<0.01。

d）谷胱甘肽

除了其著名的抗氧化剂角色以外，谷胱甘肽是身体的最重要的解毒元素，以及身体良好健康的主要执行者。它能结合毒素，比如重金属、溶剂和农药，将它们转化成水溶性化合物，从而能够容易地在胆汗或尿液中清除。

与未接收提取物的负对照物相比，在心叶球花细胞培养提取物存在的条件下：+49%*（p<0.01），角质化细胞中的谷胱甘肽合成是自发地刺激的。

*0.012%时正对照物水溶性维生素E：GSH：53%（p<0.01）。

本发明提取物的毒物刺激类型效应（“毒物刺激作用-类似的”）已经得到这样的显示，尤其是在3个方向上：

-分子和代谢物路径的直接增强；这使得细胞对以后的应力具有更好的响应性（去乙酰化酶，SOD，过氧化氢酶，谷胱甘肽）；

-通过直接保护细胞的能量电位和它抵抗氧化应力的完整性（肌酸激酶，线粒体电位，蛋白酶体，过氧化物或糖化蛋白质的水平）；以及

-通过维持皮肤再生能力，促进原本表型，从而增殖负责此功能的细胞。

皮肤干细胞上的研究

进行这些研究时，利用根据上面的示例B）制备的水性提取物，不超过33%，稀释到1%、

2%或3%。

作为研究模型，使用来自滤泡皮肤乳突的皮肤干细胞（HFDPC）。在心叶球花提取物（n=43滴/箱）存在或不存在的条件下，对它们实施滴种，以进行“悬滴”型培养。

已经研究了通过成球性和特定标记物、巢蛋白和SOX2，维持皮肤乳突中干细胞的表型。

成球性

细胞成为三维球体的能力是皮肤干细胞表型的一个特征。丧失这个表型意味着这些细胞的变异，以及茎特点的缺乏。当培养显示出比另一个对照物的球体数量大出很多时，

意味着它富含皮肤干细胞。

将细胞保留在与提取物接触，持续球体形成所需的时间。在球体附着后，数出它们的数量。结果在下面的表15中给出。

表15：

n=9张照片/箱，在n=3箱上

与未处理的对照物相比，在心叶球花提取物存在的条件下，观察到了球体数量的明显增加。

特定标记

作为干细胞的特定标记物，执行并评估SOX2和巢蛋白表达的免疫标记。结果在下面的表16和17中给出。

表16：

n=15张照片/箱，在n=3箱上

表17：

n=15张照片/箱，在n=3箱上

上面的结果表明，与未处理的细胞相比，在利用心叶球花提取物处理后，茎表型得到维

持或保护。

D)草本制剂

根据本发明的活性成分：含有根据本发明心叶球花水性提取物的配方（正如上述示例B中披露，处于33%）。

下面将描述不同有或没有附加化妆品活性成分的不同配方；没有活性成分的配方的作用是，根据具体情况，支持和/或补充本发明活性成分的活性。这些配料可以是任何类型，取决于它们的功能、应用部位（身体，面部，颈部，胸部，手部等）、希望的最终效果和目标消费者；比如抗老化，抗皱，增湿，眼圈和/或眼袋，定形，亮化，抗糖，抗色斑，瘦体，安慰，肌肉松驰剂，抗发红，抗妊娠纹等。

示例1：用于面部的日霜形式

步骤：称取A相，在不搅拌的情况下让它膨胀30分钟。在水浴中，将A相加热到75°C。称取并混合B相。称取C相，在水浴中加热到75°C。将B相加入A相。充分混合。在搅拌条件下，将C相加入（A+B）相。混合均匀。即时添加D相。添加E相，混合均匀。添加F相，彻底混合。

示例2：用于面部的凝胶形式

步骤：在搅拌条件下分散A相。将Ultrez10撒到水中，静置30分钟。加热C相，直到它完全溶解。混合A相与B相。将C相加入（B+A）相。在搅拌之下将D相加入（A+B+C）相。添加E相。利用F相中和。添加G相并混合。

附加配料的示例：根据它们的浓度和预期效果，按照它们在特定百分比时的憎水或亲水的物理性质，下列物质能够以相之一的形式、或者即时地添加到凝胶型配方中：

RIGIN ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2000/433417）名称销售的活性成分，能改善皮肤的弹性和稳固性，增加水合作用并使皮肤光滑。例如，可以将3%（重量）的这种配料添加到G相的配方中。

RENOVAGE ^TM ：通用抗老化活性成分，在市场上SEDERMA（WO2006/020646）名称销售。例如，可以将3%（重量）的这种配料添加到D相的配方中。

LUMISKIN ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2004/024695）名称销售的活性成分，它能使面色增亮。例如，可以将3%（重量）的这种配料添加到D相的配方中。

SUBLISKIN ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2009/055663）名称销售的活性成分；它不仅能使皮肤增湿和光滑，还允许它抵抗外部攻击行为。例如，可以将3%（重量）的这种配料添加到G相的配方中。

MATRIXYL3000 ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2005/048968）名称销售的抗皱肽基活性成分；它有助于修理老化造成的皮肤损坏。例如，可以将3%（重量）的这种配料添加到G相的配方中。

示例3：用于面部的晚霜形式

步骤：称取A相，让它膨胀30分钟。然后，在水浴中将A相加热到75°C；加热B相，直到溶解。将B相加入A相。在水浴中将C相加热到75°C。在搅拌条件下，将C相加入（A+B）相。添加D相，混合均匀。在55°C左右，利用E相中和。添加F相，然后是G相，混合均匀。

附加配料的示例：根据它们的浓度和预期效果，按照它们在特定百分比时的憎水或亲水的物理性质，下列物质能够以相之一的形式、或者即时地添加到乳剂型配方中：

DERMAXYL ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2004/101609）名称销售的抗老化活性成分；它能弄平皱纹和修理皮肤阻挡层。例如，在马上就要使用之前，可以将3%（重量）的此配料添加到（A+B+C）相中。

烟酰胺（维生素B3），松香油，白藜芦醇，DHEA：抗老化配料，包括抗皱纹。例如，可以将0.5%（重量）的松香油、白藜芦醇或DHEA即时添加到（A+B+C）相中。例如，能够将10wt%的烟酰胺（在水中浓度10%）添加到G相中。

去氧苯经妥：抗菌活性成分；能够以0.5%（重量）添加到G相配方中。

CHRONODYN ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2006/075311）名称销售的活性成分；它能对皮肤进行调色和定型，擦除可见的疲劳迹象。例如，可以将3%的此配料添加G相。

VENUCEANE ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2002/066668）名称销售的活性成分；它能防止光老化的可见迹象（色班，皱纹，干燥性等），保护细胞结构、防止遭受UV损坏，并增强皮肤完整性。例如，可以将3%的此配料添加G相。

示例4：用于身体的乳剂形式

步骤：称取A相，让它膨胀30分钟。然后，在水浴中将A相加热到75°C；加热B相，直到溶解。将B相加入A相。在水浴中将C相加热到75°C。在搅拌条件下，将C相加入（A+B）相。添加D相，混合均匀。在55°C左右，利用E相中和。添加F相，然后是G相，混合均匀。

附加配料的示例：根据它们的浓度和预期效果，按照它们在特定百分比时的憎水或亲水的物理性质，下列物质能够以相之一的形式、或者即时地添加到乳剂型配方中：

JUVINITY ^TM ：市场上以SEDERMA名称销售的活性成分；它能减少面部的老化迹象和颈线，弄平皱纹，密化和重建真皮。例如，可以将2%的此配料即时添加到（A+B+C）相中。

生育酚或维生素E：具有抗自由基和抗氧化剂性质的活性成分。

O.D.A.white ^TM ：市场上以SEDERMA（WO1994/07837）名称销售的活性成分；通过减少黑色素合成，它能亮化皮肤。例如，可以将1%的此配料即时添加到（A+B+C）相中。

生育酚（维生素E）或α-硫辛酸（ALA）：具有抗氧化剂和抗自由基性质的活性成分。例如，可以将0.5%（重量）的本配料添加到（A+B+C）相中。

Bio-Bustyl ^TM ：市场上以SEDERMA名称销售的活性成分，基于肽和细菌滤液；具有胸围稳固性和弹性的全面作用。例如，可以将3%的本配料添加到G相。

示例5：浆液形式

步骤：A相：将卡波姆撒到水中，让它膨胀15分钟。混合B相。将B相倒入A相，混合均匀。称取C相，混合，并在搅拌条件下加入（A+B）相。膨胀1小时。在搅拌条件下，向前一相中即时添加D相。利用E相中和。放置于搅拌之下。然后添加F相。允许在搅拌条件下混合至少一小时，然后添加G相。混合均匀。

附加配料的示例：根据它们的浓度和预期效果，按照它们在特定百分比时的憎水或亲水的物理性质，下列物质能够以相之一的形式、或者即时地添加到浆液型配方中：

LUMISHERE ^{T M} ：市场上以SEDERMA（WO04/024695）名称销售的活性成分。它是封装在聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊中的二乙酰基波尔定（DAB）和用锰改良的二氧化钛（TiO₂Mn）的组合。TiO₂Mn能给予皮肤均匀、净化和发光的效果；而DAB能提供生理阶段光亮效果。例如，可以将4%的本配料添加配方的F相中。

REVIDRAT ^TM ：市场上以SEDERMA名称销售的活性成分；它尤其能改善表皮的凝聚性及其水合作用。例如，可以将2%的本配料添加到配方的C相中。

EVERMAT ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2007/029187）名称销售的活性成分；它能减少皮脂的分泌，从而参与油性皮肤的处理。例如，可以将4%的本配料添加到配方的F相中。

HALOXYL ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2005/102266）名称销售的活性成分；它能通过减少黑眼圈而改善眼的轮廓。例如，可以将3%的本配料添加到配方的F相中。

示例6：洗液形式

步骤：称取A相。称取B相，混合。在搅拌条件下，将B相加入A相，持续30分钟。称取C相，混合，直到获得均匀的混合物。在搅拌条件下将C相加入A+B相。将D相加入前一相中。仍然在搅拌条件下，添加E相；混合均匀。称取F相，混合，并添加到前一相中，彻底混合。

附加配料的示例：根据它们的浓度和预期效果，按照它们在特定百分比时的憎水或亲水的物理性质，下列物质能够以相之一的形式、或者即时地添加到洗液型配方中：

EYELISS ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2003/068141）名称销售的活性成分；它有助于防止和抵抗眼袋的出现。例如，可以将3%的本配料添加到配方的E相。

Ac-Net ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2003/02828692）名称销售的活性成分；它能为油性和易起痤疮的皮肤提供完整处理。例如，可以将3%的本配料添加到配方的E相。

EVERMAT ^TM ：如上所述。例如，可以将4%的本配料添加到配方的E相。

HYDRERGY ^TM ：市场上以SEDERMA（WO2003/02828692）名称销售的活性成分；它是长期增湿剂，能刺激ATP合成。例如，可以将3%的本配料添加到配方的E相。

E)In vivo（活体外）研究

试验利用上面示例1中的乳剂进行。

原理

针对含有本发明球花属提取物的化妆品乳剂，对其功效进行了研究。选择具有无光泽皮肤的一组20名志愿者，以评价面色的改善；选择另一组具有反应性皮肤的22名志愿者，以展示这种效果的改善；选择另一组具有可见老化迹象（皱纹，色斑等）的14志愿者，以评价存在的SOD和羰基化蛋白质的数量。

在本次研究中，组合了若干种互补的方法：

·在标准化照片上，分析面色的清晰度和红色。

·通过Transluderm^TM，分析皮肤透明度。

·通过Goniolux^TM，分析皮肤发光和消光。

·利用评估减小的皮肤的过度反应性。

·在从面颊上获得的胶带条上，评估SOD和羰基化蛋白质的数量。

协议

针对不同研究的特定包含准则

在面色研究中，包括了具有无光泽、疲劳和不均匀面色的女人。39%的这些女人是吸烟者；这是经常与无光泽面色相关的一个因素。

在皮肤反应性研究中，志愿者的选择是基于对针刺试验的积极响应，来自展现了足够敏感性分数的调查问卷。志愿者被要求遵守15天的清除期（使用安慰剂）。

在老化迹象研究中，14名志愿者的选择依据是，如果他们的年龄超过45，而且具有多个老化迹象：线，疵点或发红。与前一项研究中一样，要求清除期。

对于3个试验，在试验前的3个月期间，以及试验本身期间，不允许有激素变化（避孕药、激素替换或治愈性治疗没有变化）。

在研究期间，主体必须只能使用提供的化妆品。

研究类型和持续时间

研究以单盲方式进行，在下列对象上使用非侵袭性测量：

·随机选择具有无光泽皮肤的20个志愿者（平均年龄34岁[范围在20到48岁]）；在他们的半个脸上运用含有心叶球花提取物的乳剂，而在他们的另半个脸上运用安慰剂乳剂。

·随机选择具有反应性皮肤的22个志愿者（平均年龄44岁[范围在25到64岁]）；在他们的一个前臂上运用含有心叶球花提取物的乳剂，在对照侧的臂上运用安慰剂。用于这一组的乳剂浓度略微高一点（添加了2%甘油），因为主体的反应性皮肤。

·随机选择具有物理老化迹象的14个志愿者（平均年龄57.5岁[范围在47到71岁]）；在一个面颊上运用含有心叶球花提取物的乳剂，在对照地面颊上运用安慰剂乳剂。

含有心叶球花提取物或安慰剂的乳剂以按摩方式运用于皮肤中，每天两次，持续2个月。研究结果在下图中总结。

在必要之处，使用学生试验、或利用非参数化的Wilcoxon试验，进行了统计试验。在这两种情况下，试验都是单独尾随，并依据成对测量。

1.1面色的研究

根据标准化照片来分析清晰度和发红

使用摄影系统HeadScan（Cosm’O实验室），在两个情形下拍摄完全相同的照片。系统使用配备闪光灯和滤光器的高清晰度数码相机，以获得拍摄无反光图像所需的交叉偏振光。

对于每半个脸，利用FrameScan^TM软件自动提取5个区域，以计算清晰度（L*）和发红（a*）指数。

结果在下面的表18和19中给出。

表18：应用含心叶球花提取物乳剂2个月后，面色清晰度的变化；（N=20）

*生理刻度：刻度的前20个单位代表非常无光泽的表面；这些是推导的。

结果显示，2个月后，在安慰剂侧，用参数L*测量的面色清晰度退化，与T0之差是8.4%（p<0.01）。在本发明心叶球花提取物一侧，在皮肤参数退化的这个期间，清晰度保持稳定。与安慰剂相比，看到了面色清晰度的明显改善（+9.2%（p<0.01））。

表19：应用含心叶球花提取物乳剂2个月后，面色发红的变化；（N=20）

在平行意义上，试验期间，在安慰剂侧，这些志愿者的发红面色提高了+17.1%；（p<0.01）。这可能是由于两次测量时间之间的不同气候条件。不过，应用心叶球花提取物乳剂限制了这种提高的发红趋势。两侧之差有利于用心叶球花提取物乳剂处理过的一侧：-13.4%；（p<0.01）。

根据针对这两个参数获得的结果，能够推导出面部具有较少缺陷和发红，具有比较均匀

和精神焕发的面色。

通过TRANSLUDERM ^{T M} 分析皮肤透明度

利用由Orion Concept公司开发的仪器Transluderm^TM，评价皮肤透明度。

这种仪器包括17mm半径的板；板的中心含有能明亮皮肤的连续光谱白光二极管。在所有四个方向上，传感器以1.5mm的间隔布置；记录皮肤发出的光的数量。使用高分辩率照相机拍摄图像，利用专用软件进行图像分析。据此获得通过皮肤传导的光的“最大传播距离”参数。

可以理解，透明皮肤能将光传导得更远。

结果在下面的表20中给出。

表20：在应用心叶球花提取物乳剂后，通过Transluderm^TM测量的皮肤透明度的变化；（N=20）

通过运用心叶球花提取物乳剂，发现光能传播远得多的距离（+52.7%，与安慰剂相比），说明皮肤透明度得到极大的改善。以前观察到的效果从而得到增强。

通过GONIOLUX ^TM 分析皮肤光亮度

使用Goniolux^TM（Orion Concept公司）来评价发光和消光参数。该仪器能量化投射到皮肤上的光（入射光）和皮肤返回的光的行为（反射光）之间的干涉。在三维空间中的所有方向上，使用多个传感器来测量反射光。反射的光能划分成镜状（镜象效应）反射光和漫射的反射光（光圈效应）。当返回的光柔和、具有较少发光和较多消光（光圈）时，皮肤呈现为更加年轻和更加美丽。

结果在下面的表21中给出。

表21：在应用心叶球花提取物乳剂后，镜面光和漫散光参数的变化；（N=20）

应用心叶球花提取物乳剂2个月，产生了有益的消光效果；包括减少了发光（-9.1%；p<0.02相对于T0），产生了该参数结果的改善（+5.2%；p<0.07相对于安慰剂），再组合以亚光外观增加的趋势（+17.9%；p<0.01相对于T0）。

这两个参数的改善使得面部外观更加平滑，更加柔软。

1.2皮肤反应性的研究

为了检验志愿者皮肤反应性的改善，使用一种称为的仪器。这种仪器在医学上用于超级或低级-反应性的早期探测。

能用于提供皮肤敏感性的定量和定性特征化。

通过向皮肤输出一个小的电流，直到志愿者有所感觉，仪器刺激神经细胞（此步骤完全无痛）。这对应于个体电流感知阈值（或者CPT=电流感知阈值）。

如果一个人能感知到比其它人更高强度的电流，这说明他具有较高的皮肤应力耐受性和较少反应性的皮肤。相反，低电流感知电流说明反应性更大的皮肤。

存在若干类型的神经纤维，（Aβ，Aδ和C纤维）；它们能通过不同频率的电流来激励。

这三类神经纤维承载不同的信息。因为包含试验中志愿者的经验，在本研究中使用前臂类型Aβ纤维作为模型。这些大直径、快速传导纤维承载皮肤接触、压力、振动和扩张信息。它们与四类机械-受体相关：触觉小体，鲁菲尼氏小体，美克耳盘体和帕西尼氏小体。

在本项研究中，测量的执行是自动和双盲的，确保非常可靠的结果；它们对于这类取决于个体的、主观感觉尤其重要。结果在下面的表22中给出。

表22：在应用心叶球花提取物乳剂后，皮肤耐受力阈值的变化；（N=22）

在安慰剂部位上，结果显示的感知阈值退化很轻微，没有意义；作为这种下降的后果，使得皮肤反应性比T0时大。

相反，在用含有心叶球花提取物乳剂处理过的部位上，感知阈值上升与安慰剂相比非常明显，达到+23.6%；（p<0.01）。这说明，在使用了根据本发明的心叶球花乳剂后，皮肤反应性下降。

1.3研究胶带条上的SOD和羰基化蛋白质

在具有可见老化迹象（N=14）的志愿者身上进行了试验，以确认在培养细胞中、以及在用心叶球花提取物乳剂处理的外植体中看到的SOD生产的刺激。

在面颊上应用含心叶球花提取物的乳剂2个月后，根据从面颊上获得的胶带条上测量的SOD活性显示，心叶球花提取物乳剂部位上的活性明显地改善了+19%；与之相比，对照侧安慰剂部位上则下降了13%。32%的差距还是明显的（p<0.01）。

另外，还使用FUJITA等人（2007）的方法，测量了同一项研究中通过胶带条取下的角质层细胞上发现的羰基化蛋白质的数量。羰基化蛋白质在胶带条上使用FTZ荧光标签直接识别，利用利用荧光阅读器测量。通过总体蛋白质的平行测量，实现数据的标准化。结果在下面的表23中给出。

表23：在应用心叶球花提取物乳剂后，羰基化蛋白质数量的变化；（N=14）

这些结果显示，在用心叶球花提取物乳剂处理过一侧的胶条上收集到较少的羰基化蛋白质；与安慰剂部位相比，这个差距很明显（安慰剂侧是-18%；（p<0.01）。

这样，在具有可见老化迹象的皮肤上运用2个月后，心叶球花提取物乳剂能够改善SOD活性，减小羰基化蛋白质存在的数量。结合无光泽皮肤试验中观察到的结果，可以得出这样的结论：心叶球花提取物乳剂已经刺激了皮肤的防御，恢复了其透明度和光亮度。净化能力的改善已经帮助减小反应性，使得皮肤对将来应力的感知性较低，从而获得免疫能力。所以说，心叶球花提取物乳剂充当了基因抗老化疫苗。

Claims (9)

1.心叶球花(Globularia cordifolia)的未分化细胞的细胞提取物在制备用于皮肤和/或附器的非治疗性化妆品处理的局部用组合物中的用途，所述细胞是通过按照下列步骤的离体植物培养获得的，包括：

-预培养步骤，采用未分化心叶球花(Globulariacordifolia)细胞株，设计该步骤用于增加生物量；

-在生物反应器中的培养步骤，包括增殖阶段，随后跟着激发阶段，以增加苯乙醇糖苷的含量，所述激发方式选自：给培养中添加微生物分数，给已知分子加压、以指导细胞实现它们的二次新陈代谢，在培养中采用温度或pH值、或渗透压力的变化，环境贫化的使用，以及给培养基中增加吸附树脂；以及

-通过细胞溶解回收未分化细胞生物量的细胞提取物的步骤。

2.根据权利要求1的用途，其中所述处理选自：

-通过刺激解毒反应和/或由于毒物刺激类响应导致的细胞再生、来预防和/或处理皮肤老化；

-改善面色的透明度和光亮度；

-预防或处理过敏性和反应性皮肤；

-预防或处理发红；

-预防蛋白质糖化；

-增加和/或维持皮肤干细胞的数量；

-增加和/或维持皮肤胶原蛋白和弹性蛋白；

-增大真皮的体积；

-预防和/或处理细线和皱纹；

-定型皮肤；和

-预防脱发和/或刺激头发再生。

3.通过包含来自未分化植物细胞株的离体植物培养获得心叶球花(Globularia cordifolia)提取物的方法，包括：

-预培养步骤，采用未分化心叶球花(Globulariacordifolia)细胞株，设计该步骤用于增加生物量；

-生物反应器中的培养步骤，包括增殖阶段，随后跟着激发阶段，以增加苯乙醇糖苷的含量；以及

-回收未分化细胞生物量的细胞提取物的步骤；

其中，生物反应器步骤中的激发阶段利用蔗糖和常量营养素缺乏的培养基来实现；在提到的所述提取物的回收步骤中，包括酸性pH细胞溶解。

4.根据权利要求3的方法，其中所述细胞株是在编号DSM25009下记录的细胞株。

5.根据权利要求3或4的方法，其中所述未分化细胞是从叶子中获得的。

6.可根据权利要求3-5任一项的方法获得的心叶球花细胞植物提取物。

7.包含权利要求6所述的心叶球花提取物的局部用化妆组合物。

8.根据权利要求6所述的提取物在制备用于皮肤和/或附器的非治疗性化妆品处理的局部用组合物中的用途。

9.根据权利要求8的用途，其中所述处理选自：

-通过刺激解毒反应和/或由于毒物刺激类响应导致的细胞再生、来预防和/或处理皮肤老化；

-改善面色的透明度和光亮度；

-预防或处理过敏性和反应性皮肤；

-预防或处理发红；

-预防蛋白质糖化；

-增加和/或维持皮肤干细胞的数量；

-增加和/或维持皮肤胶原蛋白和弹性蛋白；

-增大真皮的体积；

-预防和/或处理细线和皱纹；

-定型皮肤；和

-预防脱发和/或刺激头发再生。