ITMI20130529A1 - Processo di produzione di cellule meristematiche di plantago lanceolata, composizione comprendente dette cellule o il loro estratto cellulare e l'utilizzo cosmetico, nutraceutico e dermatologico - Google Patents

Description

“PROCESSO DI RIPRODUZIONE DI CELLULE MERISTEMATICHE DI PLANTAGO LANCEOLATA, COMPOSIZIONE COMPRENDENTE DETTE CELLULE O IL LORO ESTRATTO CELLULARE E

L’UTILIZZO COSMETICO, NUTRACEUTICO E DERMATOLOGICO.” La presente invenzione si riferisce alla preparazione di cellule meristematiche a partire da una nuova linea cellulare di Plantago lanceolata, a cellule così ottenute, a un estratto di dette cellule, a composizioni che le contengono e ai loro utilizzi nei settori cosmetico, nutraceutico e dermatologico.

La presente invenzione riguarda più specificamente l'industria dei cosmetici e dei prodotti d'igiene e di cura personale, che si applicano alla pelle e alle sue fanere (come peli, ciglia, sopracciglia, unghie, capelli) di mammiferi, animali o umani.

La Plantago lanceolata è una pianta erbacea longeva della famiglia delle Plantaginaceae che cresce in tutti i climi temperati di Europa e Asia centrosettentrionale. Essa è denominata anche plantano lanceolato, plantano stretto o « Erba a cinque nervature o a cinque coste ». Essa è nota da sempre per le sue proprietà medicinali, antitosse, antinfiammatorie, anti-irritanti, bechiche, espettoranti, cicatrizzanti, antisettiche esterne e antibiotiche. Queste proprietà possono essere attribuite ai diversi composti sintetizzati dalla pianta e che possono essere estratti delle varie parti della pianta, e in funzione del modo d'estrazione e del solvente utilizzati. È stato riportato che nella Plantago lanceolata si potevano trovare in particolare eterosidi iridoidi, fenilpropanoidi glicosidici, mucillagini, flavonoidi, acidi fenolici, tannini, saponosidi e oli essenziali. Gli estratti possono essere ottenuti tramite metodi d'estrazione classici direttamente a partire da parti della pianta oppure mediante metodi di coltura in vitro di cellule meristematiche (o cellule dedifferenziate). I metodi in vitro hanno in particolare i vantaggi di potersi affrancare dalle fluttuazioni legate alle condizioni di coltura e di poter stimolare in modo riproducibile la produzione tramite le cellule vegetali di metaboliti secondari di interessi particolari, che avevano altrimenti rese basse, come nel caso presente i fenilpropanoidi glicosidici. Il profilo e le quantità di composti bioattivi presenti nelle cellule ottenute grazie a questi metodi in vitro saranno diversi da quelli ottenuti dalle altre tecniche d'estrazione, le cellule non differenziate non essendo in grado di produrre tutti i metaboliti secondari e le culture potendo essere vantaggiosamente orientate verso la produzione di metaboliti secondari scelti. Un estratto cellulare o una coltura di cellule meristematiche, inevitabilmente, non avrà dunque alla fine le stesse attività di un altro tipo d'estratto, in particolare un estratto vegetale non realizzato tramite coltura cellulare.

Questi metodi in vitro consistono schematicamente:

- se necessario in un primo tempo, nello stabilire linee cellulari a partire da callosità (ammassi di cellule indifferenziate) ottenuti su tagli di parti di piante (foglio, radice, stelo....) ; - selezionare una linea cellulare capace di produrre su vasta scala una biomassa di cellule meristematiche secondo criteri prestabiliti (fenotipo costante e produzione ottimale e costante di metaboliti selezionati, capacità di proliferare);

- poi a partire da questa linea selezionata:

generazione di detta biomassa cellulare, eventualmente con una fase di elicitazione; e infine

- in un terzo tempo, trattamento della biomassa cellulare ottenuta per recuperare le cellule meristematiche intere e se necessario estrarre in seguito il contenuto delle cellule.

Sono questi estratti e/o cellule intere o parzialmente frantumate che sono in seguito utilizzati in particolare in composizioni cosmetiche, dermatologiche e/o nutraceutiche.

La domanda di brevetto EP2319914 descrive questa tecnica per ottenere cellule meristematiche con una resa elevata di derivati d'acido caffeico per una lista teorica di 33 specie di piante tra cui Plantago lanceolata. I derivati d'acido caffeico interessati comprendono fenilpropanoidi glicosidici e acidi caffeoilchinici. Risultati di test sono forniti solo per 5 specie e ciascuno per un’attività diversa: le specie Buddleja davidii (attività antiossidante), Leontopodium alpinum (attività inibitrice dell'ialuronidasi), Lippia citriodora (attività antiinfiammatoria), Gardenia jasminoidi (attività inibitrice della collagenasi) e Echinacea angustifolia (attività sulla stimolazione di collagene).

Le proprietà dei fenilpropanoidi glicosidici sono state in gran parte descritte, soprattutto le proprietà antiossidanti e antinfiammatorie che possono essere valorizzate nei settori della cosmetica, della dermatologia e della nutraceutica. La presente invenzione ha lo scopo di proporre un materiale biologico vegetale a partire da una pianta di tipo Plantago lanceolata che permette di ottenere su scala industriale, cioè in modo riproducibile, tramite coltura cellulare in vitro una composizione che presenta attività notevoli, in particolare legate alla presenza di fenilpropanoidi glicosidici.

A questo scopo, propone un metodo di fabbricazione in vitro di cellule meristematiche di Plantago lanceolata contenente fenilpropanoidi glicosidici a partire da una linea cellulare stabilizzata, caratterizzato dal fatto che la linea cellulare è la linea selezionata IRB PL3.

Questa linea è stata oggetto di un deposito di DSMZ (Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen Und Zellkulturen GmbH, Inhoffenstraße 7B, 38124 Braunschweig, Germania) da parte della società IRB Richiedente con questo riferimento provvisorio: Plantago lanceolata IRB PL3.

Le cellule meristematiche così ottenute sono arricchite di fenilpropanoidi glicosidici, perlopiù di plantamaioside. La proporzione in peso di fenilpropanoidi glicosidici totali nella biomassa liofilizzata, valutata tramite spettrometria UV a 330nm, espressa in equivalente plantamaioside, è di circa il 10%. Proteine, aminoacidi, lipidi e polisaccaridi sono stati anch’essi identificati come categorie di composti nelle cellule secondo l'invenzione.

La selezione e l'utilizzo della linea cellulare Plantago lanceolata IRB PL3 permette di ottenere cellule meristematiche che conducono vantaggiosamente a risultati inattesi e notevoli a tutti i livelli della pelle: derma, giunzione derma/epidermide (JDE) ed epidermide, come pure risultati notevoli antiinfiammatori, antiossidanti e antiglicazione, permettendo di considerare applicazioni nei settori considerati secondo l'invenzione. È stato anche evidenziato che i prodotti ottenuti con cellule secondo l'invenzione agivano vantaggiosamente su un certo numero di micro-RNA. I micro-RNA sono prodotti dalla cellula a partire dal DNA, come RNAm, e svolgono un ruolo determinante nel controllo di molti processi fisiologici inibendo la sintesi di proteine specifiche. I risultati sul micro-RNA vanno a consolidare le applicazioni considerate e ad aprire altre prospettive.

In vivo, l'applicazione del prodotto secondo l'invenzione ha permesso un miglioramento della qualità del derma, che appare allo stesso tempo più sodo, più elastico (cutometria), più spesso (ecografia), un effetto benefico sulle macchie di senescenza (analisi per fotografie della chiarezza della pelle, con il software Colorskin TM), un ispessimento dell'epidermide (microscopia confocale laser/Vivascope TM), una pelle più densa (Reviscometer TM), una lisciatura del rilievo cutaneo (digitalizzazione di impronte e analisi di immagini). Gli effetti osservati con il prodotto secondo l'invenzione, sia in vitro che in vivo conducono a posizionarlo vantaggiosamente come un antietà generale.

La presente invenzione propone anche in modo più ampio l'utilizzo di cellule di Plantago lanceolata per compattare il derma, rafforzare la giunzione dermoepidermica, ispessire l'epidermide e/o portare alla pelle mezzi di difesa anti-antiglicazione.

I risultati sono presentati qui di seguito nella descrizione.

Il metodo secondo l'invenzione può essere realizzato secondo le fasi seguenti:

- a partire dalla linea Plantago lanceolata IRB PL3, produrre una pre-biomassa critica mediante pre-culture successive e di dimensioni crescenti;

- produrre una biomassa di dette cellule meristematiche in un bioreattore a partire da detta pre-biomassa e un terreno di coltura adeguato; e

- separare detta biomassa arricchita in fenilpropanoidi glicosidici di detto terreno di coltura e recuperare così dette cellule meristematiche.

Secondo altre caratteristiche:

- la fase di produzione in bioreattore comprende una fase d'elicitazione, ciò permettendo vantaggiosamente di aumentare il contenuto di plantamaioside e più generalmente di fenilpropanoidi glicosidici (PPG); e/o

- si raccoglie la biomassa derivata dal reattore mediante filtrazione dopo un tempo di coltura tra 7 e 21 giorni; preferibilmente tra 10 e 14 giorni, il che permette vantaggiosamente di produrre maggiore quantità di biomassa, con una grande vitalità; e/o

- una fase supplementare d'essiccazione della biomassa di cellule meristematiche separata del terreno di coltura, il che permette vantaggiosamente di testarne l’attività biologica e l’accumulo a lungo termine, senza dover aggiungere conservanti.

Generalmente, l'elicitazione dei composti d'interesse può essere realizzata tramite aggiunta alla coltura di frazioni microbiche (in particolare dei lieviti saccharomyces) : l'aggiunta alla coltura di molecole d'origine biologica come ad esempio chitosano, metil jasmonato, acido jasmonico, acido salicilico; l'aggiunta alla coltura di molecole d'origine non biologica come ad esempio paclobutrazolo; l'applicazione alla coltura di una variazione di temperatura, di pH o di uno stress osmotico indotto da uno zucchero non metabolizzabile, come ad esempio il mannitolo; il ricorso a un impoverimento ancora più drastico del mezzo in macroelementi e zucchero; l'aggiunta alla coltura di resine adsorbenti che oltre ad elicitare la produzione dei composti d'interesse potranno intrappolarli.

Preferibilmente secondo l'invenzione, l'elicitazione è realizzata modificando il terreno di coltura, in particolare i tassi di sostanze nutrienti.

La presente invenzione riguarda anche la linea selezionata Plantago lanceolata IRB PL3 e le cellule meristematiche di Plantago lanceolata ottenute grazie a questa linea e il metodo dell'invenzione descritto qui sopra e un estratto cellulare ottenuto a partire da dette cellule, estratto realizzato ad esempio grazie a una lisi cellulare, quindi una fase di centrifugazione seguita da una filtrazione, in modo da recuperare l'interno delle cellule ed eliminare le pareti cellulari.

La presente invenzione propone anche una composizione comprendente cellule meristematiche di Plantago lanceolata o un estratto cellulare secondo l'invenzione tra un mezzo fisiologicamente accettabile e utilizzi cosmetici, nutraceutici o dermatologici di questa composizione, di dette cellule o di detto estratto cellulare.

Utilizzi cosmetici secondo l'invenzione

I micro-RNA (o miRNA) sono stati scoperti nel 1993, e da allora hanno visto il proprio ruolo delinearsi e crescere in pochi anni. I miRNA sono numerati nell'ordine della loro scoperta, formano una classe estremamente diversa dai piccoli RNA (20-25 nucleotidi) non codificanti. I miRNA sono prodotti dalla cellula a partire dal DNA, come l’RNAm, e svolgono un ruolo determinante nel controllo di molti processi fisiologici inibendo in modo specifico la sintesi di alcune proteine. Una volta prodotto, il miRNA va ad attaccarsi all'inizio di un RNAm che è dedicato, l'informazione portata dal RNAm diviene allora illeggibile per il ribosoma o diventa il bersaglio di proteine frantumatrici. Questi fenomeni di controllo post-genetico costituiscono veri interruttori naturali. Potrebbero riguardare almeno il 30% della produzione dei geni. Alcuni miRNA, soppressori delle sintesi di collagene I, d'elastina e di TIMP o attivatori delle attività dei MMP sono stati identificati. Alcuni altri miRNA determinano la comparsa di fenotipi senescenti, in fibroblasti in particolare.

La modulazione dell'espressione di questi interruttori costituisce dunque una via vantaggiosa in una strategia antietà per rilanciare alcune sintesi proteiche e rallentare la senescenza cellulare.

Con l'età, la pelle si modifica, si affina, diventa meno densa, meno soda e si rilascia. Essa altresì si macchia, zone più pigmentate appaiono e poi si ingrandiscono. Lo stile di vita aggrava più o meno ampiamente i danni che la pelle subisce: le esposizioni solari, il tabagismo, l'inquinamento urbano e un'alimentazione inadeguata condurranno ad accelerare l'invecchiamento cronologico degli organi e della pelle. Alla base di queste modifiche macroscopiche esiste una disorganizzazione a livello tessutale e cellulare. L'invecchiamento è caratterizzato da una successione di “derive” rispetto a uno stato precedente che permetteva di avere una pelle giovane (omeostasi).

Così, la perdita di densità e l’affinamento del derma sono legati a una riduzione delle sintesi delle macromolecole (in particolare collagene I, collagene IV, elastina, acido ialuronico) per i fibroblasti dermici, cellule responsabili della loro fabbricazione. In parallelo, un aumento della produzione di metalloproteinasi matriciale (MMP) concomitante con la riduzione della produzione dei loro inibitori naturali, i TIMP (Tissue Inhibitor Of Metalloproteinase), conducono a una frammentazione e a un deterioramento maggiore di queste stesse macromolecole.

L'aumento dell'attività di deterioramento dei MMP e la riduzione delle sintesi proteiche si fa così sentire a livello della giunzione tra il derma e l'epidermide (JDE) dove si trovano proteine importanti per la pelle. Il collagene IV è una di queste proteine. È organizzato in una feltratura fine dove si agganciano altri elementi essenziali all'omeostasi cutanea come le laminine. Con l'età è più frammentato e allo stesso tempo meno prodotto, proprio come le laminine, cosa che causa in alcune zone comunicazione meno buona tra melanociti, cheratinociti e JDE, con conseguenza una pigmentazione maggiore della pelle e in particolare la comparsa di macchie di vecchiaia o lentiggini senili in queste zone.

L'epidermide subisce così anch’esso gli effetti dell'invecchiamento. Il rinnovo cellulare è meno importante e dunque l'epidermide diventa più sottile. Peraltro, i collegamenti tra le cellule sono meno forti. La filaggrina, l'acido ialuronico, sono meno sintetizzati, il che causa una minima coesione intercellulare e una perdita di acqua più importante nello strato corneo.

Si nota infine l'aumento del livello dei mediatori pre-infiammatori (tipo prostaglandine e interleuchine) la cui presenza è spesso collegata all'invecchiamento, e del livello di molti composti pro-ossidanti, che aumenteranno tutti gli effetti deleteri già descritti, ossidaneo e quindi degradando/disattivando le molecole che contribuiscono all'omeostasi cellulare (lipidi, proteine, zuccheri, acidi nucleici). Un fenomeno particolare, la glicazione delle proteine, accentua l'invecchiamento modificando tutte le proteine della pelle (di struttura o funzionali) e in particolare le proteine del derma come ad esempio il collagene, disorganizzando la matrice extracellulare e facendogli perdere tonicità e la flessibilità. Questa glicazione genererà un aumento dei prodotti radicali che a loro volta perturberanno i metabolismi e degraderanno le strutture delle cellule della pelle. Le cellule meristematiche, l'estratto cellulare o una composizione che lo contiene secondo l'invenzione agiscono vantaggiosamente in cinque direzioni diverse e complementari dell'invecchiamento cutaneo come spiegato qui sopra.

1) Compattamento del derma

- riduzione del livello d'espressione di 3 miRNA noti per rallentare le sintesi di collagene I (famiglia miRNA-29 e miRNA-196a), elastina (famiglia miRNA-29), TIMP-1 (miRNA-21),

- stimolazione delle sintesi delle macromolecole dermiche (collagene I, elastina e acido ialuronico in particolare), TIMP, che inibiscono i MMP.

Grazie all'invenzione, il derma mantiene la sua densità, la sua idratazione, ritroverà elasticità e tonicità, il viso beneficerà di una lisciatura del rilievo (riduzione della profondità delle rughe).

2) Mantenimento dell'integrità del JDE e con ciò dell'ancoraggio dei cheratinociti e del controllo dei melanociti

- riduzione del livello d'espressione dei miRNA-29 noti per rallentare le sintesi di collagene IV e del miRNA-21, che rallentano le sintesi di TIMP-1.

Così le sintesi di collageni IV e laminine sono aumentate, il che rinforza la JDE, le relazioni di questi componenti con lo strato basale di cheratinociti e permette di osservare uno schiarimento delle macchie della vecchiaia.

3) Rilancio dei metabolismi epidermici per ispessire l'epidermide

- accentua la differenziazione dei cheratinociti, - stimola la produzione di due proteine (Claudina-1 e Zo-1) presenti a livello delle giunzioni strette, che garantiscono la coesione tra i corneociti.

- stimola le sintesi d'acido ialuronico e di filaggrina, che favoriranno una buona idratazione della pelle.

Questi effetti in vitro si traducono in vivo con un addensamento del derma.

4) Diminuzione dei messaggeri pre-infiammatori

- riduzione di tre messaggeri pre-infiammatori (PGE2, IL6 e IL8) su cheratinociti umani.

La presenza di questi messaggeri influenza l'invecchiamento delle cellule, in particolare, i PGE2 che intervengono sui melanociti aumentandone l’attività tirosinasi, la loro dendricità e dunque il trasferimento della melanina verso i cheratinociti, il che produce iperpigmentazioni.

5) Segnali anti-senescenza generici; azione antiossidante e miRNA che intervengono nell'invecchiamento.

- potere antiradicalico,

- attività protettiva contro la lipoperossidazione indotta con gli UVA,

- diminuzione del tasso basale delle specie reattive dell'ossigeno in fibroblasti umani dermici,

- induzione su questo stesso tipo cellulare di una sovrapproduzione di superossido dismutasi, enzima determinante nella lotta contro l'ossidazione,

- protezione contro la glicazione delle proteine, - riduzione dell'espressione del miRNA-30a, -34a, -152 e 181a su fibroblasti. Questo effetto è collegato a un prolungamento della sopravvivenza delle cellule e a una riduzione della comparsa di fenotipi senescenti (su fibroblasti).

Le attività antietà sulle matrici extracellulari del derma e dell'epidermide non sono descritte per gli estratti di Plantago della tecnica precedente.

Inoltre, prove comparative con il solo verbascoside sono state condotte e hanno mostrato che le cellule meristematiche secondo l'invenzione conducono a effetti superiori sulla sintesi di macromolecole dermiche (collagene I e acido ialuronico), sulla sintesi di molecole responsabili del rafforzamento della JDE (laminine) e sul rafforzamento della barriera epidermica (acido ialuronico). Inoltre, le cellule meristematiche secondo l'invenzione hanno mostrato un effetto protettivo delle cellule rispetto a un effetto citotossico dimostrato in compenso per il verbascoside.

Si hanno dunque effetti superiori con le cellule secondo l'invenzione rispetto al verbascoside puro che è il rappresentante più conosciuto di questa categoria di molecole di fenilpropanoidi glicosidici.

Applicazioni dermatologiche secondo l'invenzione Applicazione topica delle cellule meristematiche, dell'estratto cellulare o di una composizione che le contiene, secondo l'invenzione (o di una composizione contenente le cellule meristematiche o di uno del loro estratto, secondo l'invenzione), per il trattamento di patologie della pelle fra:

- I disturbi della pigmentazione;

- I disturbi di natura infiammatoria (come dermatite atopica, psoriasi, acne);

- Le dermatosi bollose;

- Le malattie che causano disordini nelle sintesi del collagene, dell'elastina dell'acido ialuronico; e/o

- Le pelli secche, la couperose, l’ittiosi.

Applicazioni nutraceutiche secondo l'invenzione Per via orale (ingestione) per ottenere un effetto benefico per rafforzare la parete intestinale.

Per esempio assorbimento possibile da 10 a 50mg di cellule liofilizzate al giorno e per persona.

Preparazione delle composizioni

La presente invenzione propone dunque una composizione, in particolare topica, che comprende cellule meristematiche o un estratto di dette cellule secondo l'invenzione in un mezzo fisiologicamente accettabile. Secondo l'eccipiente e il dosaggio in cellule o estratto cellulare, questa composizione costituirà ad esempio un ingrediente attivo concentrato o una composizione finale meno concentrata direttamente destinata all'utente finale. Per “mezzo fisiologicamente accettabile” si intende secondo la presente invenzione, in via non limitativa, una soluzione acquosa o idroalcolica, un'emulsione acqua-in-olio, un'emulsione olio-inacqua, una microemulsione, un gel acquoso, un gel anidro, un siero, una dispersione di vescicole, una polvere.

“Fisiologicamente accettabile” significa che le composizioni convengono a un utilizzo topico o per via orale, in contatto con le mucose, le unghie, il cuoio capelluto, i capelli, i peli e la pelle di mammifero e più particolarmente umana, composizioni che possono essere ingerite o iniettate nella pelle, senza rischio di tossicità, d'incompatibilità, d'instabilità, di risposta allergica, e altro. Questo “mezzo fisiologicamente accettabile” forma ciò che si definisce classicamente l’eccipiente della composizione.

Le cellule meristematiche o l'estratto di queste cellule possono essere associati ad altri ingredienti attivi in concentrazioni efficaci che possono agire in modo sinergico o in rinforzo per ottenere gli effetti auspicati descritti per l'invenzione, come gli agenti seguenti: filtrante di radiazioni, in particolare UVA e/o UVB, idratante, calmante, miorilassante, snellente, ristrutturante, rassodante, rimpolpante, tensore, attivo sulla microcircolazione, attivo sull'infiammazione, sui radicali liberi, vitamine, antirughe, schiarente, ecc.

La composizione secondo l'invenzione può essere applicata su viso, corpo, décolleté, cuoio capelluto, capelli, ciglia, peli, in qualsiasi forma o veicolo noti dall’esperto della tecnica, in particolare sotto forma di soluzione, dispersione, emulsione, pasta o polvere, individualmente o in premiscela o essere trasportata individualmente o in premiscela da vettori come macrocapsule, microcapsule o nanocapsule, macrosfere, microsfere, o nanosfere, liposomi, oleosomi o chilomicron, macroparticelle, microparticelle o nanoparticelle, macrospugne, microspugne o nanospugne, microemulsioni o nanoemulsioni, o adsorbito su polimeri organici in polvere, talchi, bentoniti, spore o esine e altri supporti minerali od organici.

In cosmetica in particolare, possono essere proposte applicazioni in particolare nei settori di cura della pelle del viso, del corpo, dei capelli e dei peli e nei settori di maquillage e trattamenti, in particolare ciglia e sopracciglia.

Generalmente, le cellule o l'estratto cellulare secondo la presente invenzione possono essere utilizzati in qualsiasi forma, in una forma legata, incorporata o adsorbita su macro -, micro -, e nanoparticelle, o macro, micro e nanocapsule, per il trattamento dei tessili, delle fibre naturali o sintetiche, delle lane, e qualsiasi materiale destinato a entrare a contatto con la pelle e che possono essere impiegati in abbigliamento, indumenti intimi per il giorno o la notte, fazzoletti, o tessuti, per esercitare il proprio effetto cosmetico o terapeutico tramite questo contatto pelle/tessile e permettere un rilascio topico continuo.

CTFA (« International cosmetic ingredient dictionary & handbook » (13<a>Ed. 2010) pubblicato da « The Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc. », Washington, D.C.) descrive una grande varietà, senza limitazione, di ingredienti cosmetici e farmaceutici solitamente utilizzati nell'industria della cura della pelle, che sono convenienti per l’uso come ingredienti addizionali nelle composizioni secondo la presente invenzione.

Altri principi attivi di cura della pelle addizionali che sono particolarmente utili si possono trovare nella documentazione commerciale di Sederma e sul sito www.sederma.fr.

Si possono così citare per esempio gli attivi commerciali seguenti: betaina, glicerolo, Actimoist Bio 2™ (Attiva organics), AquaCacteen™ (Mibelle AG Cosmetics), Aquaphyline™ (Silab), AquaregulK™ (Solabia), Carciline™ (Greentech), Codiavelane™ (Biotech Marine), Dermaflux™ (Arch Chemicals, Inc), Hydra'Flow™ (Sochibo), Hydromoist L™ (Symrise), RenovHyal™ (Soliance), Seamoss™ (Biotech Marine), Argireline™ (nome commerciale dell'acetil esapeptide-3 di Lipotec), sfilantolo o un estratto d'Acmella oleracea noto col nome di Gatuline Expression™, un estratto di Boswellia serrata noto col nome Boswellin™, Deepaline PVB™ (Seppic), Syn-AKE™ (Pentapharm) Ameliox™, Bioxilift™ (Silab), PhytoCellTec™Argan (Mibelle), Papilactyl D™ (Silab), Preventhelia™ (Lipotec), Subliskin™ (Sederma), Venuceane™ (Sederma), Moist 24™ (Sederma), Vegesome Moist 24™ (Sederma), Essenskin™ (Sederma), Juvinity™ (Sederma), Revidrat™ (Sederma), Resistem™ (Sederma), Chronodyn™ (Sederma), Kombuchka™ (Sederma), Chromocare™ (Sederma), Calmosensine™ (Sederma), Glycokin Factor S™ (Sederma), Biobustyl™ (Sederma), Idealift™ (Sederma), Ceramide 2™, Ceramide A2™ e Ceramide HO3™ (Sederma), Legance™ (Sederma) Intenslim™ (Sederma), Prodizia™ (Sederma), Beautifeye ™ (Sederma), o miscele degli stessi.

Fra gli estratti vegetali che possono essere combinati con un peptide secondo l'invenzione, si possono citare inoltre in particolare gli estratti d'edera, ad esempio d'edera rampicante (Hedera Helix), di Bupleurum chinensis, di Bupleurum Falcatum, d’arnica (Arnica Montana L), di rosmarino (Rosmarinus officinalis N), di calendula (Calendula officinalis), di salvia (Salvia officinalis L), di ginseng (Panax ginseng), di ginko biloba, d'erba di san giovanni (Hyperycum Perforatum), di rusco (Ruscus aculeatus L), d'ulmaria (Filipendula ulmaria L), d'ortosifone (Orthosiphon Stamincus Benth), di alghe (Fucus Vesiculosus), di betulla (Betula alba), di tè verde, di noce di cola (Cola Nipida), di castagni dell'India, di bambù, Centella asiatica, di brughiera, fuco, salice, pilosella, gli estratti d'escina, gli estratti di cangzhu, gli estratti di chrysanthellum indicum, di piante del genere Armeniacea, Atractylodis Platicodon, Sinnomenum, Pharbitidis, Flemingia, di Coleus comme C. Forskohlii, C. blumei, C. esquirolii, C. scutellaroides, C. xanthantus e C. Barbatus, come un estratto di radici di Coleus barbatus, estratti di Ballote, Guioa, Davallia, Terminalia, Barringtonia, Trema, antirobia, cecropia, argania, dioscoreae come Dioscorea opposita o messicano, degli estratti di Ammi visnaga, di Siegesbeckia, in particolare Siegesbeckia orientalis, degli estratti vegetali delle famiglie delle Ericaceae, in particolare degli estratti di mirtilli (Vaccinium angustifollium) di Arctostaphylos uva ursi, aloe vera, di piante contenenti degli steroli (in particolare dei fitosteroli), di Manjistha (estratti di piante del genere Rubia, in particolare Rubia Cordifolia), di Guggal (estratto di piante del genere Commiphora, in particolare Commiphora Mukul), un estratto di cola, camomilla, treffle viola, di Piper methysticum (Kava Kava di Sederma), di Bacopa monieri (Bacocalmine™, Sederma) e di frusta di mare, di Glycyrrhiza glabra, di gelso, di melaleuca (albero del tè), di Larrea divaricata, di Rabdosia rubescens, di Euglena gracilis, di Fibraurea recisa Hirudinea, di Chaparral Sorghum, di fiore di girasole, d’Enantia chlorantha, di Mitracarpe del genere Spermacocea, di Buchu barosma, di Lawsonia inermis L., d’Adiantium Capillus-Veneris L., di Chelidonium majus, di Luffa cylindrical, di « Mandarino Giapponese » (Citrus reticulata Blanco var. unshiu), di Camelia sinensis, di Imperata cylindrical, di Glaucium Flavum, di Cupressus Sempervirens, di Polygonatum multiflorum, di loveyly hemsleya, di Sambucus Nigra, di Phaseolus lunatus, di Centaurium, di Macrocystis Pyrifera, di Turnera Diffusa, di Anemarrhena asphodeloides, di Portulaca pilosa, d’Humulus lupulus, di caffé Arabica, d’Ilex Paraguariensis, di Globularia Cordifolia, d’Oxydendron arboreum e di Zingiber zerumbet smith.

Le composizioni secondo la presente invenzione possono comprendere uno o più peptidi, inclusi, senza limitazioni, i di-, tri, tetra-, penta- e esapeptidi e loro derivati. Secondo una forma di realizzazione particolare, la concentrazione del peptide addizionale, nella composizione, varia da 1x10%<-7>a 20%, preferibilmente da 1x10%<-6>a 10%, di preferenza da 1x10%<-5>a 5%, in peso. Il termine “peptide” designa qui i peptidi contenenti 10 aminoacidi o meno, i loro derivati, isomeri e complessi con altre specie come uno ione metallo (e.g., rame, zinco, manganese, magnesio, e altri). Il termine “peptidi” si riferisce sia a peptidi naturali che a peptidi di sintesi. Si riferisce anche a composizioni che contengono peptidi e che si incontrano in natura, e/o che sono disponibili in commercio.

Esempi non limitativi di dipeptidi utilizzabili nel quadro della presente invenzione, comprendono la carnosina (beta-AH), YR, VW, NF, DF, KT, KC, CK, KP, KK o TT. Esempi non limitativi di tripeptidi comprendono RKR, HGG, GKH, GGH, GHG, KFK, KPK, KMOK, KMOK2o KAvaK. Esempi non limitativi di tetrapeptidi sono RSRK (SEQ ID NO:1), GQPR (SEQ ID NO:2) o KTFK (SEQ ID NO:3). Un esempio non restrittivo di pentapeptide è KTTKS (SEQ ID NO:4) e di esapeptidi GKTTKS (SEQ ID NO:5) e VGVAPG (SEQ ID NO:6).

Altri peptidi utilizzabili nell’ambito della presente invenzione possono essere selezionati fra, senza che questa lista sia limitativa: i derivati lipofilici di peptidi, preferibilmente i derivati palmitoilici, e i complessi con gli ioni metallo citati in precedenza (e.g complesso di rame tripeptide HGG). I dipeptidi preferiti comprendono ad esempio N-palmitoil-beta-Ala-His, N-Acetil-Tir-Arg-esadecilestere (Calmosensine™, Idealift™, Sederma), pal-KT, pal-RT (Sederma). I tripeptidi preferiti comprendono in particolare N-Pal-Gly-Lys-His, (Pal-GKH, Sederma), il derivato rame di HGG (Lamin™, Sigma), la lipospondina (N-Elaidolil-KFK) e i suoi analoghi di sostituzione conservativa, N-Acetil-RKR-NH2 (Peptide CK+), il N-Biot-GHK (Sederma), Pal-KMO2K (Sederma) e i loro derivati. Derivati tatrapeptidi utilizzabili nell’ambito della presente invenzione comprendono, in via non limitativa, N-Pal-GQPR (Sederma) (SEQ ID NO:7), Ela-KTFK (SEQ ID NO:8). Derivati pentapeptidi utilizzabili sono, in via non limitativa, N-Pal-KTTKS (SEQ ID NO:9) (MATRIXYL™, Sederma), N-Pal-Tyr-Gly-Gly-Phe-X (SEQ ID NO:10) con X essendo Met o Leu o la loro miscela. Derivati esapeptidi utilizzabili, comprendono in via non limitativa: N-Pal-VGVAPG (SEQ ID NO:11), Pal-GKTTKS (SEQ ID NO:12) e derivati. Si può citare così la miscela Pal-GHK e Pal-GQPR (SEQ IDEM N.: 7) (Matrixyl™ 3000, Sederma).

Le composizioni preferite disponibili in commercio contenenti un tripeptide o derivato comprendono Biopeptide-CL™, Maxilip™ o Biobustyl™ di Sederma. Le composizioni preferite, disponibili in commercio, fonti di tetrapeptidi comprendono: RIGIN™, Eyeliss™, Matrixyl™ Reloaded e Matrixyl 3000™, che contengono tra 50 e 500 ppm di palmitoil-GQPR (SEQ IDEM N.: 7) e un eccipiente, proposto da Sederma.

I peptidi commerciali seguenti possono anche essere citati come ingredienti attivi addizionali: Vialox™, Syn-ake™ or Syn-Coll™ (Pentapharm), idrossiprolisilano CN™ (Exsymol), Argireline™, Leuphasyl™, Aldenine™, Trylgen™, Eyeseryl™, Serilesine™ or Decorinyl™ (Lipotec), Collaxyl™ or Quintescine™ (Vincience), BONT-L-Peptide™ (lnfinitec Activos), Cytokinol™LS (Laboratoires Serobiologiques/Cognis), Kollaren™, IP2000™ or Meliprene™ (lnstitut Européen de Biologie Cellulaire), Neutrazen™ (Innovations), ECM-Protect™ (Atrium Innovations), Timp-Peptide™, ECM Moduline™ (lnfinitec Activos).

La presente invenzione propone anche ancora un metodo di trattamento topico cosmetico, o dermofarmaceutico per il miglioramento dell'aspetto e dello stato generale della pelle e delle sue fanere, che comprende l'applicazione topica sulla pelle di un soggetto che ne necessita di una quantità efficace di cellule meristematiche o di un estratto cellulare secondo l'invenzione o di una composizione secondo l'invenzione che comprende dette cellule meristematiche o detto estratto cellulare come definiti in precedenza.

Per “trattamento topico” o “utilizzo topico” si intende un'applicazione che è destinata ad agire nel punto in cui è applicata: pelle, mucosa, fanere.

Le cellule meristematiche, l'estratto cellulare o la composizione secondo l'invenzione possono essere applicati localmente sulle zone determinate.

La quantità “efficace” dipende da vari fattori, come l'età, lo stato del paziente, la gravità del disturbo o della patologia e la modalità di somministrazione. Una quantità efficace significa una quantità non tossica sufficiente a ottenere l'effetto desiderato. In una composizione cosmetica secondo l'invenzione, le cellule meristematiche o l'estratto cellulare, per essere presenti in quantità efficace, si trovano in generale in proporzioni comprese tra lo 0,000001% e il 15% rispetto al peso totale della composizione, preferibilmente ancora tra lo 0,0001% e il 10%, in funzione della destinazione della composizione e dell'effetto richiesto più o meno pronunciato.

Tutte le percentuali e i rapporti utilizzati nella presente domanda sono in peso della composizione totale e tutte le misure sono effettuate a 25°C a meno che ciò sia precisato differentemente.

Per esempio, per un trattamento cosmetico del viso, la Direttiva Europea sui Cosmetici ha fissato una quantità standard d'applicazione di una crema di 2,72 mg/cm<2>/giorno/persona e per una lozione per il corpo di 0,5 mg/cm<2>/giorno/persona.

Secondo altre particolarità, il metodo di trattamento cosmetico secondo l'invenzione può essere associato a uno o più altri metodi di trattamento che riguardano la pelle, come ad esempio i trattamenti per luminoterapia, tramite calore o aromaterapia.

Secondo l'invenzione, è possibile proporre dispositivi a più compartimenti o kit destinati alla realizzazione del metodo descritto in precedenza, e che potrebbe comprendere, per esempio, e senza che ciò sia limitativo, in un primo compartimento una composizione contenente cellule attive secondo l'invenzione e in un secondo compartimento un eccipiente e/o principio attivo addizionale, le composizioni contenute in detti primo e secondo compartimento essendo qui considerate come composizione di combinazione per un utilizzo simultaneo, distinto o prolungato nel tempo in particolare in uno dei trattamenti definiti in precedenza.

Il metodo di trattamento secondo l'invenzione è più particolarmente adatto a un trattamento:

- antietà attraverso un'azione sulle molecole della MEC dermica ed epidermica; e/o

- per compattare il derma attraverso la stimolazione di collagene I e d'elastina, e/o - per rallentare i deterioramenti delle molecole della matrice extracellulare dermica, e/o

- per agire sulla JDE attraverso la stimolazione di collagene IV e/o di laminine, e/o

- per ispessire l'epidermide, e/o

- per trattare le macchie di senescenza, e/o - antirughe, e/o

- volumizzante.

Altre applicazioni cosmetiche sono altresì possibili, ad esempio dimagrante, trattamento della perdita d'elasticità, disintossicazione, antiglicazione, tensore, antifatica, antiborse e/o occhiaie, calmante, tonificante, azione sui peli e sui capelli, azione sulla luminosità del colore ecc. a titolo preventivo o curativo.

La presente invenzione sarà meglio compresa e altri vantaggi appariranno alla luce della descrizione dettagliata che seguirà, descrizione fatta in riferimento alla tavola di disegno allegata in cui la figura 1 rappresenta un grafico di deformazione della pelle per mezzo di un cutometer che illustra i diversi parametri misurati.

A) Creazione della linea IRB PL3

Porzioni selezionate di foglie del genere Plantago lanceolata sono prelevati, lavati e tagliati in piccole porzioni di qualche cm, in modo da realizzare da 2000 a 5000 espianti. Dopo una serie di trattamenti di decontaminazione quindi di sterilizzazione, le porzioni sono poste su un terreno di coltura di agar in presenza di un mezzo nutritivo contenente ormoni di crescita vegetali per indurre la callogenesi (formazione di un callo).

Dopo un periodo di tempo adeguato, si forma un ammasso di cellule dedifferenziate o callo, il quale è trasferito su una superficie più grande e in un terreno fresco di coltura per potersi moltiplicare. Un certo numero di sotto-culture (trasferimenti su un terreno fresco di coltura) è realizzato per stabilizzare la linea cellulare, vale a dire finché questa presenta una velocità di proliferazione elevata e costante, una conservazione del fenotipo, una concentrazione costante di composti bioattivi d'interesse (metaboliti primari e secondari).

La linea cellulare è in seguito sottoposta a una fase di selezione che consiste nel coltivare le cellule per una durata adeguata, a prelevare gli aggregati di cellule formati e inocularli su un terreno di coltura liquido per una durata che permette di ottenere la moltiplicazione dell'aggregato cellulare. La migliore linea cellulare sarà quella che permette di ottenere il più rapidamente possibile e in modo riproducibile una biomassa importante avente una concentrazione ottimale di metaboliti selezionati, la migliore attività biologica e un fenotipo omogeneo.

Gli inventori hanno così scelto la linea Plantago lanceolata IRB PL3.

Questa è stata selezionata anche per la sua capacità di produrre fenilpropanoidi glicosidici in una quantità del 10% circa misurata in peso di fenilpropanoidi glicosidici totali espressi in plantamaioside rispetto al peso secco delle cellule.

B) Metodo industriale d'ottenimento di una biomassa di cellule meristematiche di Plantago lanceolata ottenute a partire dalla linea cellulare Plantago lanceolata IRB PL3 o da un estratto di dette cellule

La linea Plantago lanceolata IRB PL3 è inizialmente moltiplicata per ottenere una quantità sufficiente di biomassa di cellule meristematiche per effettuare la fase di produzione in grande scala.

Le fasi seguenti sono realizzate:

a) Inoculazione della linea selezionata in un terreno liquido e coltura per un tempo sufficiente a ottenere un aumento della biomassa di almeno il 300%;

b) In modo facoltativo, trasferimento della sospensione ottenuta in a) in un terreno liquido fresco e nuovamente coltura un tempo sufficiente per ottenere un aumento della biomassa di almeno il 300%;

c) Facoltativamente, ripetizione della fase b);

d) Trasferimento delle sospensioni cellulari ottenute nelle fasi da a) a c) in un bioreattore con terreno liquido fresco, e tubo di coltura in condizioni e per un tempo sufficiente tali da ottenere una biomassa cellulare contenente il metabolita d'interesse cioè il PPG in quantità sufficiente, questa fase di produzione in bioreattore comprendendo una fase d'elicitazione realizzata modificando i tassi di sostanze nutrienti del terreno di coltura.

Il bioreattore:

Volume : da 5 a 50 volte più grande del volume di biomassa utilizzata come inoculum; superficie interna del bioreattore liscia e uniforme (nessun bordo o angolo che possa causare la rottura delle pareti delle cellule).

Condizioni di coltura:

Terreno di coltura: mezzo che comprende sali minerali (soluzione di macroelementi e di microelementi), vitamine, ormoni vegetali e saccarosio. Agar vegetale è aggiunto nei terreni solidi.

Temperatura : tra 15°C e 35°C, preferibilmente tra 20°C e 30°C e in modo ancor più preferito 25°C.

Durata: tra 7 e 21 giorni, preferibilmente tra 10 e 14 giorni.

Agitazione della biomassa: è importante che la biomassa sia aerata in modo ottimale, e che allo stesso tempo, essa sia mantenuta agitata, sia da un mezzo interno, sia da un mezzo esterno. È necessario che l'agitazione, benché bassa, sia efficace, soprattutto nelle fasi finali, quando la biomassa è in quantità importante. Per le necessità della presente invenzione, mezzi adeguati d'agitazione per via interna sono eliche che girano tra 20 e 120 giri/min., preferibilmente a 60 giri/min., o per via esterna dei mezzi d'agitazione orbitale che girano preferibilmente tra 40 e 200 giri/min. e preferibilmente a circa 120 giri/min.

Ossigenazione: normalmente realizzata utilizzando aria sterile, a una portata da 0,5 a 4 litri al minuto, preferibilmente tra 2 e 2,5 litri al minuto, per un volume di 10 litri di biomassa. In modo alternativo, possono essere utilizzate miscele di gas contenenti dal 10% al 100% v/v d'ossigeno. Sarà preferibile utilizzare mezzi di diffusione dell'aria o dell'ossigeno con un ugello avente una portata compresa tra 10ml/mn e 600ml/mn e preferibilmente tra 50ml/mn e 350ml/mn.

Trattamento del mezzo cellulare ottenuto

Filtrazione per eliminare il terreno di coltura e recuperare la biomassa di cellule. Questa biomassa può essere caratterizzata dal suo tasso equivalente di cellule liofilizzate.

Caratterizzazione dei composti attivi contenuti nelle cellule per determinazione analitica di metaboliti primari e secondari prodotti dalla coltura inclusa la concentrazione in proteine e PPG.

Facoltativamente:

- essiccazione delle cellule in particolare tramite liofilizzazione o atomizzazione per permettere una maggiore stabilità dei composti d'interesse, migliorare l'accumulo a lungo termine senza dover aggiungere conservanti.

-omogeneizzazione sotto alta pressione del terreno di coltura cellulare: permette una riduzione della dimensione degli aggregati cellulari; alcune cellule possono essere scoppiate e si può essere allora in presenza di una miscela di cellule intere e di cellule schiacciate;

- estrazione del contenuto delle cellule con frantumazione/lisi/scoppio delle cellule in un solvente adeguato e separazione delle fasi liquida e solida (mediante centrifugazione o filtrazione o altro), per ottenere un estratto cellulare.

C) Ottenimento di una composizione secondo l'invenzione

La biomassa di cellule, sia come ottenuta al punto B) dopo filtrazione, sia sotto forma essiccata, o anche l'estratto cellulare, possono essere mescolati a un terreno fisiologicamente accettabile formando l’eccipiente.

A titolo di esempio preferito, questo terreno fisiologicamente accettabile è una matrice idrofila in cui le cellule sono poste in sospensione, ad esempio nel caso di una composizione cosmetica del glicerolo e/o del butilenglicole. Additivi possono essere così aggiunti se necessario, come agenti antimicrobici, antiossidanti, agenti stabilizzanti, agenti attivi sul pH, agenti emulsionanti o agenti addensanti, in particolare un addensante come gomma xantano che favorirà il mantenimento in sospensione delle cellule.

Si può inoltre prevedere una fase d'omogeneizzazione ad alta pressione per ottenere una sospensione di più particelle fini.

Può quindi essere formato un ingrediente d’uso cosmetico, concentrato in composti attivi che comprende ad esempio il 20% in peso di biomassa fresca di cellule meristematiche intere (corrispondente all' 1% circa di cellule secche) rispetto al peso totale della composizione, avente un tasso al finale dello 0,1% di fenilpropanoidi glicosidici totali, in una miscela eccipiente fisiologicamente accettabile costituita da glicerolo (circa 80%) e di gomma xantano (0,3% in peso).

Quest'ingrediente è in seguito utilizzabile a una concentrazione da alcune % al 20% per preparare formulazioni cosmetiche come esposto qui di seguito al punto Galenico E).

D) Risultati comparativi di analisi in vitro

Le analisi seguenti sono state oggetto di un raffronto tra il prodotto secondo l'invenzione e verbascoside puro a una concentrazione equivalente alla concentrazione di fenilpropanoidi glicosidici (PPG) del prodotto secondo l'invenzione.

1) Sulla sintesi di macromolecole dermiche (collagene I e acido ialuronico)

a) Sintesi di Collagene I

Fibroblasti umani normali (FHN) sono coltivati per 24 ore. Le cellule sono poste o meno a contatto con il prodotto da testare (prodotto secondo l'invenzione o verbascoside) per 6 giorni. La sintesi di collagene I prodotta dalle cellule è in seguito quantificata tramite immuno-marcatura e analisi di immagini sui tappeti fissati. Un contro colorazione dei nuclei all’Hoechst va a completare lo studio e permette di ponderare i risultati.

Tabella 22: Effetto comparato del verbascoside e del prodotto secondo l'invenzione sulla sintesi di collagene, in fibroblasti umani.

Variaz Collagene

IMF Concentr

ione I % di Collagene azione

Nb (UFA/10cel Variazione I in PPG

cell l<6>)

Riferi 41,36 /-Controllo-Riferimento mento 14,47

Prodotto

secondo 84,84 /- 105% ;

17,6ppm 1,8

l'invenzi 7,38 p<0,01 one

Verbascos 50,32 /-17,6ppm -16,2 21,7% ; dns ide 15,24

Alla dose considerata, il prodotto secondo l'invenzione stimola fortemente la sintesi di collagene I, mentre il verbascoside è inattivo.

b) Sintesi di acido ialuronico

Fibroblasti umani normali (FHN) sono coltivati per 24 ore. Le cellule sono poste o meno in contatto col prodotto da testare (prodotto secondo l'invenzione o verbascoside). La sintesi d'acido ialuronico prodotta dalle cellule è in seguito quantificata tramite immuno-marcatura e analisi di immagini sui tappeti fissati. Un contro colorazione dei nuclei all’Hoechst va a completare lo studio e permette di ponderare i risultati.

Tabella 23: Effetto comparato del verbascoside e del prodotto secondo l'invenzione sulla sintesi d'acido ialuronico, in fibroblasti umani.

Acido

Variaz

IMF Acido Concentra Ialuronic

ione % di ialuronic zione in o

Nb Variazione o PPG (UFA/10ce

cell

ll<6>)

Riferi 17,07 /-Controllo-Riferimento mento 12,40

Prodotto

secondo 52,92 /- 210% ;

8,8ppm -3

l'invenzi 15,90 p<0,01 one

Verbascos 28,20 /-8,8ppm 2 65% ; p<0,05 ide 4,85

Alla dose considerata, il prodotto secondo l'invenzione stimola fortemente la sintesi d'acido ialuronico. Il verbascoside presenta così un effetto stimolante ma chiaramente meno forte.

Parallelamente a queste prove, è stato constatato, a dosi più elevate di verbascoside, che questa molecola aveva un effetto citotossico sui fibroblasti, mentre a una concentrazione equivalente in PPG, il prodotto secondo l'invenzione non presentava questa citotossicità. La valutazione del numero di cellule è stata effettuata marcando i nuclei con il colorante Hoescht, e contandoli su un gran numero di campi.

Concentrazione Variazione Nb Citotossicità

in PPG cell Controllo- Rif.Prodotto secondo 17,6ppm -7 l'invenzione

29ppm -16

17,6ppm -31 Verbascoside

29ppm -44

2) Sulla sintesi di molecole responsabili del rinforzamento della JDE e dell'epidermide (laminine e acido ialuronico)

Cheratinociti umani sono coltivati per 24 ore. Le cellule sono poste o meno a contatto con il prodotto da testare (prodotto secondo l'invenzione o verbascoside) per 3 giorni. I surnatanti di coltura sono prelevati e un dosaggio della quantità di laminina e d'acido ialuronico è realizzato tramite metodo ELISA; una stima della quantità di cellule per dosaggio Hoechst (misura della quantità di DNA) o BCA (misura della quantità di proteine) permette di ponderare i risultati.

a) Laminine

Tabella 24: Effetto comparato del verbascoside e del prodotto secondo l'invenzione sulla sintesi di laminina, in cheratinociti umani.

Laminina Concentr Laminina

Variazion % di cheratino azione (ng/10<6>cel

e Nb cell Variazione citi in PPG l)

Riferimen 246,4 /-Controllo-Riferimento to 23,0

Prodotto 360,0 /- 46% ;

8,8ppm 1

secondo 13,4 p<0,01 l'invenzi

602,9 /- 145% ; one 17,6ppm -9

24,7 p<0,01

193,2 /- -22% ; 8,8ppm -18

Verbascos 22,3 p<0,01 ide 202,1 /- -18% ;

17,6ppm -25

10,4 p<0,01 Alle dosi considerate, il prodotto secondo l'invenzione stimola fortemente e in modo dosedipendente la sintesi di laminina, mentre il verbascoside è inattivo. Come per i fibroblasti, si constata nei cheratinociti un inizio di tossicità a 8.8ppm di verbascoside, che non appare con il prodotto secondo l'invenzione.

b) Acido Ialuronico

Tabella 25: Effetto comparato del verbascoside e del prodotto secondo l'invenzione sulla sintesi d'acido ialuronico, in cheratinociti umani.

Variazi

AH Concentra Laminine

one Nb % di Cheratino zione in (ng/10cel

cell Variazione citi PPG l<6>)

(BCA)

4728,7

Controllo- RefRiferimento /- 537

Prodotto 5562,8 18% ;

8,8ppm -11

secondo /- 203,8 p<0,05 l'invenzi

6373,1 35% ; one 17,6ppm -5

/- 689,6 p<0,01

4907,5 4%; dns 8,8ppm -25

Verbascos /- 602,8

ide 5477,9 16% ; dns 17,6ppm -27

/- 480

Alle dosi considerate (8,8 e 17,6ppm), il prodotto secondo l'invenzione stimola in modo dose-dipendente la sintesi di laminina. Il verbascoside valutato in parallelo non ha effetto significativo. L'inizio di tossicità a 8.8ppm di verbascoside è confermato da un'altro metodo (BCA)

c) Sul rafforzamento della barriera epidermica

• Sintesi di loricrina

Cheratinociti umani a confluenza sono stati posti a contatto del prodotto da testare (prodotto secondo l'invenzione o verbascoside) in un terreno contenente calcio, e la differenziazione è stata seguita. Dopo 7 giorni di coltura, i tappeti sono risciacquati, fissati e la sintesi di Loricrina è evidenziata per immunofluorescenza e quantificata con analisi d'immagine. Una controcolorazione dei nuclei all’Hoechst va a completare lo studio e ponderare questi risultati.

Tabella 26: Effetto comparato del verbascoside e del prodotto secondo l'invenzione sulla sintesi di loricrina, in cheratinociti umani.

Concentra Variazione % di IMF Loricrina zione in Nb cell Variazione PPG (HXT) (UFA/10<6>cell)

Riferiment

Controllo-Riferimento o

Prodotto 670% ;

17,6ppm -37

secondo p<0,01 l'invenzione

<Verbascoside>17,6ppm -23 -56,4% ; dns

La riduzione della quantità cellulare è classica dopo contatto con un prodotto prodifferenziatore e non traduce una citotossicità di questo prodotto, ma piuttosto una minima adesione delle cellule differenziate al supporto.

Alla dose considerata, il prodotto secondo l'invenzione stimola fortemente la sintesi di loricrina, e dunque la differenziazione dei cheratinociti, mentre il verbascoside è inattivo.

E) Galenico

Diverse formulazioni cosmetiche sono descritte qui di seguito. Ingredienti attivi addizionali, che se necessario vanno a sostegno e/o a complemento dell'attività dell'ingrediente attivo secondo l'invenzione, possono essere aggiunti nella fase adeguata secondo la loro natura idrofoba o idrofila. Questi ingredienti possono essere di qualsiasi categoria secondo la/le loro funzione/i, il luogo d'applicazione (corpo, viso, collo, busto, mani, capelli, ciglia, sopracciglia, peli, ecc. ) l'effetto finale richiesto e il consumatore mirato, ad esempio antietà, antirughe, idratante, anti-occhiaie, rassodante, antiglicazione, snellente, alleviante, miorilassante, antirossore, antismagliature, ecc.

Ingrediente attivo secondo l'invenzione utilizzato nelle formulazioni galeniche fornite qui di seguito:

: 20% in peso rispetto al peso totale di cellule meristematiche intere fresche secondo l'invenzione (corrispondente all'1% di cellule secche), l'ingrediente avendo un tasso al finale dello 0,1% di fenilpropanoidi glicosidici totali (espressi in plantamaioside) in una miscela eccipiente fisiologicamente accettabile costituita da glicerolo, addensante gomma xantano e acido citrico per regolare il pH se necessario.

Forma crema

Prodotto % Nome INCI

Fase A

H2O Qsp100 Water

Optasense G83 0,30 Carbomer

Fase B

Brij S2-SS- (RB) 0,40 Steareth-2

Brij S10-SO- (RB) 1,20 Steareth-10

Crodafos CES-PA- 4,00 Cetearil alcol & Dicetil (RB) Fosfato & Ceteth-10 Fosfato Crodacol CS90-PA 1,50 Cetearil Alcol Laurocapram 2,50 Laurocapram

BRB CM 56 2,00 Ciclopentasilossani &

Cicloesasilossani Crodamol OSU-LQ- 7,00 Dietilesil Succinato (RB)

Fase C

Glicerina 4,00 Glicerina Ottandiolo 0,50 Caprilil glicole Fase D

Fenossietanolo qs Fenossietanolo

Fase E

Sorbato di potassio qs Sorbato di potassio Fase F

H2O 4,00 Water

NaOH 30% 0,40 Sodio Idrossido Fase G

Ingrediente attivo 2,00

secondo l'invenzione

Fase H

Profumo 0,10 Fragranza Protocollo: pesare la fase A e lasciar gonfiare senza agitazione per 30 min. Porre la fase A a riscaldare a 75°C a bagnomaria. Pesare la fase B e porre a riscaldare a 75°C a bagnomaria. Mescolare bene. Pesare e fondere la fase C a 45°C. Aggiungere la fase D nella fase C, preventivamente raffreddata. Versare la fase C+D nella fase A, sotto agitazione v= 500 g/mn. Omogeneizzare bene. Versare la fase B nella fase precedente, sotto agitazione v= 1000 g/mn. Omogeneizzare bene. Estemporaneamente, aggiungere la fase E, omogeneizzare bene. Aggiungere la fase F, omogeneizzare bene. Aggiungere la fase G, a meno di 45°C, omogeneizzare bene, 1 ora. Aggiungere la fase H, omogeneizzare bene.

Esempi di ingredienti che possono essere aggiunti a questa formulazione:

• MATRIXYL synthe’6<TM>: ingrediente attivo antirughe a base di peptidi commercializzato da Sederma (WO2010/082175) che aiuta a riparare i danni cutanei causati dall'invecchiamento. il 3% in massa di questo ingrediente potendo ad esempio essere aggiunto alla fine della formulazione.

• MATRIXYL 3000<TM>: ingrediente attivo antirughe a base di peptidi commercializzato da Sederma (WO2005/048968) che aiuta a riparare i danni cutanei causati dall'invecchiamento. il 3% in massa di questo ingrediente può ad esempio essere aggiunto a fine formulazione.

F) Analisi in vivo

Una crema preparata secondo l'esempio galenico 1 (vedere paragrafo quì sopra F) è stata utilizzata per queste analisi.

Principio

La valutazione dell'efficacia della crema secondo l'invenzione è stata condotta in totale su un campione di 56 donne mature d'età media 62,5 anni (52 - 75 anni) nelle quali il dorso della mano, un sito alterato visibilmente dall'invecchiamento, è stato controllato grazie a vari metodi complementari:

• Una misura dei parametri d'elasticità e di tonicità tramite Cutometria

• Una misura dell'integrità dermico tramite Reviscometer

• Una misura dello spessore del derma tramite ecografia a ultrasuoni

• Una misura del rilievo della zampe di gallina tramite analisi di impronte.

• Una misura innovativa dello spessore dell'epidermide tramite microscopia confocale laser In vivo (Vivascope)

• Una misura della pigmentazione delle mani tramite analisi di immagini su fotografie standardizzate e su adesivi.

Protocollo

Criteri d'inclusione particolari

I volontari dovevano presentare segni visibili d'invecchiamento sulle parti testate, come macchie di senescenza, una pelle rilasciata sulle mani e/o un rilievo accentuato sulla zona delle zampe di gallina. Poiché tutti i volontari non avevano i tre parametri in modo ottimale, (con talvolta eterogeneità tra i due lati), su ciascun volontario non sono state eseguite tutte le analisi e sono state realizzate sottopopolazioni per avere campioni coerenti per ogni analisi.

I volontari dovevano rispettare un periodo di “washout” di 15 giorni senza utilizzare un prodotto cosmetico trattante e avere una costanza ormonale per i 3 mesi precedenti l'analisi e durante l'analisi (nessuna variazione di trattamento contraccettivo, sostitutivo o curativo). Si pretendeva l'impiego esclusivo dei prodotti cosmetici forniti per tutta la durata dello studio.

Tipo di studi e durata

Lo studio è stato condotto in cieco sul dorso della mano e sul viso. La crema secondo l'invenzione e la crema placebo, utilizzata in controlaterale, sono state applicate con doppio massaggio quotidiano in 2 mesi.

La sinossi dello studio si può riassumere secondo lo schema qui di seguito.

T0 T1mese T2mese

Elasticità- Elasticitàtonicità tonicità

(Cutometer) (Cutometer)

Densità cutanea Densità cutanea

(Reviscometer) (Reviscometer)

Spessore derma Spessore derma

(Ecografia) (Ecografia)

Spessore Spessore

epidermide epidermide

(Vivascope) (Vivascope)

Rilievo viso Rilievo viso (impronte) (impronte) Pigmentazione Pigmentazione (fotografie (fotografie adesivi) adesivi) Analisi statistiche su serie accoppiate sono state realizzate con per mezzo dell’analisi t di Student o se necessario con un'analisi non parametrica di Wilcoxon.

1) Miglioramento della qualità del derma:

• Miglioramento dell'elasticità e della tonicità della pelle della mano

Il cutometer MPA580 (Courage & Khazaka, Germania) è stato utilizzato per misurare le proprietà d'elasticità e di tonicità della mano. Quest'apparecchio, in grandissima parte utilizzato per oggettivare gli effetti dei prodotti cosmetici misura la deformazione di una zona cutanea sottoposta a una sollecitazione meccanica d'aspirazione e il suo potere di recupero. La sonda di 2mm è stata utilizzata con una depressione di 500mbar. La figura 1 in allegato mostra un esempio di grafico di deformazione della pelle così ottenuto.

Fra i parametri disponibili, sono stati scelti quelli per i quali una variazione con l'età sul dorso della mano era stata chiaramente dimostrata nella letteratura cosmetica: Tonicità (Ua/Ue), Elasticità (Ur/Uf) e Recupero (Ua/Uf). Essendo dei rapporti, questi parametri hanno il vantaggio di essere indipendenti dalle variazioni di spessore della pelle.

Tabella 27: Variazione dell'elasticità e della tonicità dopo applicazione della crema secondo l'invenzione o del suo Placebo (26 volontari, n= 3 misure)

Prodotto secondo l'invenzione Tasso di

Tonicità Elasticità recupero

Ur/Ue Ur/Uf Ua/Uf

T0 T1 T0 T1 T0 T1 0,27 0,35 0,19<Media>0,517 0,584 0,233

2 6 0

0,06 0,09 0,04

<+/- E-tipo>0,075 0,080 0,059

1 8 3

% variazione 30,8

12,9% 22,4% vs.T0 % Significativi p<0, p<0,0 p<0,01

tà 01 1 Significativi p<0, p<0,0 p<0,05

tà vs placebo 05 5

Placebo

Tasso di

Tonicità Elasticità recupero

Ur/Ue Ur/Uf Ua/Uf

T0 T1 T0 T1 T0 T1 0,29 0,32 0,20<Media>0,536 0,536 0,210

3 1 5

0,06 0,09 0,04

<+/- E-tipo>0,074 0,075 0,059

5 9 3

% variazione

0% 9,5% 2,4% vs.T0

Significativi

dns dns dns tà

Dns : differenza non significativa

Un miglioramento significativo dei 3 parametri importanti che sono il recupero, la fermezza e l'elasticità è osservato rispetto al placebo (p<0,05). L'aumento in 1 mese è significativo (p<0,01) sul lato che ha ricevuto il prodotto secondo l'invenzione; esso raggiunge rispettivamente 12,9%, 30,8% e 22,4%, essendo l'effetto del placebo trascurabile e non significativo.

• Misura della densità cutanea tramite Reviscometer®

Il Reviscometer® RV 600 (Courage & Khazaka, Germania) misura il tempo di propagazione di un'onda acustica nel derma e nell'epidermide una volta emessa alla sua superficie. Questo parametro è denominato Resonance Running Time (o RRT). La sonda cutanea dell'apparecchio comprende un emettitore acustico separato da una distanza di 2 mm del ricevitore. L'onda non penetra a più di 0,5mm, è possibile studiare le qualità del derma.

La velocità di propagazione del suono, in un materiale, dipende dalla sua densità e dalla sua tensione. L'apparecchio misura il RTT in vari angoli tramite rotazione della sonda sulla superficie della pelle. Si ottiene così una media del tempo di propagazione (RTT medio) che è descritta per diminuire con l'età sulla mano, su altri siti o quando esistono deterioramenti tissutali. Il RTT medio traduce dunque la qualità dell'assieme delle fibre; diminuisce in parallelo la densità del tessuto al contrario del RTT massimo. Quest'ultimo aumenta a seguito di questo deterioramento, le onde che riproducono le fibre più importanti, ponendo più avanti quelle che sono meno rapidamente degradate. Le prove hanno mostrato che il RTT medio diminuisce con l'età sulla mano.

La crema secondo l'invenzione, o il suo placebo in controlaterale, sono stati applicati sulla mano da volontari. Un RTT medio è stato calcolato tramite 19 rotazioni successive della sonda sulla pelle a T0 e dopo 1 mese d'applicazione. Tre misure sono state effettuate ciascuna volta su ciascun sito.

Tabella 28: Variazione del RTT medio dopo applicazione della crema secondo l'invenzione o suo Placebo (26 volontari, n=19 misure x 3)

Crema secondo

RRT in ms l'invenzione Placebo

T0 T1mese T0 T1mese<Media>84,4 113,9 82,8 90,9

<+ E>41,3 58,1 34,4 36,9

% variazione vs.T0 35% 9.8% Significatività p<0,01 dns Significatività vs

p<0,05

placebo

I risultati mostrano un aumento significativo del 25,2% (p<0,05) del RTT medio in seguito al trattamento con la crema secondo l'invenzione rispetto al lato placebo. Questo traduce una migliore densità della pelle.

• Misura dello spessore del derma tramite ecografia.

L'ecografia ultrasonora è una tecnica molto provata per misurare lo spessore della pelle. Quando gli ultrasuoni incontrano uno strato tissutale nel corpo umano, sono riflessi e rinviano un segnale, o “eco”. L'intensità degli echi, una volta tradotta dall'ecografo in livelli di grigio, permette di ricostruire un'immagine anatomica fedele della zona esplorata.

L'apparecchio utilizzato è Dermascan C (Cortex Technology, Danimarca), fornito di una sonda di frequenza 20 MHz che permette di ottenere immagini di 12 mm di larghezza su 15 mm di spessore. Una sequenza di immagini successive è stata realizzata di cui 5 immagini rappresentative sono state estratte e analizzate.

Tabella 29: Variazione dello spessore del derma dopo applicazione del prodotto secondo l'invenzione o il suo Placebo (29 volontari, n=5 misure).

Crema secondo

Placebo Spessore (µm) l'invenzione

T0 T1mese T2mese T0 T1mese T2mese<Media>925 958 973 926 923 940<+/- E-tipo>86 80 97 105 87 106 Variazione vs T0 33µm 49µm -3µm 14µm % variazione vs.T0 3,6% 5,2% -0,3% 1.5% Significatività p<0,01 p<0,01 dns dns Significatività vs

p<0,05 p<0,05

placebo

Questi risultati mostrano che l'applicazione della crema secondo l'invenzione produce in media un aumento significativo dello spessore del derma di 33µm (+3,6%; p<0,01). In parallelo, il sito avente ricevuto il placebo non varia. Il confronto tra i due siti è a favore della crema secondo l'invenzione (p<0,05). In modo vantaggioso l'effetto si amplifica a T2mese per raggiungere 5,3% (p<0,05 vs placebo). Così il miglioramento dell'elasticità e della tonicità sono correlati con l'aumento dello spessore del derma osservato qui e l'aumento della densità misurata al reviscometer. Tutto ciò traduce un miglioramento qualitativo della pelle e delle fibre dermiche in particolare.

• Effetto lisciante sulle “zampe di gallina”.

Un'analisi dell'effetto lisciante globale del rilievo è stata realizzata sulle “zampe di gallina” di ciascun lato del viso all'inizio e alla fine delle applicazioni (2mese). Impronte negative sono state digitalizzate dalla tecnica delle ombre apportate grazie a una stazione Visioline VL650 (Monaderm, Monaco). L'immagine ottenuta è in seguito analizzata dal software specifico Mountains Map (Digital Surf, Francia) per quantificare il parametro che determina al massimo l'effetto lisciante globale: la complessità. La complessità di una superficie, è il rapporto tra l'area sviluppata (area occupata se si tende il rilievo di una superficie per renderla piatta) e l'area non sviluppata. Si ottiene una percentuale che, se diminuisce, indica una lisciatura del rilievo.

Tabella 30: Variazione della complessità dopo applicazione della crema secondo l'invenzione o del suo Placebo (29 volontari, n=1 misura)

Crema secondo

l'invenzione Placebo Complessità (%) Complessità (%) T0 T2mese T0 T2mese<Media>28,86 25,42 28,24 27,44<E-tipo>9,84 8,53 9,69 8,02

% variazione vs.T0 -11,9% -2,8% Significatività p<0,01 dns Significatività vs

p<0,01

placebo

Si constata dopo 2 mesi d'applicazione della crema secondo l'invenzione una lisciatura del rilievo molto significativa (p<0,01) di circa -12%. Sul lato placebo la diminuzione è trascurabile e non significativa (- 3%). Il confronto dei due lati è molto a favore della crema secondo l'invenzione (p>0,01).

2) Aumento dello spessore dell'epidermide:

• Misura dello spessore dell'epidermide tramite microscopia confocale laser

L'epidermide è nota assottigliarsi con l'età in particolare sulla mano. Per valutare questo parametro, l'epidermide è stata analizzata per mezzo della tecnica di microscopia confocale laser con il Vivascope 3000 (Mavig, Germania) che possiede una pratica sonda portatile.

La luce emessa dall'apparecchio (lunghezza d'onda 830nm) è riflessa nella pelle differentemente secondo l'indice di rifrazione delle strutture incontrate; cheratina, melanina, strutture microcellulari come i collageni appariranno in bianco su un'immagine in scala di grigi. Vivascope permette da un lato di “illuminare” un punto preciso nella pelle (focalizzazione dell'illuminazione) e in parallelo di individuare precisamente la luce in fantasma (focalizzazione della rilevazione). Questo dispositivo è nominato “confocale” per “conjugate focal planes”. Questo permette di realizzare una vera biopsia in tempo reale della pelle in modo completamente non invasivo per lo studio della pelle sana, della sua pigmentazione, dell'invecchiamento, del fotoinvecchiamento o dello spessore degli strati della pelle. In occasione dello studio, acquisizioni verticali intervallate di 2,6µm sono state realizzate per colorare l'epidermide completo. La misura dello spessore dell'epidermide vivo situato tra la fine dello stratum corneum e l'inizio delle papille è stato successivamente realizzato manualmente su alcuni siti di una stessa acquisizione al fine di spiegare eventuali variazioni locali. Gli spessori così calcolati sono in accordo con quelli della letteratura sul sito particolare delle mani.

Tabella 31: Variazione dello spessore dell'epidermide dopo applicazione della crema secondo l'invenzione o suo Placebo (22 volontari, n=2 misure)

Crema secondo l'invenzione Placebo

T0 T1mese T0 T1mese<Media>31,00 35,75 31,18 32,95<E-tipo>7,98 8,04 7,23 6,81 Variazione in µm vs T0 4,75µm1,77µm% variazione vs.T0<15,3%>5,7% Significatività p<0,01 dns Significatività vs

p=0,06

placebo

L'analisi dei risultati mostra un aumento dell'epidermide viva dopo applicazione della crema secondo l'invenzione. In modo notevole, questo aumento significativo (p<0,01) raggiunge 4,75µm (+15%) rispetto a T0. Il sito trattato con il placebo mostra solo un aumento non significativo di 1,77µm (+5,7%), e il confronto con la crema secondo l'invenzione mostra una differenza di 3µm (circa 10%) a suo favore (p=0,05).

D'altra parte considerando solo il 72% di rispondenti al trattamento, i risultati mostrano un aumento ben più importante del lato trattato con la crema secondo l'invenzione (+8,21µm) rispetto al lato trattato con il placebo (+3,03µm), causando una differenza significativa (p<0,05) di 5µm (circa 17%).

Questa rigenerazione del numero di strati cellulare dell'epidermide viene ad aggiungersi all'effetto vitalizzante già osservato sul derma.

• Riduzione della pigmentazione, analisi tramite fotografie

A T0 e dopo 2 mesi di applicazioni, sono state realizzate fotografie con un banco fotografico utilizzando un apparecchio digitale ad alta definizione, un'illuminazione specifica e un sistema di posizionamento della mano dei volontari. La posizione della mano, i parametri fotografici e d'illuminazione erano standardizzati e controllati per essere riprodotti nel corso del tempo.

Una zona iperpigmentata con macchie o pigmentata senza macchie sono state selezionate, il parametro L* o chiarezza è stato analizzato in ciascuna fotografia per mezzo del software Colorskin<TM>, ricercando un aumento di L*. La chiarezza della pelle umana non evolvendo tuttavia nella totalità della scala dell'apparecchio, un valore costante di L*=30 è stato detratto permettendo di disporre di una scala più “fisiologica”.

Tabella 32: Variazione della chiarezza della pelle L* dopo applicazione del prodotto secondo l'invenzione o del suo Placebo (26 volontari, n=1 misure)

Crema secondo

l'invenzione Placebo

Chiarez Zona con Zona senza Zona con Zona senza za L* macchia di macchia di macchia di macchia di senescenza senescenza senescenza senescenza

T0 T2 T0 T2 T0 T2 T0 T2

<Media>14,5 19,1 27,1 30,4 16,1 19,6 27,4 29,2<E-tipo>5,7 5,4 3,3 3,6 5,6 5,5 3,8 3,7 Variazi

one vs 4,6 3,3 3,5 1,8 T0

%

variazi 21,7

31,7% 12,2% 6,6% one %

vs.T0

Signifi

p<0,0 p<0,0 p<0, p<0, cativit

1 1 01 01 à

Signifi

cativit p<0,0 p<0,0

à vs 5 5

placebo

Questi risultati mostrano che l'applicazione della crema secondo l'invenzione comporta uno schiarimento significativo delle zone pigmentate. Così, la variazione di L* osservata per le zone con macchie o senza macchie è rispettivamente del 31,7% e del 12,2% rispetto a T0, cosa che costituisce uno schiarimento superiore (p<0,05) a quello osservato sul sito trattato dal placebo che è rispettivamente del 21,7% e del 6,6%.

Occorre osservare che l'effetto depigmentante è osservabile tanto per le zone con macchie che per il loro ambiente e questo contribuisce a farne un effetto globale.

• Riduzione delle macchie, analisi su adesivi Prelievi di stratum corneum sono stati effettuati per mezzo di adesivi (Dsquam; Cuderm) e sono stati colorati con il metodo di Fontana Masson per mettere in evidenza la melanina persistente nello stratum corneum. Fotografie standardizzate sono state effettuate e analizzate per quantificare questa pigmentazione residua espressa in percentuale di melanina rispetto al resto non pigmentato. Tenuto conto della pesantezza del metodo, solo 14 volontari sono stati prelevati.

Tabella 33: Variazione di quantità di melanina ritrovata nello stratum corneum 2 mesi dopo applicazione del prodotto secondo l'invenzione o del suo Placebo (14 volontari, n=1 misura)

Crema secondo Placebo l'invenzione

Melanina (%) Melanina (%) T0 T2mese T0 T2mese<Media>6,337 4,703 5,818 4,951<E-tipo>1,5 1,4 1,1 1,1 % variazione

vs.T0 -26% -15% Significatività p<0,01 p<0,01 Significatività

p<0,01

vs placebo

Si nota dunque una riduzione della quantità di melanina dei due lati ma superiore sul lato che ha ricevuto la crema al 2% del prodotto secondo l'invenzione. La differenza tra i due è chiaramente a favore di quest'ultimo e molto significativa (- 11%; p<0,01). Questi risultati confermano dunque quelli ottenuti dal metodo fotografico sulle mani.

Claims (13)

1. RIVENDICAZIONI 1. Metodo di fabbricazione in vitro di cellule meristematiche di Plantago lanceolata contenente fenilpropanoidi glicosidici a partire da una linea cellulare stabilizzata, comprendente le fasi seguenti: -a partire dalla linea, produrre una pre-biomassa critica mediante pre-culture successive e di dimensioni crescenti; -produrre una biomassa di dette cellule meristematiche in un bioreattore a partire da detta pre-biomassa e un terreno di coltura adeguato; e -separare detta biomassa arricchita di fenilpropanoidi glicosidici di detto terreno di coltura e recuperare così dette cellule meristematiche, caratterizzato dal fatto che la linea cellulare è la linea IRB PL3. 2. Linea cellulare di Plantago lanceolata di riferimento IRB PL3. 3. Cellule meristematiche di Plantago lanceolata ottenute con la linea IRB PL3 o secondo il metodo della rivendicazione 1. 4. Cellule secondo la rivendicazione 3, comprendente il plantamaioside come componente maggioritario fenilpropanoide glicoside. 5. Estratto cellulare ottenuto a partire dalle cellule secondo la rivendicazione 3 o 4. 6. Composizione comprendente cellule meristematiche di Plantago lanceolata secondo la rivendicazione 3 o 4, o un estratto secondo la rivendicazione 5, in un mezzo fisiologicamente accettabile. 7. Composizione cosmetica secondo la rivendicazione 6, comprendente almeno lo 0,1% di fenilpropanoidi glicosidici. 8. Utilizzo delle cellule secondo la rivendicazione 3 o 4, dell'estratto secondo la rivendicazione 5, o della composizione secondo la rivendicazione 6 o 7 per un trattamento cosmetico non terapeutico. 9. Utilizzo secondo la rivendicazione 8, per combattere l'invecchiamento della pelle e delle fanere. 10. Utilizzo di cellule meristematiche di Plantago lanceolata o d'estratto cellulare di dette cellule, o utilizzo secondo la rivendicazione 8 o 9, per compattare il derma, rafforzare la giunzione dermo-epidermica, ispessire l'epidermide e/o apportare alla pelle mezzi di difesa antiantiglicazione. 11. Utilizzo secondo una delle rivendicazioni da 8 a 10 per diminuire l'espressione di uno o più miRNA fra 29,21,196a, 30a, 34a, 152, e 181a. 12. Utilizzo di cellule meristematiche di Plantago lanceolata o d'estratto cellulare di dette cellule, delle cellule secondo la rivendicazione 3 o 4, dell'estratto secondo la rivendicazione 5, o della composizione secondo la rivendicazione 6 o 7, per un'applicazione nutraceutica, in particolare per rafforzare la parete intestinale. 13. Cellule meristematiche di Plantago lanceolata o estratto cellulare di dette cellule, o cellule secondo la rivendicazione 3 o 4, estratto secondo la rivendicazione 5, o composizione secondo la rivendicazione 6 o 7, per una cura medica dermatologica, in particolare per trattare i disturbi della pigmentazione, i disturbi di natura infiammatoria come la dermatite atopica, la psoriasi, l'acne), le dermatosi bollose, le malattie che causano disordini nelle sintesi del collagene, dell'elastina dell'acido ialuronico, e/o le pelli secche, le couperose e/o l’ittiosi. REVENDICATIONS 1. Procédé de fabrication in vitro de cellules méristématiques de Plantago lanceolata contenant des phénylpropanoïdes glycosides à partir d’une lignée cellulaire stabilisée, comprenant les étapes suivantes : - à partir de la lignée, produire une pré-biomasse critique par des pré-cultures successives et de tailles croissantes ; - produire une biomasse desdites cellules méristématiques dans un bioréacteur à partir de ladite pré-biomasse et un milieu de culture adapté ; et - séparer ladite biomasse enrichie en phénylpropanoïdes glycosides dudit milieu de culture et récupérer ainsi lesdites cellules méristématiques, caractérisé en ce que la lignée cellulaire est la lignée IRB PL3.
2. 2. Lignée cellulaire de Plantago lanceolata de référence IRB PL3.
3. 3. Cellules méristématiques de Plantago lanceolata obtenues avec la lignée IRB PL3 ou selon le procédé de la revendication 1.
4. 4. Cellules selon la revendication 3, comprenant le plantamajoside comme composant majoritaire phénylpropanoïde glycoside.
5. 5. Extrait cellulaire obtenu à partir des cellules selon la revendication 3 ou 4.
6. 6. Composition comprenant des cellules méristématiques de Plantago lanceolata selon la revendication 3 ou 4, ou un extrait selon la revendication 5, dans un milieu physiologiquement acceptable.
7. 7. Composition cosmétique selon la revendication 6, comprenant au moins 0,1% de phénylpropanoïdes glycosides.
8. 8. Utilisation des cellules selon la revendication 3 ou 4, de l’extrait selon la revendication 5, ou de la composition selon la revendication 6 ou 7 pour un traitement cosmétique non thérapeutique.
9. 9. Utilisation selon la revendication 8, pour combattre le vieillissement de la peau et des phanères.
10. 10. Utilisation de cellules méristématiques de Plantago lanceolata ou d’extrait cellulaire desdites cellules, ou utilisation selon la revendication 8 ou 9, pour densifier le derme, renforcer la jonction dermoépidermique, épaissir l’épiderme et/ou apporter à la peau des moyens de défense anti- anti-glycation.
11. 11. Utilisation selon l’une des revendications 8 à 10 pour diminuer l’expression d’un ou plusieurs miRNA parmi 29, 21, 196a, 30a, 34a, 152, et 181a.
12. 12. Utilisation de cellules méristématiques de Plantago lanceolata ou d’extrait cellulaire desdites cellules, des cellules selon la revendication 3 ou 4, de l’extrait selon la revendication 5, ou de la composition selon la revendication 6 ou 7, pour une application nutraceutique, notamment pour renforcer la paroi intestinale.
13. 13. Cellules méristématiques de Plantago lanceolata ou extrait cellulaire desdites cellules, ou cellules selon la revendication 3 ou 4, extrait selon la revendication 5, ou composition selon la revendication 6 ou 7, pour un traitement médical dermatologique, notamment pour traiter les troubles de la pigmentation, les troubles de nature inflammatoire comme la dermatite atopique, le psoriasis, l’acné), les dermatoses bulleuses, les affections mettant en cause des désordres dans les synthèses du collagène, de l’élastine de l’acide hyaluronique, et/ou les peaux sèches, la couperose et/ou l’ichtyose.