JP6403979B2 - カルボニル化度の評価方法 - Google Patents
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Description
本発明は、頭皮のカルボニル化度の評価方法に関するものである。
皮膚の最外層である角層においては、この角層を構成するタンパク質が酸化され易い状況にある。この酸化は、過酸化脂質の分解物であるアクロレインなどのアルデヒドのタンパク質への付加や、タンパク質への直接的な酸化ストレス作用によるカルボニル化によるものである。皮膚がカルボニル化したものであるかは、採取した角層の蛍光標識を行えば確認可能であると知られている。
ところで、特許文献１〜２には、皮膚のカルボニル化の確認に関する開示があるが、両文献共に、頭皮に着目した内容を開示していない。頭皮においても角層は存在し、頭皮のカルボニル化の状況を知ることができれば、今後の研究開発活動の一助になると考えられる。
本発明は、上記事情に鑑み、頭皮における角層のカルボニル化の程度を評価する方法の提供を目的とする。
本発明者等が鋭意検討を行った結果、頭部及び頸部の２か所以上から採取した角層のカルボニルタンパク質に蛍光物質を接触させた後、各々の角層に標識した蛍光物質の蛍光を対比すれば、頭皮のカルボニル化度の評価に適することを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明に係るカルボニル化度の評価方法は、頭部又は頸部から採取した角層（Ｉ）に対して、カルボニルタンパク質のカルボニル基を蛍光標識可能な蛍光物質を接触させる標識工程（Ｉ）、前記角層（Ｉ）の採取部位とは異なる頭部の部位から採取した角層（II）に対して、カルボニルタンパク質のカルボニル基を蛍光標識可能な蛍光物質を接触させる標識工程（II）、及び、前記標識工程（Ｉ）後の角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光と、前記標識工程（II）後の角層（II）に標識した蛍光物質の蛍光とを対比する対比工程、を備えることを特徴とする。
前記標識工程（Ｉ）及び前記標識工程（II）における蛍光物質は、ヒドラジノ基を備えるものであると良い。
本発明に係るカルボニル化度の評価方法において、前記角層（Ｉ）が頭部のネープ又は頸部から採取したものであり、前記角層（II）が頭部のトップ又はミドルから採取したものであると良い。好ましくは、前記角層（Ｉ）が頭部のトップ以外から採取したものであり、前記角層（II）が頭部のトップから採取したものである。頭部のトップに近づく程に紫外線により皮脂が過酸化脂質になり易くなると考えられるから、その過酸化脂質による角層（II）のタンパク質のカルボニル化が進行している場合には、対比工程で対比する傾向強度の差を確認し易くなる。
本発明に係るカルボニル化度の評価方法を、頭皮の老化指標として用いると良い。ここでは、本発明に係る評価方法における対比工程での結果が、老化指標の基礎となる。角層（Ｉ）と角層（II）のカルボニル化度の差は、年齢を重ねることに伴って生じやすくなる一般的傾向があることを見出しており、本発明の評価方法は、頭皮の老化指標の一つとして役立つ。
本発明に係るカルボニル化度の評価方法によれば、採取した角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光と、角層（Ｉ）とは異なる部位から採取した角層（II）に標識した蛍光物質の蛍光との対比を行うから、個人における頭皮のカルボニル化度の評価を行うことができる。
標識工程（Ｉ）、標識工程（II）、及び対比工程を備える本実施形態のカルボニル化度の評価方法に基づき、本発明を以下に説明する。
（標識工程（Ｉ））
標識工程（Ｉ）では、頭部又は頭部と胴体との間である頸部から採取した角層（Ｉ）に対して、蛍光物質を接触させる。
標識工程（Ｉ）では、頭部又は頭部と胴体との間である頸部から採取した角層（Ｉ）に対して、蛍光物質を接触させる。
ここで、頭部のトップ、ミドル、及びネープの各部位について、図３に従って説明を加える。先ず、トップとは、オーバーとも呼ばれる部分であり、頭頂からテンプルポイントを通過する水平線の間の領域である。テンプルポイントとは、前髪の生え際の１番飛び出している部分のことである。次に、ミドルとは、テンプルポイントを通過する水平線と、ぼんの窪みを通過する水平線との間の領域である。ぼんの窪みとは、後頭部のもっともくぼんだ部分のことである。最後に、ネープとは、ぼんの窪みを通過する水平線と、みつえりを通過する水平線との間の領域である。みつえりとは、えり足の両端の１番下がった部分のことである。
角層（Ｉ）の採取元となる頭部等の部位は、後記角層（II）とは異なるものとする。このように角層（II）に応じて角層（Ｉ）の採取元を決定すれば良く、角層（Ｉ）は、例えば頭部のネープ又は頸部（毛髪の生え際又はその周辺であると良い）から採取したものであると良く、頭部のトップ以外から採取したものであっても良い。
角層（Ｉ）を採取する方法は、角層を採取する方法として公知のものを採用すると良い。その公知の方法としては、セロハンテープなどの粘着テープを使用するテープストリッピングが挙げられる。テープストリッピングでは、角層（Ｉ）の採取元の皮膚に粘着テープを貼り付けてから剥がし、粘着テープに角層を付着させる。
本標識工程（Ｉ）で使用する蛍光物質は、カルボニルタンパク質のカルボニル基を蛍光標識可能な公知のものとする。例えば、カルボニル基と結合するヒドラジノ基（―ＮＨＮＨ２）を備えるフルオレセイン−５−チオセミカルバジド、テキサスレッドヒドラジド、ルシファーイエローヒドラジドなどが、標識工程（Ｉ）で使用する蛍光物質として挙げられる。
標識工程（Ｉ）では、例えば上記蛍光物質を溶解させた緩衝液に角層（Ｉ）を適宜な時間浸漬することで、角層（Ｉ）への蛍光物質の接触を行う。テープストリッピングで角層（Ｉ）を採取した場合には、粘着テープに付着したままの角層（Ｉ）に蛍光物質を接触させると良い。この接触後、カルボニルタンパク質を蛍光標識していない蛍光物質を洗浄除去すると良い。
（標識工程（II））
標識工程（II）では、角層（Ｉ）の採取方法と同様にテープストリッピングなどの公知の方法により頭部から採取した角層（II）に対して、標識工程（Ｉ）で使用する蛍光物質と同じ蛍光物質を、標識工程（Ｉ）と同様の方法により接触させると良い。この接触後、角層（II）のカルボニルタンパク質を蛍光標識していない蛍光物質を洗浄除去すると良い。
標識工程（II）では、角層（Ｉ）の採取方法と同様にテープストリッピングなどの公知の方法により頭部から採取した角層（II）に対して、標識工程（Ｉ）で使用する蛍光物質と同じ蛍光物質を、標識工程（Ｉ）と同様の方法により接触させると良い。この接触後、角層（II）のカルボニルタンパク質を蛍光標識していない蛍光物質を洗浄除去すると良い。
角層（II）は、角層（Ｉ）の採取元とは異なる部位から採取したものであれば、頭部のトップ、ミドル、及びネープのいずれから採取したものでも良い。例えば、角層（II）は、角層（Ｉ）が頭部のネープ又は頸部から採取したものである場合には、頭部のトップ又はミドルから採取したものであると良く、角層（Ｉ）が頭部のトップ以外から採取したものである場合には、トップから採取したものであると良い。角層（II）と角層（Ｉ）の採取部位を異にすることで、個人の頭皮におけるカルボニルタンパク質の分布を確認できる。また、年齢を重ねると、個人差はあるが、頭部のトップの角層は頭部のトップ以外の角層よりもカルボニルタンパク質が多くなる一般的傾向がある知見を得ており、頭部のトップから採取したものを角層（II）、頭部のトップ以外から採取したものを角層（Ｉ）とすれば、個人における頭皮の老化指標を定めやすい。
（対比工程）
対比工程では、上記標識工程（Ｉ）後の角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光と、上記標識工程（II）後の角層（II）に標識した蛍光物質の蛍光との対比を行う。
対比工程では、上記標識工程（Ｉ）後の角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光と、上記標識工程（II）後の角層（II）に標識した蛍光物質の蛍光との対比を行う。
上記の蛍光の対比は、蛍光顕微鏡による撮影像の蛍光輝度を目視対比することで行える。また、蛍光輝度を画像解析により算出できることは公知であるから、その画像解析による算出結果の対比をもって対比工程を行っても良い。
本実施形態のカルボニル化度の評価方法は、以上の通りである。当該方法を、頭皮の老化の指標として用いても良い。この指標は、対比工程までの実行による結果を用いるものであり、例えば次の（１）〜（３）の手順で行うものであり、（１）様々な年齢の個人の頭皮について、対比工程までの実行による結果を得る、（２）その結果に基づき、年齢、年代毎又は年齢層毎とカルボニル化度の線形回帰式を求めることで、頭皮老化の基準を設ける、（３）その基準を指標として、個人の頭皮老化（頭皮年齢）を定めるものである。
また、本実施形態の評価方法を、頭皮のカルボニル化の抑制や、頭皮老化の抑制のために有効となる成分のスクリーニングに使用することが考えられる。このスクリーニングは、例えば次の（１）〜（３）の手順で行うものであり、（１）対比工程までの実行による対比結果を得る、（２）有効成分となるかの確認を行う被験物質を含むもの（単一成分の溶液、複数成分を含む組成物やエキスなど）を、上記（１）で使用した角層の被採取者の頭皮に一回又は複数回塗布し、一定期間経過後に再び対比工程までの実行による対比を行う、（３）上記（１）の対比結果と上記（２）の対比結果を比較し、上記（２）の対比結果の方が、角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光と角層（II）に標識した蛍光物質の蛍光との輝度の差が小さいときには、被験物質を有効成分と判断するものである。なお、上記（２）の塗布部位は、カルボニル化が進行し易い頭部のトップが好ましい。
以下、実施例に基づき本発明を詳述するが、この実施例の記載に基づいて本発明が限定的に解釈されるものではない。
（カルボニル化度の評価）
以下の標識工程（Ｉ）、標識工程（II）、及び対比工程により、女性９０名の頭皮についてのカルボニル化度の評価を行った。
以下の標識工程（Ｉ）、標識工程（II）、及び対比工程により、女性９０名の頭皮についてのカルボニル化度の評価を行った。
標識工程（Ｉ）
頭部のネープにおける頭皮にセロハンテープを貼り付けて、当該テープに角層（Ｉ）を付着させた。このテープをスライドガラスに貼り付けてから、テープの粘着剤を溶解させるためにキシレンに１時間浸漬し、キシレンを蒸発させた。その後、テープが付いた状態のスライドガラスを、室温のフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが２０μＭである０．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ５．５）に１時間浸漬してから、カルボニルタンパク質を蛍光標識していないフルオレセイン−５−チオセミカルバジドをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。
頭部のネープにおける頭皮にセロハンテープを貼り付けて、当該テープに角層（Ｉ）を付着させた。このテープをスライドガラスに貼り付けてから、テープの粘着剤を溶解させるためにキシレンに１時間浸漬し、キシレンを蒸発させた。その後、テープが付いた状態のスライドガラスを、室温のフルオレセイン−５−チオセミカルバジドが２０μＭである０．１Ｍモルホリノエタンスルホン酸ナトリウム塩緩衝液（ｐＨ５．５）に１時間浸漬してから、カルボニルタンパク質を蛍光標識していないフルオレセイン−５−チオセミカルバジドをＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄した。
標識工程（II）
頭部の頭頂部における頭皮にセロハンテープを貼り付けて、当該テープに角層（II）を付着させた。これを、標識工程（Ｉ）と同様の浸漬と洗浄を行った。
頭部の頭頂部における頭皮にセロハンテープを貼り付けて、当該テープに角層（II）を付着させた。これを、標識工程（Ｉ）と同様の浸漬と洗浄を行った。
対比工程
標識工程（Ｉ）及び標識工程（II）後、角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光及び角層（II）に標識した蛍光物質の蛍光について、蛍光顕微鏡を使用して蛍光画像を取得すると共に、画像解析により蛍光輝度の平均値を算出した。
標識工程（Ｉ）及び標識工程（II）後、角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光及び角層（II）に標識した蛍光物質の蛍光について、蛍光顕微鏡を使用して蛍光画像を取得すると共に、画像解析により蛍光輝度の平均値を算出した。
図１は、上記取得した蛍光画像の例であり、上段、中段、下段の夫々は、同一人から採取した角層のカルボニル化度を評価したものである。図１においては、同一人であってもトップとネープの角層のカルボニル化度が異なることが、蛍光画像の輝度の相違から確認できる。
下記表１は、上記の算出した蛍光輝度の平均値であり、図２は、その平均値と角層提供者である女性の年齢との関係を表すグラフである。図２に記載の回帰直線によれば、年齢を重ねるに伴い、トップの蛍光強度（カルボニル化度）がネープよりも高まっている一般的傾向が認められる。このことは、頭皮老化の指標として本実施例の方法を使用できることを示す。
Claims (4)
- 頭部のネープ又は頸部から採取した角層（Ｉ）に対して、カルボニルタンパク質のカルボニル基を蛍光標識可能な蛍光物質を接触させる標識工程（Ｉ）、
前記角層（Ｉ）を採取した同一人における頭部のトップから採取した角層（ＩＩ）に対して、カルボニルタンパク質のカルボニル基を蛍光標識可能な蛍光物質を接触させる標識工程（ＩＩ）、及び、
前記標識工程（Ｉ）後の角層（Ｉ）に標識した蛍光物質の蛍光の蛍光輝度と、前記標識工程（ＩＩ）後の角層（ＩＩ）に標識した蛍光物質の蛍光の蛍光輝度とを対比する対比工程、を備え、
前記対比工程で対比した蛍光強度の差に基づきカルボニル化の進行を評価する
カルボニル化度の評価方法。 - 前記標識工程（Ｉ）及び前記標識工程（ＩＩ）における蛍光物質がヒドラジノ基を備えるものである請求項１に記載のカルボニル化度の評価方法。
- 頭皮の老化指標として用いる請求項１又は２に記載のカルボニル化度の評価方法。
- 頭皮のカルボニル化の抑制に有効となる成分のスクリーニング方法において使用される請求項１又は２に記載のカルボニル化度の評価方法。
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