JP5164681B2 - 口唇化粧料及び飴並びにチューイングガム - Google Patents
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Description
(2)カルボニル化タンパクにDNPHを作用させ、抗DNP抗体を用いて染色、発色させる方法(J.J.Thiele et al., J Invest Dermatol, 118:618-625,2002)
(3)カルボニル化タンパクにDNPHを作用させ、電気泳動により分離した後、抗DNP抗体を用いて染色、発色させるウェスタンブロッティング法(J.J.Thiele et al., J Invest Dermatol, 118:355-339, 1999)
(4)カルボニル化タンパクにDNPHを作用させ、ビオチン標識抗DNPを1次抗体として用い、2次抗体により染色させる方法(例えば、BioCell Co.,Ltd.,製のProtein carbonyl ELISA kitなどに代表される市販のカルボニル化タンパク検出キット)
(5)テープストリッピングにより角層を採取し、角層カルボニル化タンパクにFluorescein-5-thiosemicarbazideを作用させて蛍光染色する方法(特許文献1)
唾液によるカルボニル化タンパクの生成促進作用の抑制度を指標とする口唇荒れ防止剤のスクリーニング方法である。
試験に同意を得た26〜45歳の男女(男性11名・女性6名の計17名)にて、下記項目について評価した。被験者の口唇部位を洗顔料で洗浄後、20℃±1℃の環境下で20分間順化した後、測定を行った。
A.目視による荒れ評価
口唇部位をデジタルカメラ(OLYMPUS CAMEDIA DIGITAL CAMERA C-2500L)で撮影し、得られた画像を4段階に分類し(1:荒れなし、2:やや荒れ、3:荒れ、4:かなり荒れ)、目視評価スコアとした。
姫野らの方法(非特許文献4)に従って、UVウッドランプBM-FEK04(タカラベルモント社製)を用いて口唇部のUV照射画像を撮影した。得られた画像の口唇中央部をPhotoshop6.0(Adobe社製)にて閾値60で2値化し、白色面積値をUV照射蛍光値とした。
C.有核細胞数
口唇角層をテープストリッピングにより採取し、ヘマトキシリン・エオシン染色を行った。下唇中央部内側(粘膜側)、下唇中央部外側(皮膚側)の2ヶ所を、正立顕微鏡(OLYMPUS BX60)にて、倍率200倍で撮影し、4段階に分類し(1:なし、2:やや有核、3:50%程度有核、4:全て有核)、有核細胞スコアとした。ここで、下唇中央部内側(粘膜側)とは、下唇を上下にほぼ2分した場合の上部側、粘膜部位に近い部位を意味し、下唇中央部外側(皮膚側)とは、その下部側、顎に近い部位を意味する(以下同じ)。
C.の撮影画像を4段階に分類し(1:重層なし、2:やや重層、3:かなり重層、4:全て重層)、重層スコアとした。
特許文献1に記載された方法に従い、テープストリッピングした角層のタンパクのカルボニル基を蛍光ヒドラジドでラベル化した。蛍光顕微鏡(OLYMPUS BX60、BX-FLA)にて蛍光画像を倍率100倍で撮影した。撮影部位は下唇中央部内側、下唇中央部外側であり、特許文献1に記載の方法に従って得られた画像の輝度をカルボニル化レベルとした。
1.角層、唾液の採取
試験に同意を得た26〜31歳の健常な男女(男性3名・女性7名の計10名)より、下唇の角層をテープストリッピングにより採取し、下唇の縦方向に4等分した。また、被験者の内2名(28歳女性)より唾液採取用チューブサリベット(Sarstedt社製)を用いて唾液を採取し、遠心分離(1000g、2分間)した(唾液A、B)。採取した唾液Aをオートクレーブ処理(120℃、15分間)して唾液OAを得た。そして、口唇の場合と対比するため、被験者の内2名(28歳女性) の上腕内側よりテープストリッピングにより腕の角層を採取し、2等分した。
上記4等分した下唇角層の1つの区分に10μLの水(ブランク)、残り3区分にそれぞれ10μLの唾液A、唾液B、唾液OAを作用させ、37℃で30分間インキュベートした後、水で洗浄し、上記Eと同様の方法で蛍光染色した。画像撮影は倍率40倍で下唇外側(皮膚側)について2枚ずつ行った。各被験者のブランクのカルボニル化レベルを1.0として、各群について得られた画像のカルボニル化レベルを相対的に算出した値をカルボニル化相対値とした。腕より採取した角層についても、10μLの水(ブランク)、唾液Aを作用させ、同様に蛍光染色し、倍率100倍で画像撮影を行った。
1.角層サンプル
試験に同意を得た26〜31歳の健常な男女パネラー(男性3名・女性7名の計10名)より、下唇の角層をテープストリッピングにより採取した。
唾液採取用チューブサリベット(Sarstedt社製)を用いて、口唇が荒れている被験者の内1名(28歳女性)より唾液を採取し遠心分離(1000g、2分間)した。
西洋バラ(Rosa Centifolia)を用いて、次の製造方法に従い、西洋バラ色素エキス(粉末)及び西洋バラ脱色素エキス(粉末)を得た。
サンプルA:西洋バラ色素エキス2w/v%水溶液(粉末含有量0.02w/v%)
サンプルB:西洋バラ色素エキス0.5w/v%水溶液(粉末含有量0.005w/v%)
サンプルC:西洋バラ脱色素エキス10%水溶液(粉末含有量0.1w/v%)
あらかじめ、10名のパネラーのうち女性2名より採取した角層を用いて、ブランク(水)とサンプルA,B,Cを角層に塗布し、唾液を塗布しない場合、カルボニル化相対値に差がみられないことを確認した。次いで、残るパネラー8名より採取した角層を唇縦方向に3等分し、ブランク群には10μLの水を塗布し、スクリーニング群とコントロール群には10μLの唾液を塗布した。その後、ブランク群及びコントロール群の2群には10μLの水を塗布し、スクリーニング群に上記のサンプル10μLを塗布し、37℃で30分間インキュベートした。得られたサンプルを水で洗浄し、上記Eの方法に準じて蛍光染色を行い、得られた画像の評価を行った。画像撮影は下唇外側(皮膚側)について正立顕微鏡(OLYMPUS BX60)を用いて倍率40倍で2枚ずつ行った。各群について得られた画像のカルボニル化レベルを、各被験者のブランクのカルボニル化レベルを1.0として相対的に算出した値をカルボニル化相対値とした。それらの結果を図6に示す。西洋バラ色素エキスは、唾液によるカルボニル化タンパク生成促進作用を抑制する効果を有することが確認された。
次に、西洋バラ色素エキス(粉末)を用いて下記処方によりテスト用口紅及び対照用口紅(西洋バラ色素エキスの代わりにセレシンワックスで処方を調整したもの)を準備し、口唇が荒れている26〜28歳の女性パネラー4名(テスト群2名・プラセボ群2名)に、普段の使用と同じようにして2週間使用してもらい、使用開始時、使用開始後1週間後、2週間後に上記Eの方法にてカルボニル化タンパクの測定とアンケートによる改善効果でその効果を評価した。試験前にアンケートにてA.かさつき、B.皮めくれについて(1:かなり悪い、2:悪い、3:やや悪い、4:普通、5:やや良い、6:良い、7:かなり良い)の7段階で唇の状態を評価した。アンケートによる改善効果項目は、A.かさつき、B.皮めくれとし、各項目について、7段階(1:かなり悪くなった、2:悪くなった、3:やや悪くなった、4:変わらない、5:やや改善された、6:改善された、7:かなり改善された)のスコアとした。なお、アンケート評価では、口紅の使用頻度は一日に2〜5回であった。
セレシンワックス 16(質量%)
マイクロクリスタリンワックス 4.4
スクワラン 20
軽質流動イソパラフィン 28
重質イソパラフィン 7
トリイソステアリン酸ポリグリセリル 21.258
赤色202号 0.11
黄色5号 0.18
酸化鉄 0.152
酸化チタン 0.6
パール粉体 2.2
バラ色素エキス 0.1
計 100.000
上記成分の内、色顔料(赤色202号、黄色5号、酸化鉄、酸化チタン)とトリイソステアリン酸ポリグリセリルを3本ロールにて混合する。その後、残る成分を90〜100℃で加熱溶融し、攪拌、脱泡したものを型に流し込み、冷却して口紅を成型した。
アンケートによる改善効果を表1に、テスト群のパネラー1名の口唇状態を示す写真を図7に、プラセボ群のパネラー1名の口唇状態を示す写真を図8に示す。また、カルボニル化レベルの測定に用いたテスト群パネラーの角質細胞の蛍光染色画像を図9に示す。
(飴)
砂糖 81.0g
D−グルコース 16.5g
クエン酸 1.1g
香料 適 量
色素 適 量
バラ色素エキス 0.1g
上記成分を採り、100〜120℃で原料を加熱溶解し、金型にて固化させる。
バラ色素エキス 0.5g
炭酸水素ナトリウム 2.0g
白糖末 4.0g
アラビアゴム 3.0g
デキストリン 1.0g
水又は単シロップ 適 量
上記成分分量を採り研和して細末とし、水または単シロップを少量ずつ加え、これを型に注入して20個に分割する。白糖末を剤衣とする。
ガムベース 20.0g
砂糖 78.5g
バラ色素エキス 0.1g
ハッカエキス 1.0g
水 適 量
上記成分分量を採り常法にてチューイングガム20枚を製造する。
Claims (2)
- 唾液を加えた状態で口唇の角質細胞のカルボニル化タンパクの存在量(C)を測定するステップと、
唾液及び被検物質を加えた状態で口唇の角質細胞のカルボニル化タンパクの存在量(A)を測定するステップを有し、
唾液によるカルボニル化タンパクの生成促進作用の抑制度を指標とする口唇荒れ防止剤のスクリーニング方法。 - 口唇化粧料又は飴、チューイングガムの製造方法であって、
請求項1に記載のスクリーニング方法を用いて唾液によるカルボニル化タンパクの生成促進作用を抑制する成分をスクリーニングする工程と、
前記スクリーニングによって、唾液によるカルボニル化タンパクの生成促進作用の抑制が認められた成分を含有させる工程を有する製造方法。
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