CN110354028A - 一种高山火绒草提取物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高山火绒草(Leontopodium nivale)提取物的应用,具体为高山火绒草提取物在制备人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂中的应用。将高山火绒草提取物应用于人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂的制备,起到调节col4al基因的表达以及稳定人皮肤基底膜结构的作用;特别地,当人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂高山火绒草提取物的浓度为8μg/ml时,在皮肤模型中与基底膜稳定相关的col4a1基因表达上调1.54倍,因此能够促进基底膜结构稳定,进而达到抗衰老的功效。
Description
技术领域
本发明涉及化妆品领域,具体涉及一种高山火绒草提取物的应用。
背景技术
高山火绒草(Leontopodium alpinum)——又名雪绒花。是菊科,火绒草属的植物。又叫做高山薄雪草、小白花。是欧洲很有名的高山花卉。
高山火绒草包括其提取物特别是醇提取物的主要应用价值包括临床应用和美容功效。尤其是美容功效,在近几年研究颇多,然而主要集中于美白、舒缓、镇静以及保湿等功效的研究(CN 107106478A,CN 105411900A)。
皮肤被覆盖于整个人体表面,与外界环境直接接触,除了保护机体免受外界各种因素的伤害外,又是反应全身健康状态的一面镜子。皮肤由表皮、真皮、皮下组织构成,并含有皮肤附属器、丰富的神经、血管、淋巴管及肌肉。在真皮和表皮的连接区域又称为基底膜带,不仅是一层结构模型,而且具有多方面的功能,基底膜是上皮细胞的支撑垫,在上皮细胞组织与结缔组织之间起结构连接作用,同时,还具有其他方面的作用。比如,基底膜作为细胞的选择性通过屏障,通常可以阻止结缔组织细胞与基底膜上的上皮细胞接触,但允许淋巴细胞、巨噬细胞和神经元突触穿越通过;此外,细胞的形态、细胞的极性、细胞代谢、质膜上蛋白质的分布、细胞存活、细胞的增殖分化、细胞迁移等许多生命现象,均与基底膜有着非常密切的关系。
Col4a1该基因编码IV型胶原α蛋白。IV型胶原蛋白是基底膜的组成部分。该基因在相反链上共享具有旁系同源基因的双向启动子。该蛋白由氨基末端7S结构域,形成胶原结构域的三螺旋和羧基末端非胶原结构域组成。它作为异源三聚体的一部分起作用,并与其他细胞外基质组分例如蛋白聚糖和层粘连蛋白相互作用。该基因基因表达上调能够促进DEJ的完整性,延缓皮肤衰老(Ogura Y,Kadoya K,Matsunaga Y,et al.Basement membraneformation is enhanced by typeⅣandⅦcollagen-increasing factor,beech budextract and an inhibitor of the urokinase-plasmin system,peppermint extract[J].J Jpn Cosmet Sci Soc,2005,29(1):1-8.;张丽丽李贤玉.皮肤中基底膜的结构与功能.中国美容医学2016年10月第25卷第10期;Rongzhong Jin,Jia Shen al.The highlyexpressed COL4A1genes contributes to the proliferation and migration of theinvasive ductal carcinomas.Oncotarget,2017,Vol.8,(No.35);MANFREDWEBER.Basement membrane proteins.Kidney International,Vol.41(1992),pp.620—628)。
因此,研究如何提高皮肤关键部位及功能相关的基因的表达,对于提高皮肤真表皮结构的稳定性,延缓皮肤衰老具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是针对现有技术中缺乏提高基底膜相关基因表达能力、并且可用于稳定皮肤结构的物质的问题,提供一种高山火绒草提取物的应用。所得到的表达上调剂可以诱导基底膜稳定相关的基因的表达,提高皮肤的结构的稳定,并且可以延缓衰老。
高山火绒草具有高度的自御能力,能抵抗恶劣的天气及其他生长环境。其精华成分蕴含丰富的矿物质,对肌肤具舒缓、镇静、美白及滋养保护作用。本发明人意外发现高山火绒草的提取物可以上调col4al基因的表达,创造性地将其应用于人皮肤中col4al基因的表达上调剂以及人皮肤基底膜结构稳定剂的制备。
本发明主要通过以下技术手段解决上述技术问题:
本发明提供一种高山火绒草提取物在制备人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂中的应用。
所述的高山火绒草提取物可为本领域常规的高山火绒草提取物,较佳地为高山火绒草醇提取物,更佳地为高山火绒草C1~C5醇提取物,进一步更佳地为高山火绒草乙醇提取物,所述的乙醇较佳地为70~95%乙醇。
所述的高山火绒草提取物较佳地通过下述方法制得,所述的方法包括:
(1)粉碎高山火绒草得粉末;所述的高山火绒草较佳地为高山火绒草全草;
(2)加入乙醇进行提取,过滤,得滤液;所述的提取的温度较佳地为室温,所述的室温为20-30℃;
(3)蒸发滤液,即得;所述蒸发的程度为蒸发至干。
其中,为了能够更加高效地提取高山火绒草中的有效成分:步骤(1)中所述的粉末的目数较佳地为20~60目;步骤(2)中所述的乙醇较佳地为70%乙醇;所述乙醇的添加量较佳地为所述粉碎后的高山火绒草的体积的8-12倍,更佳地为10倍;所述的提取的次数较佳地为1次以上,更佳地为2次;所述的提取较佳地为超声提取,所述超声的频率较佳地为400-550W,更佳地为500W;所述超声的时间较佳地为25-40min,更佳地为30min。
步骤(2)中所述的过滤的方法较佳地为离心,所述离心的速度较佳地为6000-10000rpm,更佳地为8000rpm;所述离心的时间较佳地为8-12分钟,更佳地为10分钟。
在本发明一较佳实施例当中,所述的高山火绒草提取物通过下述方法制得,所述的方法包括:
(1)将干燥的高山火绒草全草粉碎,得粉末,所述粉末的目数为20目;
(2)加入10倍于所述粉末的体积的70%乙醇于室温下进行500W超声提取2次,每次30min,离心过滤后将滤液合并;所述离心的速度为8000rpm,所述离心的时间为10分钟;
(3)滤液旋转蒸发至干,即得。
利用上述方法制备得到的高山火绒草提取物在所述的人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者所述的人皮肤基底膜结构稳定剂中的浓度较佳地为8-12μg/ml;更佳地为10μg/ml。
其中,所述的人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂可以适用于化妆品或者护肤品中。
在符合本领域常识的基础上,上述各优选条件,可任意组合,即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于:
本发明将高山火绒草提取物应用于人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂的制备,起到调节col4al基因的表达以及稳定人皮肤基底膜结构的作用;特别地,当人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂高山火绒草提取物的浓度为10μg/ml时,在皮肤模型中与基底膜稳定相关的col4a1基因表达上调1.54倍,因此能够促进基底膜结构稳定,进而达到抗衰老的功效。
附图说明
图1为col4a1基因表达结果。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明,但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,按照常规方法和条件,或按照商品说明书选择。
实施例1高山火绒草提取物的生产
高山火绒草提取物选用市售产品,也可以根据现有技术自行制备。
取干燥的高山火绒草全草10g,使用小型药材粉碎机(屹立4两中药粉碎机)粉碎至20目左右,于室温下以10倍体积的70%乙醇500W超声提取2次,每次30min,离心(8000rpm,10min)过滤,滤液合并,滤液旋转蒸发至干,得到高山火绒草提取物约1.4g。
实施例2皮肤模型的制备
从皮肤组织中分别提取人原代成纤维细胞(NHDF)及人原代角质细胞(NHEK)(提取方法参考文献:伍津津,朱堂友.皮肤组织工程[M].北京:人民军医出版社,2009:72-103)。将人原代成纤维细胞复苏,复苏过程为:将冷冻管从液氮中取出,迅速投入37℃水浴融化,离心机1000rpm/min离心10min。将复苏所得细胞使用DMEM培养基在37℃的二氧化碳培养箱中培养一周后,进行消化(将细胞从培养箱中取出,吸弃原培养基,加PBS 15mL润洗细胞一次,加8mL 0.05%胰蛋白酶后,于37℃的二氧化碳培养箱中孵育8min,取出,超净台中加10mL含FBS的DMEM培养基,移液枪取出细胞于50mL离心管中,离心机中1000rpm,离心10min后弃上清,细胞待用)后与胶原混合进行真皮阶段培养,于37℃的二氧化碳培养箱中培养3~4天,然后将使用饲养层培养的人原代角质细胞,消化接种(5×104个细胞)到真皮阶段的皮肤模型表面,依次经过表皮浸没培养及气液相培养阶段,培养至18天得到可用于检测的3D皮肤模型(制备皮肤模型的具体步骤详见ANNIE F.BLACK,Ph.D.CHARBEL BOUEZ,al.Optimization and Characterization of an Engineered Human SkinEquivalent.TISSUE ENGINEERING Volume 11,Number 5/6,2005.Mary Ann Liebert,Inc.)。
实施例3皮肤模型的测试
用实施例1制备得到的高山火绒草提取物蒸干粉以Hyclone DMEM培养基为溶剂配置终浓度为1mg/mL的高山火绒草提取物溶液,当实施例2制备得到的皮肤模型培养至3天时加入提取物溶液(高山火绒草提取物的终浓度为10μg/ml),并以未加提取物溶液的模型为对(NT),18天后提取测试组和对照组皮肤模型中RNA进行检测。
实施例4RNA的提取
剪取组织约2*3mm,放入2mL EP管中;加入1mL Trizol,加入2颗钢珠,用组织破碎仪匀浆,50Hz,5min;9000rpm于4℃离心1min,将上清液转移到新的1.5mL EP管中;加入200ul氯仿,轻轻颠倒数次混匀,室温放置5分钟;9000rpm于4℃离心15min;转上层水相(约400μl)于新1.5mlEP管中,加入等体积的异丙醇,混匀,室温静置10min;9000rpm 10min 4℃;弃上清,沉淀用预冷的70%无水乙醇洗1次,8000rpm 5min 4℃;弃上清,空气干燥5-10分钟,溶于30ul DEPC水中;分光光度计测定RNA浓度。
实施例5基因表达分析
根据QuantiGene R 2.0Plex Assay试剂盒进行RNA的纯化和基因定量分析,使用luminex平台对基因表达进行分析。
结果表明:添加高山火绒草水提取物后,在皮肤模型中与基底膜稳定相关的col4a1基因表达上调1.54倍(见图1),说明该提取物有促进基底膜结构稳定的作用,进而达到抗衰老的功效。
Claims (10)
1.高山火绒草(Leontopodium nivale)提取物在制备人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者人皮肤基底膜结构稳定剂中的应用。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的高山火绒草提取物为高山火绒草醇提取物;较佳地为高山火绒草C1~C5醇提取物;更佳地为高山火绒草乙醇提取物,所述的乙醇较佳地为70~95%乙醇。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述的高山火绒草提取物通过下述方法制得,所述的方法包括:
(1)粉碎高山火绒草得粉末;所述的高山火绒草较佳地为高山火绒草全草;
(2)加入乙醇进行提取,过滤,得滤液;所述的提取的温度较佳地为室温,所述的室温为20-30℃;
(3)蒸发滤液,即得;所述蒸发的程度为蒸发至干。
4.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(1)中所述粉末的目数为20~60目。
5.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(2)中所述的乙醇为70%乙醇,所述乙醇添加量为所述粉碎后的高山火绒草的体积的8-12倍,较佳地为10倍;
和/或,步骤(2)中所述的提取的次数为1次以上,较佳地为2次。
6.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(2)中所述的提取为超声提取,所述超声的频率较佳地为400-550W,更佳地为500W;
和/或,所述超声的时间为25-40min,较佳地为30min。
7.如权利要求3所述的应用,其特征在于,步骤(2)中所述的过滤的方法为离心,所述离心的速度较佳地为6000-10000rpm,更佳地为8000rpm,所述离心的时间较佳地为8-12分钟,更佳地为10分钟。
8.如权利要求2~7任一项所述的应用,其特征在于,所述的高山火绒草提取物通过下述方法制得,所述的方法包括:
(1)将干燥的高山火绒草全草粉碎,得粉末,所述粉末的目数为20目;
(2)加入10倍于所述粉末的体积的70%乙醇于室温下进行500W超声提取2次,每次30min,离心过滤后将滤液合并;所述离心的速度为8000rpm,所述离心的时间为10分钟;
(3)滤液旋转蒸发至干,即得。
9.如权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的高山火绒草提取物在所述的人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者所述的人皮肤基底膜结构稳定剂中的浓度为8-12μg/ml;较佳地为10μg/ml。
10.如权利要求1~9任一项所述的应用,其特征在于,所述的人皮肤中col4al基因的表达上调剂或者所述的人皮肤基底膜结构稳定剂适用于化妆品或者护肤品中。
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