JP6505652B2 - グロブラリアの植物由来の抽出物の新規の使用及びインビトロの植物培養によって前記抽出物を得る方法 - Google Patents
グロブラリアの植物由来の抽出物の新規の使用及びインビトロの植物培養によって前記抽出物を得る方法 Download PDFInfo
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Description
nomena)および有毒生成物の形成を引き起こす。
・ホルミシスタイプの反応を介する解毒反応および細胞再生を刺激することによる、皮膚の老化の予防および/または処理;および/または
・肌色の光輝性および/または透明性の改善;および/または
・敏感肌および/または反応性肌の予防および/または処理;および/または
・発赤の予防および/または処理:および/または
・タンパク質の糖化の予防;および/または
・真皮幹細胞の数の増加および/または維持;および/または
・真皮高分子、特にコラーゲンおよびエラスチンの増加および/または維持;ならびに/または
・真皮容積の増加(真皮の再膨張(replumping))用の;ならびに/または
・小皺および皺の予防および/または処理;および/または
・皮膚の引き締め;および/または
・脱毛の予防および/または毛髪の再生の刺激。
この方法は、まず寒天培地上での、増殖性の高い細胞株の形成を含む。その後、これらの株は、バイオマス(biomass)を実質的に増加させるために、液体培地上で増殖される。生育周期の終期に、(適正な誘発要因を検索して)決定および最適化された環境条件で、細胞バイオマスが目的分子を合成するだろう。その後、培養を、目的分子を最大限含んだ植物由来の抽出物を得るために、最適な時間で停止し抽出する。入手可能な既存の細胞株を最初に用いることも可能である。
このタイプの培養は、根茎部分(「根茎培養(root culture)」)または大気部分(「茎培養(shoot culture)」)に関する。このタイプの方法においては、培養物は、アグロバクテリウム−リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)(根茎)またはアグロバクテリウム−ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)(茎)のゲノミクスバクテリア(genomics bacteria)によって形質転換される。形質転換された根茎または大気中の部分の培養物は、成長が早く遺伝的に非常に安定している。誘発パラメータの最適化後、これらは目的分子の合成に用いられる。これらの分子は、その後公知の処方を用いて抽出される。
この方法の第一工程では、(対象代謝物の成長および生成の観点から)最適な特性を有する親植物を選択する。胚形成における、次の工程は、親植物の移植片(explant)からのカルス(callus)の誘導である。これらの未分化細胞は、連続的な培養周期を介して、増殖させ拡張させることが可能な、多数の体細胞胚を生成できる。最も増殖性があり生産力がある株から、目的代謝物を最適に生成するために、実生(seedling)が適切な培地上で再生され、適切な時間に抽出される。第二工程では、そのホルモン組成物により適切な培養培地上で、親植物の移植片から葉茎部を誘導する。茎葉の増幅期の後、根が出る発根期が続く。その後、最適な培地上で成長させ目的分子を抽出するために、大規模に胚を再生させることが可能となる。
・バイオマスを増加させる前培養(pre−culture)工程と、
・増殖期およびその後の誘発期を含むバイオリアクター(bioreactor)中での培養工程と、
・前記抽出物の回収工程と、
を含む方法である。
・前培養工程は、体積を増加させる前培養(pre−cultures)の完了を含んでおり、より少量の各前培養(each pre−culture)は、大量の前培養を接種するために充 分な量の細胞バイオマスを発生させる。
(バイオリアクター中での次の培養工程)
・バイオリアクター中での次の培養工程は、前培養工程において形成されたバイオマスを植え付けたバイオリアクター中で行われる。ベース培地上での細胞増殖の初期段階後、二次代謝物の誘発用の培地がバイオリアクターに添加される。二次代謝物が所定のレベルに達すると培養を停止させる。本発明においては、好ましくは、このレベルを達成するために、ショ糖および多量栄養素が欠損した誘発培地が使用される。
(回収工程(または収穫工程))
・回収工程(または収穫工程)は、生理学的に許容可能なあらゆる溶媒またはこれらの溶媒のあらゆる混合物を用いて、このバイオマスを抽出する工程を含む。この抽出は様々な公知の方法を用いて実施することができ、組み合わせて実施することもできる。例えば加熱、解離(maceration)、浸出(decoction)、注入(infusion)、加圧、溶出(leaching)、超音波、マイクロウエーブといった化学的または物理的な適当な方法を用いて細胞を溶解して実施できる。層分離は濾過または遠心分離によって実施できる。これらの方法の代わりに、超臨界流体または亜臨界流体を用いてバイオマスを抽出することも可能である。さらに、これらの方法の代わりに、吸着樹脂、クロマトグラフィー法や液−液分離法を用いて精留することも可能である。
好ましい実施形態によれば、細胞含有物を水に転移させるために細胞が溶解される。本発明においてより好ましくは、この溶解はpHを酸性方向に低下させて実施される。複数回濾過後、殺菌した抽出物が得られる。その後pHは、抽出物の用途によって好適に調整される。例えば以下に述べるような美容用途(a cosmetic application)ではpH4に調整される。
1)カルスの誘導は、葉、実、根、芽、種、茎、枝および分裂組織、特に形成細胞(cambium)を含む植物のすべての部分を用いて行える。本発明において好ましくは、未分化細胞の培養は植物の葉から実施される。
2)最適株の選択は、液体培地へ移植する前に、本発明において実施される。最適株は特に次の特徴、高増殖能力、柔軟で砕けやすい触感、均一な色、液体培地への分散性が良好でこれらのパラメータを長期間維持できることを含む。
3)第一段階ではバイオマスの早い生育を確実にし、第二段階で対数期の終点において細胞による二次代謝物の合成を最大効率で得ることができるように、最適培地を選択し、選択した株用の液体培地上で、二次代謝物の成長および生成物の特徴を最適化する。この第二段階は培養誘発に対応し、当業者は利用可能な方法の中の様々な方法を用いて達成できる。これらの方法は、菌断片、細胞を二次代謝に導くことが知られているストレス分子(stress molecules)を培養に添加すること、温度もしくはpHの変化、または、浸透圧ストレスを培養へ適用すること、目的化合物を誘発することに加えてそれらを捕捉できる吸着樹脂を培養に加えて環境貧窮化の使用、を含む。本発明による好ましい誘発方法は、培養培地の多量要素および糖質を少なくすることである。
・バイオマスを増加させる前培養工程と、
・誘発期が後に続く増殖期を含む、バイオリアクターにおける培養工程と、
・前記抽出物の回収工程とを含む方法である。
ここで、バイオリアクター工程における誘発期は、ショ糖および多量養素の欠損培地上で実施され、前記抽出物の前記回収工程は、酸性pHの細胞溶解剤を含む。
本発明において「生理学的に許容可能な媒体」とは、何ら制限されないが、水溶液または水性アルコール溶液、W/Oエマルジョン(water−in−oil emulsion)、O/Wエマルジョン(oil−in−water emulsion)、ミクロエマルジョン、水溶性ゲル、無水ゲル、セラム(serum)、小胞(vesicles)または粉末のディスパージョンを意味する。
CTFA国際化粧品成分事典(The CTFA International cosmetic ingredient dictionary & handbook)(第13版、2010年)(出版社米国化粧品工業会、ワシントンD.C.)は、従来からスキンケア産業に用いられており、本発明の組成物中で付加的な成分/化合物として用いることのできる多種類の化粧品および薬剤成分を特に制限なく開示している。これらの成分の種類の例としては、以下のものが含まれるが、これらに制限されるものではない。老化回復剤、皮膚の抗老化剤、皺防止剤、委縮防止剤(anti−atrophy agent)、皮膚の保湿剤、皮膚の平滑剤、抗菌剤(antibacterial agent)、駆虫剤、抗真菌剤、殺真菌剤、静真菌(fungi static)剤、殺菌剤、静菌剤、抗菌剤(antimicrobial agent)、抗炎症剤、かゆみ防止剤、麻酔剤、抗ウィルス剤、角質溶解剤、フリーラジカル捕捉剤、抗脂漏剤、ふけ防止剤、皮膚の分化、増殖もしくは色素沈着の調整剤、および浸透促進剤、剥離剤、メラニン合成の刺激剤もしくは抑制剤、美白、脱色もしくはライトニング(lightening)剤、着色促進剤(pro−pigmenting agent)、セルフタンニング剤(self−tanning agent)、NO−合成阻害剤、抗酸化剤、フリーラジカル捕捉剤、および/または抗大気汚染剤、反応性カルボニル種捕捉剤、抗糖化剤、引き締め剤、真皮のもしくは表皮のマクロモレキュルの合成促進剤および/またはこれらの分解の阻害剤もしくは予防剤、例えばコラーゲン合成促進剤、エラスチン合成促進剤、デコリン合成促進剤、ラミニン合成促進剤、デフェンシン合成促進剤、シャペロン合成促進剤、アクアポリン合成促進剤、ヒアルロン酸合成促進剤、フィブロネクチン合成促進剤、サーチュイン合成促進剤、脂質および角質層成分合成(セラミド、脂肪酸等)促進剤、コラーゲン分解抑制剤、エラスチン分解抑制剤、繊維芽細胞増殖促進剤、ケラチノサイト増殖促進剤、脂肪細胞増殖促進剤、メラノサイト増殖の促進剤、ケラチノサイト分化促進剤、脂肪細胞分化促進剤、アセチルコリンエステラーゼ抑制剤、グリコサミノグリカン合成促進剤、DNA修復剤、DNA保護剤、かゆみ防止剤、敏感肌の治療および/もしくは手入れ用薬、引き締め剤(firming agent)、抗伸展線剤(anti−stretch mark agent)、収斂剤、皮脂合成調整剤、皮膚弛緩(dermo−relaxing)剤、治癒補助剤、再表皮化(re−epithelialization)促進剤、再表皮化共補助(co−adjuvant)剤、サイトカイン成長因子、鎮静剤、抗炎症剤、毛細管循環および/もしくは微小管循環に作用する薬、血管形成促進剤、血管透過性阻害剤、細胞の代謝に作用する薬、真皮―表皮の結合改善薬、毛髪成長誘発剤、毛髪成長抑制もしくは遅延剤、筋肉弛緩剤、汚染防止および/もしくは抗フリーラジカル剤、脂質分解促進剤、減量剤、抗脂肪沈着剤、微小循環に作用する薬、細胞のエネルギー代謝に作用する薬、洗浄剤、毛髪調整剤、毛髪スタイリング剤、毛髪成長促進剤、サンスクリーン剤、トータルサンスクリーン剤、メイクアップ剤、洗剤、医薬品用製品、乳化剤、軟化剤、有機溶剤、消毒剤(antiseptic agent)、防臭活性剤、生理学的に許容可能な担体、界面活性剤、研磨剤、吸収剤、美容化合物(aesthetic component)、例えば香水、顔料、染料、着色剤、天然着色剤、エッセンシャルオイル、タッチエージェント(touch agent)、美容収斂剤、抗ニキビ剤、抗凝固剤、抗起泡剤、抗酸化剤、結合剤、生物学上添加剤、酵素、酵素阻害剤、酵素誘発剤、補酵素、キレート化剤、植物からの抽出剤、植物からの誘導体、エッセンシャルオイル、海産抽出物、バイオ発酵もしくはバイオテクノロジー工程により得られた薬、ミネラル塩、細胞抽出物、サンスクリーン剤(紫外線Aおよび/もしくはBに対する有機またはミネラル光防護剤)、セラミド、ペプチド類、緩衝剤、容積付与剤(volumizing agents)、キレート化剤、化学的な添加剤、着色剤、化粧品用殺生物剤(cosmetic biocides)、医薬用収斂剤、外用鎮痛剤、膜形成剤、例えば組成物の膜形成性や永続性(substantivity)補助用のポリマー、クォータナリー誘導体(quaternary derivative)、永続性(substantivity)増加剤、不透明化剤、pH調整剤および調節剤(例えばトリエタノールアミン)、噴霧剤、還元剤、捕捉剤(sequestrant)、脱色性および/もしくはライトニング剤、皮膚のコンディショニング剤(例えば、ミセル剤および閉塞剤(occlusive)を含む湿潤剤)、保湿維持剤、アルファヒドロキシ酸、ベータヒドロキシ酸、モイスチャークリーム、表皮の加水分解酵素、治療および/もしくは鎮静剤、皮膚の治療剤、皺防止剤、目の下のくまの減少もしくは治療薬、剥離剤、増粘剤、軟化剤、ゲル化ポリマー(gellifying polymer)、ビタミンおよびその誘導体、湿潤剤、ピーリング剤(peeling agent)、軟化剤、皮膚の治療薬、リグナン、防腐剤(すなわちフェノキシエタノールおよびパラベン)、抗UV、細胞障害性薬剤(cytotoxic agent)、抗腫瘍性、粘度調整剤、非揮発性溶剤、パール化剤(pearling agent)、発汗抑制剤、脱毛剤、ワクチン、香水、皮膚の再構築剤(言い換えれば、メナモニ(Siegesbeckia orientalis)抽出物)、賦形剤、充電剤(charge)、ミネラル、抗ミクロバクテリア剤、抗アレルギー剤、H1もしくはH2抗ヒスタミン剤、抗刺激物質、免疫系刺激剤、免疫系阻害剤、防虫剤、潤滑剤、顔料もしくは染料、色素脱失剤、防腐剤、光安定剤、およびこれらの組成物であって、組成物中の他の成分特に本発明の活性剤と物理的におよび化学的に矛盾しない成分。
本発明は、上述したグロブラリア抽出物の有効量を皮膚および/または付属器への局所投与を含む、皮膚の一般的な状態を改善するための美容処理方法にも関する。
真皮幹細胞の数の増加および/または維持用、および/または、
真皮高分子、特にコラーゲンおよびエラスチンの増加および/または維持用、および/または、
真皮容積の増加(再膨張)用、および/または、
小皺および皺の予防および/または処理用、および/または、
皮膚の引き締め用、および/または、
脱毛の予防および/または毛髪の再生の刺激用、
にも適している。
(1)細胞株の形成
グロブラリアコルディフォリア植物を種子から得た。葉を集め、その後水を用いて洗浄しすすぎ、浄化してさらにすすいだ。
葉の一部を切断し、それを、吸収可能な炭素源、ミクロおよびマクロ要素の溶液、適したホルモンおよびビタミンの組み合わせを含む栄養寒天の表面に設置する。この栄養培地は、その成分によって、葉の治癒においてカルスと呼ばれる、未分化細胞クラスターの生成のきっかけとなりえる。
pHは5.5〜6の間に調整されている。
この培地を以下において「基本培地」という。誘導工程は1〜4か月続く。培養は25℃暗中で実施される。
3週間ごとに新しい培地上に継代移植(successive transplantation)した後、安定したカルスが得られる。表現型特性(色、脆弱性、増殖性)の安定した均一の培養物が得られる。
選択された株は、初期段階での成長パラメータを最適化するために液状培地へ移植される。
(a)バイオリアクター中での前培養形成
1リットル、次いで5リットル、さらに25リットル、最終的には100リットルの、選択した細胞株の連続的な前培養を実施する。それぞれに10%PCVで接種した後、50%PVCまで成長させる。このように製造された細胞バイオマスは、より大きなサイズでの培養に接種するために使用される。この工程は、1〜3月続く。
その後、シングルユースバッグのバイオリアクター(全体積600リットル、総培養容量300リットル)に、5〜20%PVCの範囲で接種する。このバイオリアクターは、特に以下を装備している:
・細胞の撹拌および酸素添加用、ならびに培養温度調整用の、好ましくは従来のバイオリアクターの剪断と比べると植物細胞の壊れやすさの観点で適しているために選択される、ロッキングシステム;
・別々のセンサー(酸素、pHおよび温度)を備えた、経過観察および培養工程調節用のコントロールタワー;
・別々のセンサー(pH、酸素)、ガス供給用のフィルター、および、無菌流体をサンプリングまたは接種するための交換システムを搭載した細胞培養用シングルユース滅菌バッグ。
続く工程の目的は、水性の高純度抽出物を製造することである。
(1)目的分子の抽出について:
・細胞溶解工程は、バイオマスの熱処理により、例えばバイオマス中に蒸気を注入することによって、実施できる。それは、マイクロビーズと共に細胞を粉砕することによっても実施できる。
・細胞溶解工程の後に、目的分子を濃縮するために、粗抽出物を精製することができる。この工程では、第一にバイオマスが濾過または遠心分離によって除去される。その後、得られた清澄化された液相と、目的分子との親和力によって選択された吸着樹脂とを接触させる。この樹脂をその後、グラスクロマトグラフィーカラムに入れる。この樹脂を適切な混合液を用いて溶出し、生成物の溶出液を濃縮する。
・本発明の抽出物の回収は、リポソームを用いて実施できる。
(2)目的分子の誘発方法について:
目的化合物の誘発は、培養物に微生物片を添加することによって、キトサン、ジャスモン酸メチル(methyljasmonate)、ジャスモン酸、サリチル酸等の生物由来の分子を添加することによって、パクロブトラゾール(paclobutrazol)等の非生物由来の分子を添加することによって、温度変動、pH変動、および/または例えばマンニトール等の非代謝性糖を用いて引き起こされる浸透圧ストレスを培養物に与えることによって、環境中のマクロ要素および糖をさらに欠損させることによって、目的化合物の誘発に加えて目的分子の捕捉が可能な吸着樹脂を培養物へ加えることによっても、実施できる。
(3)細胞株の形成工程の代わりに、すでに形成および保存されている本発明の細胞株を用いることもできる。この場合、細胞株の形成工程は、最初は寒天培地上そして液状培地上に存在する前記細胞株から未分化植物細胞を増幅させる公知の工程に変更される。
活性成分は、皮膚科学的に許容可能な媒体または基質に溶解された、グロブラリアコルディフォリアの植物由来の抽出物を含む化粧品組成物である。この活性成分は、例えばクリーム、ゲル等の化粧品の調製のために化粧品産業で用いられる(以下に示す製薬例参照)。
出願人により、以下に示すグロブラリア抽出物の多くの顕著な美容効果(cosmetic effect)が明らかになった。
まず、植物全体のヒドロアルコール(hydroalcoholic)抽出物に対して、細胞培養によって得られた抽出物の優位性が示された。これらの第一の試験は、上記の例(B)において最大33%で調製した水溶性抽出物を2%に希釈したものと、植物全体のヒドロアルコール抽出物とを、フェニルエタノイドグリコシド中、同じ濃度で比較することによって実施された。
この簡単な試験では、通常の皮膚タンパク質がさらされるストレスである、非酵素的糖化現象による機能改変を、インビトロで再現する。
DPPH(1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジル)は、フリーラジカル捕捉剤を検出するために広く使用されている安定フリーラジカルである。この分子は、ラジカル性を失うことによって、DPPH2(1,1−ジフェニル−2−ピクリルヒドラジン)に変換される。この変換は、517nmにおける分光測定によって経時的に測定することができる変色(紫色→黄色)を伴う。抗ラジカル活性を有しないコントロールは、一定のDO値を維持する。0003%のコーヒー酸が、抗ラジカル活性のポジティブコントロールとして用いられる。データを以下の表2に示す。
酸素分子(O2)は呼吸鎖末端電子の受容体として不可欠な役割を果たす。しかし、この代謝等により、例えばUV照射等の外因と同様に、たとえ健康体であっても、特に活性のある特定の誘導体(一重項酸素、ヒドロキシラジカル、スーパーオキシドアニオン)が発生する。この誘導体は、脂質、タンパク質および核酸に酸化ダメージを引き起こすことになる。一重項酸素は、これらの高エネルギー性および高反応性の酸素の形状の一つである。色素とUVA光子または可視光とを用いて、一重項酸素をインビトロで実験的に製造できる。以下に示す試験では、色素であるローズベンガルおよび可視光を用いる。この試験の目的は、可視光照射下でローズベンガルから形成された一重項酸素による尿酸の分解を調べることである。一重項酸素の生成は、292nmにおける尿酸の分解を追跡することによって可視化できる。一重項酸素の中和が可能な化合物の存在下では、この分解が緩やかになる。0002%のコーヒー酸が、抗一重項酸素活性のポジティブコントロールとして用いられる。データを以下の表3に示す。
これらの研究は、上記の例(B)において最大で33%で調製した水溶性抽出物を、2%に希釈して、実施した。
ケラチノサイト群の層を、24時間本発明の抽出物2%と培地上で接触(試験)または非接触(コントロール)させた。これらの層はその後、皮膚が一般的に受ける二種類のストレスに耐える能力を評価するために、再現可能な方法で「傷をつけられ」て、そのあとすぐにUVBに曝された。細胞層の回復はその後、画像解析、細胞のフリーな表面の定量化によって評価された(結果を以下の表4に示す)。
(原理)
表皮は、有効な皮膚バリアを形成するために連続的に再生する。この効果は年齢と共に衰える。この作用の開始時の細胞は、幹細胞または前駆細胞と呼ばれる。これらの細胞は、これらの細胞の分子が直接接する環境と当該分子とを結合する分子リンクの性質により、珍しいことながら、再生能力を有している。
12日間培養後、コロニーの数および大きさを、固定染色後に測定する。この結果、コントロールでは5.4±1.5コロニー/1000接種細胞があり、これらのコロニーはサイズが小さいことが分かった。これに対し、グロブラリアコルディフォリア抽出物と接触すると、コントロールに対し2.3倍のコロニー(12.6コロニー±4.3コロニー/1000接種細胞;+133%;p<0.01)が生じ、これらのコロニーのサイズは大きくなった。
(a. サーチュイン 1(Sirtuin 1))
例えばカロリー制限等のホルミシス効果またはホルミシス分子との接触により、サーチュイン酵素および様々な有機体の寿命が増加する。サーチュインは、特にFOXOファクターの脱アセチル化に効果を及ぼし、アポトーシス性タンパク質の生成のきっかけとなることを妨げる。サーチュインは、さらに細胞の抗酸化防御および純化メカニズム(解毒)を刺激し、ミトコンドリア機能すなわちエネルギー生成を維持するのを助ける。このことにより生存性およびストレスへの抵抗力が増加する。
クレアチンキナーゼは、2種類のアイソフォームで皮膚中に存在する遍在酵素である。クレアチンキナーゼは、細胞内へのエネルギー貯蔵のために用いられ、組織が緊急のエネルギーの必要性に応えることを可能にする。この酵素は、ADPに変換されるATPを用いて、クレアチンをクレアチンリン酸に変換する。必要な時に、酵素は逆方向に働き、エネルギーが戻る。この酵素の活性度は、この酵素が活性酸素グループの好ましいターゲットの一つであるので、年齢と共に低下する。従ってこの酵素の活性を維持し増やすことが望ましい。
(a. 内因的なパーオキサイド)
従来から細胞群の活力を評価するのに使われてきた指標の1つは、酸化ストレスレベルである。
ヒトケラチノサイト群は、群に成長するまでグロブラリアコルディフォリア抽出物と24時間接触下または非接触下(ネガティブコントロール)静置した。細胞はその後、緩衝液中でDCFHラベルに露光され、代謝した。ラベルは、どちらの細胞内パーオキサイドとも反応できる。培地をその後、グロブラリアコルディフォリア抽出物と酸化剤モデルのハイドロゲンパーオキサイドとを含有または非含有の培地と取り換えた(培地とグロブラリアコルディフォリアの両方がH2O2とは直接反応しない)。蛍光を、ラベルと反応した細胞内パーオキサイドのレベルの評価のために読み取った。細胞の数は、細胞核ラベル方法(Hoechst 33258)を用いて定量化した。この結果を表10に示す。
我々の身体によって形成される、例えばカタラーゼまたはSODのような抗酸化酵素も、食事から得られる抗酸化剤、ビタミンEおよびC、カロチノイド等もまた、フリーラジカルや活性酸素種の有害作用を抑制するのを助ける。よって、これらの化合物の合成を刺激して数を増やすことは明らかに重要である。
*ポジティブコントロールトロロクス0.012%:SOD21%;p<0.01
糖化、酸化(カルボニル化されたタンパク質)または脂質パーオキサイドとの結合によって損傷されるタンパク質は、老化に従い細胞中に堆積される傾向にある。細胞恒常性(cellular homeostasis)において、これらの有害作用を減少するプロテソアームにより、これらのタンパク質は日常的に除去される。プロテソアームの活性は、しかし、これらのタンパク質の蓄積、リポフスチンの蓄積、リポタンパク質の無駄な生成、または時間の経過によって低下し、その結果悪循環により損傷したタンパク質の量がさらに増加する。
周知の抗酸化の役目に加えて、グルタチオンは身体において最も重要な解毒要素であり、身体の健康のための重要な作用物質である。グルタチオンは、例えば重金属、溶媒、殺虫剤等の毒素と結びつき、これらの毒素を、胆汁または尿中に含まれて容易に取り除かれる水溶性化合物に変換する。
*ポジティブコントロールトロロクス0.012%:GSH:53%(p<0.01)
・表面に出てこないストレス(サーチュイン、SOD、カラターゼ、グルタチオン)に対して細胞がさらに反応するように、分子および代謝経路を直接強化
−細胞のエネルギーポテンシャル、および酸化ストレス(クレアチンキナーゼ、ミトコンドリアポテンシャル、プロテアソーム、パーオキサイドまたは糖化タンパク質のレベル)に対する統合性(integrity)を直接的に保護、ならびに
・皮膚の修復能力を維持し、前駆体表現型およびこの機能の変化による細胞の増殖性を促進。
これらの研究は、上述した例(B)において33%まで調整した水溶性抽出物を、1%、2%または3%に希釈して実施した。
細胞が3次元球体になる能力は、幹細胞表現型の特徴である。この表現型を失う事は、これらの細胞が分化し幹細胞の特徴と無関係になることを示す。培養により他よりも球形が増えると、皮膚幹細胞が多くなったことを意味する。
幹細胞の特異的マーカーであるSOX2およびネスチン発生の免疫認識を実施し評価した。結果を以下の表16および17に示す。
(本発明の活性成分):本発明のグロブラリアコルディフォリア抽出物を含む処方(上記の例Bで33%を開示した)
以下に、付加的な化粧品活性成分の存在または非存在下、様々な処方を記載する。以下の記載は、本発明の活性成分をサポートする適切な方法および/またはさらに活性度の添加である。これらの成分は、機能、適用場所(身体、顔、首、胸、手等)、所定の最終的な効果、および対象となる消費者のようないかなる分類にも適用できる。たとえば抗老化、皺防止、保湿、目の下のくまおよび/またはたるみ、引き締め、輝き、糖化防止、シミ防止、ダイエット、鎮静効果、筋肉弛緩剤、抗発赤、皮膚線条防止等に適用できる。
RIGIN(商標):皮膚の弾性および引き締め(firmness)を改良し、皮膚の水和およびなめらかさを増やす、SEDERMA社によって販売されている活性剤(WO2000/433417)。この成分3重量%を、例えば相Gの調合に加えてもよい。
RENOVAGE(商標):SEDERMA社によって全世界で販売されている、抗老化活性成分(WO2006/020646)。この成分3重量%を、例えば、相Dの調合に加えてもよい。
LUMISKIN(商標):SEDERMA社によって販売されている活性成分(WO2004/024695)で、血色を明るくする。この成分3重量%を、例えば、相Dの調合に加えてもよい。
SUBLISKIN(商標):SEDERMA社によって販売されている活性成分(WO2009/055663)で、外部からの攻撃に皮膚が抵抗しつつ、皮膚を保湿し、および滑らかにする。この成分3重量%を、例えば、相Gの調合に加えてもよい。
MATRIXYL3000(商標):SEDERMA社によって販売されている皺防止のペプチドベース活性成分(WO2005/048968)で、老化により生じる皮膚のダメージの修復を助ける。この成分を3重量%、例えば、相Gの調合に加えてもよい。
DERMAXYL(商標):SEDERMA社によって販売されている抗老化活性成分(WO2004/101609)で、皺を伸ばし、皮膚のバリアを修復する。この成分を3重量%、使用直前に、例えば相(A+B+C)に加えることができる。
ナイアシンアミド(ビタミンB3)、レチノール、リスベラトロール、DHEA:皺防止を含む、抗老化成分。レチノール、リスベラトロールまたはDHEA0.5重量%を相(A+B+C)に一度に(extemporaneously)、例えば、加えてもよい。水に加えたナイアシンアミド10%の10重量%(10 wt% of Niacinamide 10% in water)を、例えば、相Gに添加することができる。
ヘキサミジン:抗バクテリア活性剤であり、相Gの調合に0.5容積%まで加えることができる。
CHRONODYN(商標):SEDERMAによって販売されている活性成分(WO2006/075311)で、皮膚の色調を整え、引き締め、疲労の目立つ兆候を消す。この成分を3%例えば相Gに加えてもよい。
VENUCEANE(商標):SEDERMA社によって販売されている活性成分(WO2002/066668)。フォトエイジングの目立つ兆候(シミ、皺、乾燥等)を防ぎ、UVによって生じるダメージから細胞構造を保護し、皮膚の完全性を強固にする。この成分を3%例えば相Gに加えてもよい。
JUVINITY(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤で、顔およびネックラインの老化の兆候を減らし、皺を伸ばし、真皮の密度を高くし再構築する。この成分を2%例えば相(A+B+C)に一度に(extemporaneously)加えてもよい。
トコフェロールまたはビタミンE:抗ラジカルおよび抗酸化物性の活性剤。
O.D.A. white(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤(WO1994/07837)で、メラニンの合成を減らすことによって皮膚を明るくする。この成分を1%例えば相(A+B+C)に一度(extemporaneously)に加えてもよい。
トコフェロール(ビタミンE)またはα−リポ酸(ALA):抗酸化および抗ラジカル物性を有する活性剤。0.5重量%を例えば相(A+B+C)に加えることができる。
Bio−Bustyl(商標):SEDERMA社によって販売されている、ペプチドおよび細菌濾過水(bacteria filtrate)をベースとする活性剤で、胸部の引き締めおよび色調に広く作用する。この成分を3%例えば相Gに加えることができる。
LUMISHERE(商標):SEDERMA社によって販売されている活性成分(WO04/024695)。これは、ポリメチルメタクリレートマイクロカプセル中に入れたジアセチルボルジン(DAB)とマンガンで修飾した二酸化チタン(TiO2Mn)との混合物である。TiO2Mnは皮膚に統一感を与え、つやを抑え、光沢を与え、DABは生理学的に輝く効果を与える。この成分4%を例えば相Fの調合に加えてもよい。
REVIDRAT(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤で、特に表皮の粘着と乾燥とを改良する。この成分2%を例えば相Cの調合に加えてもよい。
EVERMAT(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤(WO2007/029187)で、セラムの分泌を減らし、脂性肌の治療に関与する。この成分4%を例えば相Fの調合に加えてもよい。
HALOXYL(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤(WO2005/102266)で、くまを減らすことによって目の輪郭を改善する。この成分を3%例えば相Fの調合に加えてもよい。
EYELISS(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤(WO2003/068141)で、目の下のくまの出現を防ぎ、抑制する。この成分3%を例えば相Eの調合に加えてもよい。
Ac−Net(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤(WO2003/02828692)で、脂性およびニキビの発生しやすい皮膚を完全に治療する。この成分3%を例えば相Eの調合加えてもよい。
EVERMAT(商標):上記されている。この成分4%を例えば相Eの調合加えることができる。
HYDRERGY(商標):SEDERMA社によって販売されている活性剤(WO2003/02828692)で、長期間の保湿およびATP合成を刺激する。この成分3%を例えば相Eの調合に加えてもよい。
この試験は上記の実施例1のクリームを用いて実施した。
本発明によるグロブラリア抽出物を含む化粧品クリームの効験は、顔面の血色の改善を評価するためにくすんだ皮膚を有する20人のボランティアパネルにおいて、反応性皮膚の改善を実証するために反応性皮膚を有する他の22人のボランティアパネルにおいて、ならびにSODおよびカルボニル化タンパク質の含有量を評価するために老化兆候(皺、シミ等)を有する別の14人のボランティアパネルにおいて実施した。
・顔色の透明性および発赤の分析は、標準化した写真を用いた。
・皮膚の透明度はTransluderm(商標)を用いて分析した。
・皮膚の輝きおよびつや消しはGonioluxT(商標)を用いて分析した。
・皮膚の還元過反応性(reduced over−reactivity)はNeurometer(商標)を用いて評価した。
・SODおよびカルボニル化タンパク質の含有量は、頬から得た粘着テープ片で評価した。
(それぞれの研究の基準の明確性)
皮膚がくすみ、疲労しむらのある肌色をしている女性が肌色の研究に含まれた。これらの女性の39%が喫煙者であり、この因子はしばしば肌色のくすみと関連している。
研究は、非浸蝕性測定を用いて一重盲検法(single blind)により実施した。
・皮膚のくすみを有する20人のボランティア(平均年齢34歳(20歳から48歳の範囲))を無作為抽出し、グロブラリアコルディフォリア抽出物を含むクリームを顔の半分に、プラシーボクリームを残りの半分に適用した。
・反応性皮膚を有する22人のボランティア(平均年齢44歳(25歳から64歳の範囲))は無作為抽出し、グロブラリアコルディフォリア抽出物を含むクリームを片方の前腕に、プラシーボをもう片方の前腕に適用した。治験者が反応性皮膚を有しているため、このパネル用のクリームは少し含有量が多かった(2%グリセリンを添加)
・老化の肉体的な兆候を有している14人のボランティア(平均年齢57.5歳(47歳から71歳の範囲))を無作為抽出し、グロブラリアコルディフォリア抽出物を含むクリームを頬の片方に、プラシーボクリームを頬の対照面に適用した。
(標準化した写真を用いた透明性および発赤の評価)
写真装置、HeadScan(Cosm'O Laboratory)を、2つの場合において同様の写真を撮るために用いた。この装置では、フラッシュと艶無しイメージを撮るための交差偏光を得るフィルターとを備えた高機能デジタルカメラを用いる。
皮膚の透明度は、Orion Conceptによって開発された器具Transluderm(商標)を用いて評価した。この器具は、半径17mmのプレートからなり、中心部には皮膚を照らす白光ダイオードの連続的なスペクトルを有する。センサーは全四方1.5mmごとに配置され、皮膚が発した光の量を記録する。画像は高解像度カメラを用いて撮影し、画像解析は専用のソフトウェアを用いて行われた。皮膚を介して伝導された光の「最大伝播距離(maximum propagation distance)」パラメータをこのようにして得た。
GONIOLUX(商標)(Orion Concept)を、輝きおよび艶消しのパラメータの評価に用いた。この機器は皮膚に照射された光(入射光)と皮膚に反射された光(反射光)と挙動の相互作用を定量化する。反射光は3次元空間の全方向における複数のセンサーを用いて測定される。反射光は、鏡面反射光(ミラー効果)、および拡散反射光(ハロー効果)として折れ曲がる。輝きが少なくより艶が少なく、光の反射が柔らかい場合に(ハロー)、皮膚はより若々しく、より美しく見える。
ボランティアの皮膚の反応性の改善を調べるために、Neurometer(登録商標)と呼ばれる装置を用いた。この装置は過反応または反応低下の早期発見用に医学分野にて用いられている。
試験は、グロブラリアコルディフォリア抽出物クリームを用いた、培養細胞および移植片で見られたSOD生成の刺激を確認するために、老化の明らかな兆候を有するボランティアで行った(N=14)。
Claims (7)
- グロブラリアコルディフォリア植物の未分化細胞のインビトロの植物培養によって得られる抽出物、又は、前記抽出物と生理学的に許容される媒体とを含む組成物を、皮膚の非治療的な美容処理に用いる、
グロブラリアコルディフォリア植物由来の抽出物の使用。 - グロブラリアコルディフォリア植物の未分化細胞のインビトロの植物培養によって得られる抽出物、又は、前記抽出物と生理学的に許容される媒体とを含む組成物の使用であって、
前記抽出物は、未分化植物細胞株から、バイオマスを増加させる前培養工程と、誘発期が後に続く増殖期を含む、バイオリアクターにおける培養工程と、前記抽出物の回収工程とを含む方法であって、かつ前記バイオリアクターの工程における前記誘発期が、ショ糖および多量養素の欠損培地上で達成され、前記抽出物の前記回収工程が酸性pHの細胞溶解を含む方法によって得られ、
前記抽出物を、皮膚の非治療的な美容処理に用いる、
グロブラリアコルディフォリア植物由来の抽出物の使用。 - 前記細胞株は植物の葉から得られたものである、請求項2に記載の使用。
- 前記細胞株は番号DSM25009として寄託されている、請求項2または3に記載の使用。
- 前記処理を局所的に行う、請求項1〜4のいずれか1項に記載の使用。
- ホルミシス効果を得る反応によって、細胞内に蓄積される不要物を除去する解毒反応および/または細胞再生を刺激し、皮膚の老化を予防するおよび/または処理するための、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
- 請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用であって、以下に示される少なくともいずれか1つに用いるための使用;
・肌色の透明性および光輝性の改善、
・敏感肌および反応性肌の予防または処理、
・発赤の予防または処理、
・タンパク質の糖化の予防、
・真皮幹細胞の数の増加および/または維持、
・コラーゲンおよびエラスチンである真皮高分子の増加および/または維持、
・真皮容積の増加、
・小皺(fine lines)および皺(wrinkles)の予防および/または処理、並びに、
・皮膚の引き締め。
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