FR3031454A1

FR3031454A1 - Utilisation de cellules vegetales de leontopodium alpinum pour un traitement cosmetique et ingredient actif cosmetique correspondant

Info

Publication number: FR3031454A1
Application number: FR1550239A
Authority: FR
Inventors: Olga Gracioso; Caroline Ringenbach; Emmanuel Doridot; Philippe Mondon
Original assignee: Sederma SA
Current assignee: Sederma SA
Priority date: 2015-01-13
Filing date: 2015-01-13
Publication date: 2016-07-15
Anticipated expiration: 2035-01-13
Also published as: CN107106478A; WO2016113659A1; EP3244971A1; FR3031454B1

Abstract

Selon l'invention, il est proposé l'utilisation de cellules végétales indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par culture cellulaire in vitro, pour un traitement cosmétique non thérapeutique pour restaurer l'homéostasie des cellules de la peau âgée et accroître leur activité métabolique et énergétique. Grâce à ce traitement on obtient un effet réparateur tenseur et lisseur sur une peau déjà âgée, notamment prononcé sur la surface tombante du cou.

Description

1 La présente invention se rapporte à l'utilisation de la plante Leontopodium nivale subsp. alpinum Cass, ci-après appelée Leontopodium alpinum, pour un traitement cosmétique (par voie topique ou orale). La présente invention concerne ainsi l'industrie des cosmétiques et des produits d'hygiène et de soins personnels, s'appliquant à la peau et ses phanères (tels que poils, cils, sourcils, ongles, cheveux) de 5 mammifères, animaux ou humains. Le Leontopodium alpinium, connu aussi sous le nom d'Edelweiss, est une plante herbacée de la famille des Asteraceae. Elle pousse en altitude au-delà de 1500 m sur les chaînes de montagnes des Pyrénées, des Alpes et de l'Himalaya, dans des zones peu hospitalières comme des ravines, des zones rocheuses, froides et très exposées aux UV. De ce fait, c'est une plante qui présente une excellente 10 adaptation à ces conditions extrêmes au travers d'une panoplie de molécules d'intérêts et grâce à des poils protecteurs sur sa fleur et ses feuilles. En revanche, elle est relativement peu distribuée et ainsi plutôt rare. Des produits issus de la plante peuvent être obtenus par des méthodes d'extraction classiques directement à partir de la plante entière ou de ses parties ou par des méthodes de culture in vitro soit 15 par culture cellulaire soit par culture de tissu à partir de lignées cellulaires ou tissulaires issues de différents organes de la plante. La présente invention concerne plus particulièrement les produits obtenus suite à de la culture in vitro de cellules ou de tissus. L'obtention par culture in vitro d'extraits d'origine végétale possède de nombreux avantages sur la 20 voie agro-industrielle (culture de plantes en plein champ et extraction ultérieure en usine). Du fait de la maîtrise totale des conditions de cultures, les extraits obtenus par culture in vitro sont exempts de substances toxiques (herbicides, pesticides, engrais, métaux lourds et autres contaminants, comme ceux pouvant provenir de parasites des végétaux). Par ailleurs, le strict contrôle des conditions de culture in vitro réduit le risque de variation spontanée de la souche et garantit un profil reproductible 25 de métabolites secondaires qui correspondent aux molécules d'intérêt recherchées, contrairement à la culture en plein champ où se pose le problème de la variabilité, liée aux conditions climatiques, météorologiques et géographiques et de leur aléas. Par ailleurs encore, cette technologie s'affranchit d'obstacles tels que le cycle biologique naturel de la plante et la saisonnalité de production des métabolites secondaires, permettant une meilleure sécurité et rapidité d'approvisionnement. De plus, 30 l'impact environnemental est minimal car limitant substantiellement la consommation en eau, évitant une consommation de terres arables, et prévenant de la pollution des sols. En outre, la biodiversité est préservée puisqu'il suffit d'un plant ou même d'une graine, pour initier une nouvelle culture in vitro. Enfin, cette technologie offre la possibilité d'orienter le métabolisme cellulaire vers la production des molécules d'intérêt (élicitation des cultures) et de réaliser des protocoles contrôlés et relativement 35 rapides en vue d'augmenter les rendements en certaines molécules celles notamment produites en faible quantité dans la plante. 3031454 2 Parmi les techniques existantes à ce jour dans le domaine de la culture in vitro des végétaux, on peut utiliser selon l'invention : - la culture de cellules indifférenciées ou dédifférenciées : ce type de méthode comprend d'abord la création de lignées cellulaires fortement prolifératives en milieu gélosé soit à partir de cellules méristématiques qui sont des cellules indifférenciées, soit à partir de cellules dédifférenciées (poussant sous la forme de cals, suite au prélèvement d'un fragment de plante, feuille, tige, racine ou autre). Ces lignées sont ensuite cultivées en milieu liquide de façon à augmenter substantiellement la biomasse. À la fin du cycle de croissance et dans des conditions de milieu à définir et optimiser (recherche du bon milieu d'élicitation), la biomasse cellulaire va synthétiser les molécules d'intérêt. La culture est ensuite stoppée et soumise à une extraction au moment optimal de façon à obtenir une quantité maximale de molécules d'intérêt. A l'origine, on peut aussi utiliser des lignées cellulaires existantes déjà disponibles dans le commerce. - la culture de tissu ou d'organe : ce type de culture peut concerner la partie racinaire (« root culture » en anglais), la partie aérienne (« shoot culture ») ou les embryons somatiques (« somatic embryo »). Dans ce type de méthode, on distingue les cultures ayant fait l'objet d'une transformation génomique par les bactéries Agrobactérium rhizogens (racines) ou Agrobactérium tumefasciens (tiges). Les cultures ainsi transformées de racines ou de parties aériennes ont un taux de croissance élevée et sont génétiquement très stables. Elles sont utilisées pour synthétiser les molécules d'intérêt après optimisation des paramètres d'élicitation. Ces cultures sont ensuite extraites par les voies classiques. De façon préférentielle, la présente invention est plus particulièrement dirigée vers des produits issus de la culture in vitro de cellules indifférenciées ou dédifférenciées, ci-après appelée culture cellulaire végétale.

Les méthodes in vitro de culture cellulaire consistent schématiquement : - le cas échéant dans un premier temps, à établir des lignées cellulaire à partir de cals (amas de cellules indifférenciées ou dédifférenciées) obtenus sur des coupures de parties de plantes (feuille, racine, tige, bourgeons ....) ; - sélectionner une lignée cellulaire capable de produire à grande échelle une biomasse de cellules selon des critères pré-établis (phénotype constant et production optimale et constante de métabolites choisis, capacité à proliférer) ; - puis à partir de cette lignée sélectionnée, à générer ladite biomasse cellulaire, éventuellement avec une étape d'élicitation, de préférence en fin de phase de prolifération ; et - dans un troisième temps, à traiter la biomasse cellulaire obtenue pour récupérer les cellules entières, casser les agrégats cellulaires par une homogénéisation sous haute pression ou lyser ces cellules et le cas échéant extraire ensuite le contenu desdites cellules.

3031454 3 Ce sont ces extraits et/ou cellules entières ou lysées qui peuvent ensuite être utilisés dans des compositions cosmétiques en tant qu'ingrédient actif avec un excipient physiologiquement acceptable et éventuellement d'autres ingrédients actifs complémentaires. La demande de brevet EP2319914 décrit cette technique in vitro pour obtenir des cellules 5 indifférenciées en culture avec un rendement élevé en dérivés d'acide caféique pour une liste théorique de 33 espèces de plantes dont le Leontopodium alpinum. Les dérivés d'acide caféique concernés comprennent les phénylpropanoïdes glycosides ainsi que des acides caffeoylquiniques. Une activité inhibitrice de la hyaluronidase est présentée pour Leontopodium alpinum. Protéger l'acide hyaluronique de la digestion par la hyaluronidase permet à titre préventif de préserver l'intégrité du 10 derme. La présente invention a pour but de proposer une nouvelle utilisation de cellules de Leontopodium alpinum obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro pour un traitement cosmétique. A cet effet, elle propose l'utilisation de cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro pour un traitement cosmétique non 15 thérapeutique pour restaurer l'homéostasie des cellules de la peau âgée et accroître leur activité métabolique et énergétique. L'homéostasie des cellules du derme âgé se traduit par : 1) Un rééquilibrage entre MMP (« Matrix Metallo Proteases » : protéases de la matrice dermique) et TIMP (« Tissue Inhibitor of Metallo Proteinases » - inhibiteur tissulaire de protéases de la matrice 20 dermique), en faveur de ces derniers. Les MMP sont nombreuses (plus de 20), elles sont produites sous une forme latente (pro-MMP) afin d'éviter un emballement incontrôlé. Leur production augmente avec l'âge mais les stress aigus ou chroniques amplifient ce phénomène. Leur production trop importante conduit à la réduction de la tenue du derme, à la perte de sa densité, à son affinement. Ainsi les MMP 25 conduisent à faire vieillir la peau plus vite et plus mal. Alors que les fibres du derme dans les peaux jeunes sont longues, intactes et denses, celles des peaux âgées sont au contraire fragmentées et moins denses. Cette moindre qualité des fibres réduit la tension dynamique du derme, les interactions entre la MEC et les fibroblastes étant par ailleurs réduites parfois de 80%. Les MMP sont contrôlées naturellement dans les tissus par leurs inhibiteurs les TIMP ce qui évite 30 une activité aveugle. C'est la balance des TIMP par rapport aux MMP qui détermine le niveau d'activité de ces dernières. Les TIMP sont des petites glycoprotéines dont la production est associée à la réduction des pathologies chroniques liées aux MMP et à une réduction des photo-dommages liés aux UV. En s'associant avec les MMP, les TIMP les neutralisent et limitent donc les fragmentations de la matrice dermique, qui conserve ainsi son élasticité. Par ailleurs, on 35 considère que TIMP-1 est un facteur de survie favorable pour les fibroblastes et les kératinocytes.

3031454 4 La baisse de production du TIMP-1 est observée sous l'effet d'irradiation UV mais aussi au cours de la sénescence des fibroblastes. Ceci se traduit par l'augmentation de l'activité des MMP. 2) Une stimulation de la production des thrombospondines (TSP). Ce sont des glycoprotéines matricielles produites par l'épiderme et le derme dont l'intérêt scientifique va croissant. La TSP-1, 5 une fois surexprimée expérimentalement dans l'épiderme de souris permet de réduire efficacement les méfaits des irradiations des UVB. De façon intéressante, on a pu observer une nette amélioration de l'organisation des fibres de collagène et d'élastine du derme sous-jacent ainsi que la réduction de formation des rides sur la peau. Ceci serait lié au contrôle des facteurs proangiogéniques et protéasiques. Son homologue, la TSP-2, possède également un rôle 10 antivieillissement potentiel important. En effet, des souris ne pouvant pas produire cette protéine, montrent des dermes comportant des fibres de collagènes moins organisées, désordonnées et leur peau est plus fragile à l'extension. Leurs fibroblastes fournissent des dermes artificiels également plus lâches et moins denses qui ne contractent pas normalement. Les TSP-1 et TSP-2 semblent agir sur plusieurs points clefs du vieillissement notamment en 15 inhibant l'activité des MMP, dont celle de la MMP-9. Par ailleurs l'augmentation de production du TSP-1 est aussi connue pour rétablir la synthèse de pro-collagène diminuée par une irradiation UVB. Ce rétablissement passe par l'activation du TGF-f3 bien connu pour stimuler la synthèse des collagènes. A l'opposé, les fibroblastes ne pouvant produire TSP-2 surproduisent MMP-9. Ainsi, il apparaît clairement que l'expression des TSP, y compris par les kératinocytes, représente un 20 atout favorable pour la qualité du derme et de la peau et, au côté des TIMP, limitent son vieillissement. L'accroissement des activités métaboliques des fibroblastes dermiques se traduit par une amélioration des capacités contractiles et par une augmentation de la production des macromolécules du derme. Concernant l'activité énergétique des fibroblastes : chaque cellule de l'organisme produit, grâce à 25 l'oxygène de l'air, sa propre énergie à partir d'unités de production, appelées les mitochondries, en plus ou moins grand nombre selon les besoins énergétiques du tissu. Avec l'âge la mitochondrie perd de son efficacité et convertie moins d'oxygène qu'auparavant. Les fibroblastes possèdent des mitochondries en forme de filaments de 1 à 10um au contraire d'autres types cellulaires, avec un fort pouvoir multiplicatif, où elles sont plutôt ovoïdes. Cependant les deux 30 formes, isolée ovoïde (fission) ou en réseau filamenteux (fusion), coexistent dans chaque type cellulaire. La préservation du dynamisme de passage d'un état à l'autre est cruciale pour le maintien des fonctions mitochondriales. Si la fission est essentielle à la division cellulaire en permettant de répartir le pool de mitochondries dans les cellules filles, la fusion permet de mettre en commun gènes et molécules nécessaires au maintien de la respiration cellulaire.

35 Il a été observé que les cellules sénescentes sont riches en forme fusionnée ce qui permet là encore une prolongation de leur survie.

3031454 5 Selon l'invention, les cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium peuvent être utilisées après avoir été mélangées sous haute pression, afin d'homogénéiser le milieu et de casser les agrégats cellulaires. Selon l'invention, les cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium peuvent 5 être utilisées entières ou lysées, ou encore sous forme d'un extrait cellulaire réalisé à partir de ces cellules. Selon l'invention, les cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium peuvent être extraites par tout solvant physiologiquement acceptable, ou par un mélange quelconque de ces solvants. L'extraction peut se faire selon les différents procédés connus qu'il est possible de 10 combiner : à chaud, par macération, décoction, infusion, pression, lixiviation, aux ultra-sons, aux micro-ondes, en lysant les cellules par tout procédé chimique ou physique approprié. La séparation des phases peut se faire par filtration ou centrifugation. Alternativement, il est possible d'extraire la biomasse avec un fluide supercritique ou subcritique. Selon l'invention, on peut aussi envisager également une purification poussée de l'extrait cellulaire par 15 toutes les méthodes disponibles industriellement, par partage liquide-liquide ou chromatographie, notamment à l'aide d'une résine adsorbante, afin de concentrer les molécules d'intérêt telles que les deux acides léontopodiques A et/ou B. Selon l'invention, les cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium peuvent être également utilisées sous une forme séchée par atomisation ou lyophilisation de préférence. Cela 20 permet leur stockage à long-terme et préserve leur activité biologique. Dans la suite de la description, l'expression « cellules végétales » englobera les cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro, qu'elles soient entières ou lysées, qu'elles aient ou non subi une homogénéisation à haute pression, qu'elles soient fraiches ou sous forme sèche, ainsi que les extraits issus de ces cellules.

25 Selon l'invention, les cellules végétales peuvent être incorporées (mises en suspension ou solubilisées) dans un milieu physiologiquement acceptable et utilisées pour réaliser une composition cosmétique destinée à restaurer l'homéostasie des cellules de la peau âgée et accroître leur activité métabolique et énergétique. De préférence, selon l'invention, le milieu physiologiquement acceptable est une matrice hydrophile.

30 De préférence encore, le traitement cosmétique selon l'invention est topique. De manière surprenante la Demanderesse a montré par des tests in vivo que le traitement cosmétique de peaux âgées par l'application d'une composition contenant des cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro induisait sur ces peaux un effet curatif ou réparateur, tenseur et/ou de lissage, et notamment sur la 35 surface tombante du cou et le pli de la vallée des larmes.

3031454 6 Les résultats de ces tests sont présentés plus en détails ci-après dans la description. L'invention propose enfin l'utilisation des cellules végétales, telles que définies ci-dessus, pour la fabrication d'un ingrédient actif cosmétique non thérapeutique, ainsi que l'utilisation d'une composition comprenant ledit ingrédient actif mis en suspension et/ou solubilisé dans un milieu 5 physiologiquement acceptable, pouvant être une matrice hydrophile, pour restaurer l'homéostasie des cellules de la peau âgée et accroître leur activité métabolique et énergétique. Selon l'invention, on utilise des cellules végétales riches en acides léontopodiques A et/ou B, de préférence A et B. Des protéines, des acides aminés, des phytostérols, des lipides et des polysaccharides ont également été identifiés comme catégories de composés dans les cellules 10 végétales utilisées selon l'invention. Selon d'autres caractéristiques enfin, la présente invention propose donc un ingrédient actif cosmétique, pour une utilisation selon l'invention, comprenant des cellules végétales indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro et comprenant au moins 0,04% d'acides léontopodiques A et B dans une matrice physiologiquement 15 acceptable. De préférence, dans cet ingrédient et comme développé plus haut, les cellules végétales sont entières et/ou lysées, ou bien les cellules se trouvent sous forme d'un extrait cellulaire desdites cellules entières et/ou lysées. Pour obtenir les cellules dédifférenciées ou indifférenciées utilisables selon l'invention, le procédé suivant peut être mis en oeuvre : 20 1) à partir d'une lignée sélectionnée de Leontopodium alpinum, produire une pré-biomasse critique par des pré-cultures successives et de tailles croissantes ; 2) produire une biomasse desdites cellules indifférenciées dans un bioréacteur à partir de ladite pré-biomasse et un milieu de culture adapté ; et 3) séparer ladite biomasse enrichie en acides léontopodiques dudit milieu de culture et récupérer 25 ainsi lesdites cellules indifférenciées. Selon d'autres caractéristiques optionnelles : 1) l'étape de production en bioréacteur peut comprendre une étape d'élicitation, cela permettant avantageusement d'augmenter les taux en acides léontopodiques A et/ou B ou d'en faire varier la proportion relative ; et/ou 30 2) on récolte la biomasse issue du réacteur par filtration après un temps de culture entre 7 et 21 jours ; de préférence entre 10 et 14 jours cela permettant avantageusement de produire la plus forte quantité de biomasse, avec une grande viabilité ; et/ou 3) la biomasse peut être soumise à une étape d'homogénéisation sous haute pression, afin de casser les agrégats cellulaires ; et/ou 3031454 7 4) une étape supplémentaire de séchage de la biomasse cellulaire peut-être ajoutée, de façon à la conserver à long terme ; et/ou 5) Les cellules pourront être extraites notamment dans un but d'enrichissement en acides léontopodiques A et B.

5 D'une manière générale, l'élicitation des composés d'intérêt peut se faire par l'addition à la culture de fractions microbiennes (notamment des levures saccharomyces) : l'addition à la culture de molécules d'origine biologique comme par exemple le chitosan, le méthyljasmonate, l'acide jasmonique, l'acide salicylique ; l'addition à la culture de molécules d'origine non biologique comme par exemple le paclobutrazol ; l'application à la culture d'une variation de température, de pH ou d'un stress 10 osmotique induit par un sucre non métabolisable, comme par exemple le mannitol ; le recours à un appauvrissement encore plus drastique du milieu en macroéléments et sucre ; l'addition à la culture de résines adsorbantes qui en plus d' éliciter la production des composés d'intérêt pourront les piéger. De préférence selon l'invention, l'élicitation est réalisée en modifiant le milieu de culture, notamment les taux de nutriments.

15 Préparation de compositions pour la mise en oeuvre de l'invention Une composition cosmétique, notamment topique, comprend des cellules végétales dans un milieu physiologiquement acceptable. Selon l'excipient et le dosage en cellules végétales, cette composition constituera un ingrédient actif concentré ou une composition finale moins concentrée directement destinée à l'utilisateur final.

20 Par « milieu physiologiquement acceptable » on entend selon la présente invention, sans être limitatif, une solution aqueuse ou hydro alcoolique, une émulsion eau-dans-huile, une émulsion huile-dans-eau, une microémulsion, un gel aqueux, un gel anhydre, un sérum, une dispersion de vésicules, une poudre. « Physiologiquement acceptable » signifie que les compositions conviennent à une utilisation topique ou par voie orale, en contact avec les muqueuses, les ongles, le cuir chevelu, les cheveux, les poils et la peau 25 de mammifère et plus particulièrement humaine, des compositions pouvant être ingérées ou injectées dans la peau, sans risque de toxicité, d'incompatibilité, d'instabilité, de réponse allergique, et autres. Ce « milieu physiologiquement acceptable » forme ce que l'on appelle classiquement l'excipient de la composition. Les cellules végétales peuvent être associées à d'autres ingrédients actifs à des concentrations 30 efficaces pouvant agir de façon synergique ou en renfort pour atteindre les effets souhaités décrits pour l'invention, tels que les agents suivants : filtrant les radiations, notamment UVA et/ou UVB, hydratant, humectant, calmant, myorelaxant, amincissant, restructurant, raffermissant, repulpant, tenseur, agissant sur la microcirculation, agissant sur l'inflammation, sur les radicaux libres, antirides, éclaircissants, agissant sur l'éclat du teint, anti-glycation, pro-pigmentants, agissants sur la 3031454 8 couche cornée, sur la jonction derme-épiderme, sur la production de protéine HSPs, sur la fermeté, l'élasticité, la tonicité de la peau, la repousse des poils peptides, vitamines etc. Les cellules végétales peuvent être appliquées selon l'invention sur le visage, le corps, le décolleté, le cuir chevelu, les cheveux, les cils, les poils, sous n'importe quelle forme ou véhicule connus de 5 l'homme de l'art, notamment sous forme de solution, de dispersion, d'émulsion, de pâte ou de poudre, individuellement ou en pré-mélange ou être véhiculée individuellement ou en pré-mélange par des vecteurs comme les macrocapsules, les microcapsules ou les nanocapsules, les macrosphères, les microsphères, ou les nanosphères, les liposomes, les oléosomes ou les chylomicrons, les macroparticules, les microparticules ou les nanoparticules, macroéponges, les microéponges ou les 10 nanoéponges, les microémulsions ou les nanoémulsions, ou adsorbé sur des polymères organiques poudreux, les talcs, bentonites, spores ou exines et autres supports minéraux ou organiques. En cosmétique notamment, des applications peuvent être proposées notamment dans les gammes de soins de la peau du visage, du corps, des cheveux et des poils et des gammes de maquillages-soins, notamment les cils et sourcils.

15 D'une manière générale, les cellules végétales selon la présente invention peuvent être utilisées sous n'importe quelle forme, dans une forme liée, incorporée ou adsorbée sur des macro -, micro -, et nanoparticules, ou sur macro-, micro- et nanocapsules, pour le traitement des textiles, des fibres naturelles ou synthétiques, des laines, et tous matériaux destinés à entrer en contact avec la peau et qui peuvent être employés dans l'habillement, les sous-vêtements de jour ou de nuit, les mouchoirs, ou les 20 tissus, afin d'exercer son effet cosmétique par l'intermédiaire de ce contact peau/textile et permettre une délivrance topique continue. Le CTFA (« International cosmetic ingredient dictionary & handbook » (13ème édition, 2010) publié par « the Cosmetic, Toiletry, and Fragrance Association, Inc. », Washington, D.C.) décrit une grande variété, sans limitation, d'ingrédients cosmétiques et pharmaceutiques habituellement utilisés dans 25 l'industrie du soin de la peau, qui conviennent pour être utilisés comme ingrédients additionnels dans les compositions selon la présente invention. D'autres actifs de soin de la peau additionnels qui sont particulièrement utiles peuvent être trouvés dans la documentation commerciale de Sederma et sur le site www.sederma.fr. On peut aussi citer à titre d'exemples les actifs commerciaux suivants : la bétaïne, le glycérol, 30 l'Actimoist Bio 2TM (Active organics), AquaCacteenTM (Mibelle AG Cosmetics), AquaphylineTM (Silab), AquaregulKTM (Solabia), CarcilineTM (Greentech), CodiavelaneTM (Biotech Marine), DermafluxTM (Arch Chemicals, Inc), Hydra'FlowTM (Sochibo), Hydromoist LTM (Symrise), RenovHyalTM (Soliance), SeamossTM (Biotech Marine), ArgirelineTM (nom commercial de l'acétyl hexapeptide-3 de Lipotec), le spilanthol ou un extrait d'Acmella oleracea connu sous le nom Gatuline ExpressionTM, un extrait de 35 Boswellia serrata connu sous le nom BoswellinTM, Deepaline PVBTM (Seppic), Syn-AKETM 3031454 9 (Pentapharm), AmelioxTM, BioxiliftTM (Silab), PhytoCellTecTMArgan (Mibelle), Papilactyl DTM (Silab), PreventheliaTM (Lipotec), SubliskinTM (Sederma), VenuceaneTM (Sederma), Moist 24TM (Sederma), Vegesome Moist 24TM (Sederma), EssenskinTM (Sederma), JuvinityTM (Sederma), RevidratTM (Sederma), ResistemTM (Sederma), ChronodynTM (Sederma), KombuchkaTM (Sederma), ChromocareTM (Sederma), 5 CalmosensineTM (Sederma), Glycokin factor STM (Sederma), BiobustylTM (Sederma), IdealiftTM (Sederma), Ceramide 2TM, Ceramide A2TM et Ceramide HO3TM (Sederma), LeganceTM (Sederma), IntenslimTM (Sederma), ProdiziaTM (Sederma), SenestemTM (Sederma), BeautifeyeTM (Sederma), PacifeelTM (Sederma), SebulessTM (Sederma), NG Insaponifiables de Beurre de KaritéTM (Sederma) ou des mélanges de ceux-ci.

10 Parmi les extraits de plante pouvant être combinés avec les cellules végétales selon l'invention, on peut mentionner en outre en particulier les extraits de lierre, par exemple de lierre grimpant (Hedera Helix), de Bupleurum chinensis, de Bupleurum Falcatum, d'arnica (Arnica Montana L), de romarin (Rosmarinus officinalis /V), de souci (Calendula officinalis), de sauge (Salvia officinalis L), de ginseng (Panax ginseng), de ginko biloba, de millepertuis (Hyperycum Perforatum), de fragon (Ruscus 15 aculeatus L), d'ulmaire (Filipendula ulmaria L), d'orthosiphon (Orthosiphon Stamincus Benth), d'algues (Fucus Vesiculosus), de bouleau (Betula alba), de thé vert, de noix de cola (Cola Nipida), de marronniers d'Inde, de bambou, Centella asiatica, de bruyère, fucus, saule, piloselle, les extraits d'escine, les extraits de cangzhu, les extraits de chrysanthellum indicum, de plantes du genre Armeniacea, Atractylodis Platicodon, Sinnomenum, Pharbitidis, Flemingia, de Coleus comme C.

20 Forskohlii, C. blumei, C. esquirolii, C. scutellaroides, C. xanthantus et C. Barbatus, comme un extrait de raciness de Coleus barbatus, des extraits de Ballote, Guioa, Davallia, Terminalia, Barringtonia, Trema, antirobia, cecropia, argania, dioscoreae comme Dioscorea opposita ou mexicain, des extraits de Ammi visnaga, de Siegesbeckia, en particulier Siegesbeckia orientalis, des extraits végétaux de la familles des Ericaceae, en particulier des extraits de myrtilles (Vaccinium angustifollium) de 25 Arctostaphylos uva ursi, alpe vexa, de plantes contenant des stérols (notamment des phytostérols), de Manjistha (extrait de plantes du genre Rubia, en particulier Rubia Cordifolia), de Guggal (extrait de plantes du genre Commiphora, en particulier Commiphora Mukul), un extrait de kola, camomille, treffle violet, de Piper methysticum (Kava Kava de Sederma), de Bacopa monieri (BacocalmineTM Sederma) et de fouet de mer, de Glycyrrhiza glatira, de mûrier, de melaleuca (arbre à thé), de Larrea 30 divaricata, de Rabdosia rubescens, de Euglena gracilis, de Fibraurea recisa Hirudinea, de Chaparral Sorghum, de fleur de tournesol, d'Enantia chlorantha, de Mitracarpe du genre Spermacocea, de Buchu barosma, de Lawsonia inermis L., d' Adiantium Capillus-Veneris L., de Chelidonium malus, de Luffa cylindrical, de « Japanese Mandarin » (Citrus reticulata Blanco var. unshiu), de Camelia sinensis, de Imperata cylindrical, de Glaucium Flavum, de Cupressus Sempervirens, de Polygonatum multiflorum, 35 de loveyly hemsleya, de Sambucus Nigra, de Phaseolus lunatus, de Centaurium, de Macrocystis Pyrifera, de Turnera Diffusa, de Anemarrhena asphodeloides, de Portulaca pilosa, d'Humulus 3031454 10 lupulus, de café Arabica, d'Ilex Paraguariensis, de Globularia Cordifolia, d'Oxydendron arboreum, d'Albizzia julibrissin et de Zingiber zerumbet smith. Les compositions selon la présente invention peuvent comprendre un ou plusieurs peptides, incluant, sans se limiter, les, di-, tri-, tetra-, penta- et hexapeptides et leurs dérivés. Selon un mode de réalisation 5 particulier, la concentration du peptide additionnel, dans la composition, varie entre 1x10-7% et 20%, de préférence entre lx10-6% et 10%, préférentiellement entre lx10-5% et 5%, en poids. Le terme «peptide» désigne ici les peptides contenant 10 acides aminés ou moins, leurs dérivés, isomères et complexes avec d'autres espèces telles qu'un ion métal (e.g. cuivre, zinc, manganèse, magnésium, et autres). Le terme "peptides" se réfère à la fois à des peptides naturels et à des peptides de synthèse. Il 10 se réfère également à des compositions qui contiennent des peptides et qui se rencontrent dans la nature, et/ou qui sont commercialement disponibles. Des exemples non limitatifs de dipeptides utilisables dans le cadre de la présente invention, comprennent la Carnosine (beta-AH), YR, VW, NF, DF, KT, KC, CK, KP, KK ou TT. Des exemples non limitatifs de tripeptides comprennent RKR, HGG, GKH, GGH, GHG, KFK, KPK, KMOK, 15 KMO2K ou KAvaK. Des exemples non limitatifs de tétrapeptides sont RSRK (SEQ ID NO: 1), GQPR (SEQ ID NO: 2) ou KTFK (SEQ ID NO: 3). Un exemple non limitatif de pentapeptide est le KTTKS (SEQ ID NO: 4) et d'hexapeptides les GKTTKS (SEQ ID NO: 5) et VGVAPG (SEQ ID NO: 6). D'autres peptides utilisables dans le cadre de la présente invention peuvent être choisis parmi, sans que cette liste soit limitative : les dérivés lipophiles de peptides, de préférence les dérivés palmitoyl, et 20 les complexes avec les ions métal mentionnés plus haut (e.g. complexe cuivre du tripeptide HGG). Les dipeptides préférés comprennent par exemple le N-Palmitoyl-beta-Ala-His, N-Acetyl-Tyr-Arghexadecylester (CalmosensineTM, IdealiftTM, Sederma), le Pal-KT, le Pal-RT (Sederma). Les tripeptides préférés comprennent notamment le N-Pal-Gly-Lys-His, (Pal-GKH, Sederma), le dérivé cuivre de HGG (LaminTM, Sigma), la lipospondin (N-Elaidoyl-KFK) et ses analogues de substitution 25 conservative, N-Acetyl-RKR-NH2 (Peptide CK+), le N-Biot-GHK (Sederma), le Pal-KMO2K (Sederma) et leurs dérivés. Des dérivés tétrapeptides utilisables dans le cadre de la présente invention comprennent, sans y être limités, le N-Pal-GQPR (Sederma) (SEQ ID NO: 7), le Ela-KTFK (SEQ ID NO: 8). Des dérivés pentapeptides utilisables sont, sans y être limités, le N-Pal-KTTKS (SEQ ID NO: 9) (MATRIXYLTM, Sederma), le N-Pal-Tyr-Gly-Gly-Phe-X (SEQ ID NO: 10) avec X étant Met ou 30 Leu ou leur mélange. Des dérivés hexapeptides utilisables, comprennent sans y être limités : N-Pal- VGVAPG (SEQ ID NO: 11), Pal-GKTTKS (SEQ ID NO: 12) et dérivés. On peut citer aussi le mélange Pal-GHK et Pal-GQPR (SEQ ID NO: 7) (MatrixylTm 3000, Sederma). Les compositions préférées disponibles dans le commerce contenant un tripeptide ou dérivé comprennent le Biopeptide-CLTM, MaxilipTM ou BiobustylTM de Sederma. Les compositions préférées, 35 disponibles dans le commerce, sources de tétrapeptides comprennent : RIGINTM, EyelissTM 3031454 11 MatrixylTM Reloaded et Matrixyl 3000TM, qui contiennent entre 50 et 500 ppm de palmitoyl-GQPR (SEQ ID NO: 7) et un excipient, proposé par Sederma. Les peptides commerciaux suivants peuvent également être mentionnés comme ingrédients actifs additionnels : 5 - le VialoxTM (nom INCI = Pentapeptide-3 (peptide synthétique comprenant alanine, arginine, isoleucine, glycine et proline)), le Syn-akeTM ((3-Ala-Pro-Dab-NH-Bz1) ou le Syn-CollTM (Pal-LysVal-Lys-OH) vendus par la société Pentapharm, - l'ArgirelineTM (Ac-Glu-Glu-Met-Gln-Arg-Arg-NH2 (Nom INCI = Acetyl hexapeptide-3) (SEQ ID NO: 13), le LeuphasylTM (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu) (SEQ ID NO: 14), l'AldenineTM (Gly-His- 10 Lys), le TrylagenTM (Nom INCI = Pseudoalteromonas Ferment Extract, Hydro lyzed Wheat Protein, Hydro lyzed Soy Protein, Tripeptide-10 Citrulline (produit de la réaction de Citrulline et du Tripeptide-10 (peptide synthétique constitué d'acide aspartique, d'isoleucine et de lysine)), Tripeptide-1), l'EyeserylTM (Ac-(3-Ala-His-Ser-His)(SEQ ID NO: 15), le SerilesineTM (Ser-IleLys-Val-Ala-Val) (SEQ ID N°16) ou le DecorinylTM (Nom INCI : Tripeptide-10 Citrulline = 15 produit de la réaction de Citrulline et du Tripeptide-10 (peptide synthétique constitué d'acide aspartique, d'isoleucine et de lysine) vendus par la société Lipotec, - le CollaxylTM (Gly-Pro-Gln-Gly-Pro-Gln (SEQ ID N°17)) ou la QuintescineTM (Cys-Gly) vendus par la société Vincience, - le CytokinolTMLS (hydrolysat de caséine) vendu par les Laboratoires Serobiologiques/Cognis, 20 - le KollarenTM (Gly-His-Lys), l'IP2000TM (Pal-Val-Tyr-Val) ou le MelipreneTM (Nom INCI = Monofluoroheptapeptide-1 : produit de la réaction d'acide acétique et d'un peptide synthétique contenant arginine, glycine, acide glutamique, histidine, norleucine, p-fluorophenylalanine et tryptophan) vendus par l'Institut Européen de Biologie Cellulaire, - le NeutrazenTM (Pal-His-D-Phe-Arg-NH2) vendu par la société Innovations, ou 25 - le BONT-L-PeptideTM (Nom INCI = Palmitoyl Hexapeptide-19 : produit de la reaction d'acide palmitique et d'Hexapeptide-19 (peptide synthétique constitué d'asparagine, d'acide aspartique, de lysine et de méthionine), le Timp-PeptideTM (Nom INCI = Acetyl Hexapeptide-20 : produit obtenu par acétylation d'Hexapeptide-20 (peptide synthétique constitué d'alanine, glycine, lysine, valine et proline) ou l'ECM ModulineTM (Nom INCI = Palmitoyl Tripeptide-28 : produit de la réaction 30 de l'acide palmitique et de Tripeptide-28 (peptide synthétique constitué d'arginine, lysine et de phénylalanine) vendus par la société lnfinitec Activos. Plus spécifiquement, selon l'invention les cellules végétales peuvent être combinées avec au moins l'un des composés choisis parmi les composés de la vitamine B3, les composés comme la niacinamide ou le tocophérol, les composés rétinoïdes comme le rétinol, l'hexamidine, l'acide a-lipoïque, le resvératrol ou 3031454 12 la DHEA, les peptides, notamment le N-acétyl-Tyr-Arg-O-hexadécyl, le Pal-VGVAPG (SEQ ID NO: 11), le Pal-KTTKS (SEQ ID NO: 9), le Pal-GHK, le Pal-KMO2K et le Pal-GQPR (SEQ ID NO: 7), qui sont des ingrédients actifs classiques utilisés dans les compositions topiques cosmétiques ou dermopharmaceutiques.

5 La présente invention propose également encore une méthode de traitement topique cosmétique ou dermatologique pour l'amélioration de l'apparence et de l'état général de la peau et de ses phanères, comprenant l'application topique sur la peau d'un sujet qui en a besoin d'une quantité efficace de cellules végétales ou d'une composition les comprenant, dans un excipient physiologiquement acceptable.

10 Par « traitement topique » ou « utilisation topique » on entend une application qui est destinée à agir à l'endroit où elle est appliquée : peau, muqueuse, phanères. La composition comprenant les cellules végétales selon l'invention peuvent être appliqués localement sur les zones ciblées. La quantité « efficace » dépend de divers facteurs, comme l'âge, l'état du patient, la gravité du 15 désordre ou de la pathologie et du mode d'administration. Une quantité efficace signifie une quantité non toxique suffisante pour obtenir l'effet désiré. Selon d'autres caractéristiques de l'invention : - le milieu physiologiquement acceptable est une matrice hydrophile dans laquelle lesdites cellules végétales sont mises en suspension et/ou solubilisées ; et/ou 20 - l'ingrédient actif comprend un épaississant ; et/ou - l'ingrédient actif comprend au moins 0,04% d'acides léontopodiques A et B par rapport au poids total de l'ingrédient. Cet ingrédient est ensuite utilisable dans des formulations cosmétiques entre 0,1 et 10%, de préférence entre 1 et 5%, de préférence encore entre 2 et 3% et généralement 2% en poids de ladite formulation ; ce qui correspond à des teneurs en acides léontopodiques A et B dans les formulations 25 cosmétiques comprises entre 0,00004% et 0,004%, de préférence comprises entre 0,0004% et 0,002%, de préférence encore comprises entre 0,0008% et 0,0012% et généralement d'au moins 0,0008% par rapport au poids total de composition. Tous les pourcentages et ratios utilisés dans la présente demande sont par poids de la composition totale et toutes les mesures sont faites à 25°C à moins que cela ne soit précisé autrement.

30 À titre d'exemple, pour un traitement cosmétique du visage, la Directive Européenne sur les Cosmétiques a fixé une quantité standard d'application d'une crème de 2,72 mg/cm2/jour/personne et pour une lotion pour le corps de 0,5 mg/cm2/jour/personne. Selon d'autres particularités, le procédé de traitement cosmétique selon l'invention peut être associé avec un ou plusieurs autres procédés de traitement visant la peau, comme par exemple les traitements 35 par luminothérapie, par la chaleur ou par aromathérapie.

3031454 13 Selon l'invention, il est possible de proposer des dispositifs à plusieurs compartiments ou kits destinés à la mise en oeuvre du procédé décrit ci-dessus, et qui pourrait comprendre, à titre d'exemple, et sans que ce soit limitatif, dans un premier compartiment une composition contenant des cellules actives selon l'invention et dans un second compartiment un excipient et/ou actif additionnel, les 5 compositions contenues dans lesdits premier et second compartiments étant ici considérées comme composition de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps notamment dans l'un des traitements définis ci-dessus. Le procédé de traitement selon l'invention est plus particulièrement adapté à un traitement cosmétique réparateur tenseur et de lissage sur une peau âgée notamment au niveau de la surface tombante du cou 10 et du pli de la vallée des larmes. La présente invention sera mieux comprise et d'autres avantages apparaîtront à la lumière de la description détaillée qui va suivre d'un exemple de préparation de cellules végétales, et de tests in vitro et in vivo réalisés sur ces cellules. A) Exemple de préparation de cellules végétales 15 Création d'une lignée cellulaire Des morceaux choisis de feuilles du genre Leontopodium alpinum sont prélevés, lavés et coupés en petits morceaux de quelques mm, de façon à réaliser de 200 à 1500 explants. Après une série de traitements de décontamination puis de stérilisation, les morceaux sont placés sur un milieu de culture gélosé en présence d'un milieu nutritif contenant des hormones de croissance végétales afin d'induire 20 la callogenèse (formation d'un cal). Après une période de temps appropriée, un amas de cellules dédifférenciées ou cal se forme, lequel est transféré sur une plus grande surface et dans un milieu frais de culture afin de pouvoir se multiplier. Un certain nombre de sous-cultures (transferts sur un milieu frais de culture) est réalisé pour stabiliser la lignée cellulaire, c'est-à-dire jusqu'à que celle-ci présente une vitesse de prolifération élevée et 25 constante, une conservation du phénotype, une teneur constante en composés bioactifs d'intérêt (métabolites primaires et secondaires). La lignée cellulaire est ensuite soumise à une étape de sélection qui consiste à cultiver les cellules pendant une durée appropriée, à prélever les agrégats de cellules formés et à les inoculer dans un milieu de culture liquide pour une durée permettant d'obtenir la multiplication de l'agrégat cellulaire.

30 La meilleure lignée cellulaire sera celle permettant d'obtenir le plus rapidement possible et de manière reproductible une biomasse importante ayant une teneur optimale en métabolites choisis, la meilleure activité biologique et un phénotype homogène. Celle-ci a été choisie également pour sa capacité à produire des acides léontopodiques A et B en une quantité d'environ 5% en poids mesurée par rapport au poids sec des cellules, mesurée par HPLC.

35 Procédé industriel d'obtention d'une biomasse de cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinum et traitement de cette biomasse On partira d'une lignée cellulaire préparée comme décrit ci-dessus ou d'une lignée existante.

3031454 14 La lignée de Leontopodium alpinum est dans un premier temps multipliée pour obtenir une quantité suffisante de biomasse de cellules dédifférenciées afin d'effectuer l'étape de production à grande échelle. Les étapes suivantes sont mises en oeuvre : a) Inoculation de la lignée sélectionnée dans un milieu liquide et culture un temps suffisant pour 5 obtenir une augmentation de la biomasse d'au moins 300%; b) De façon optionnelle, transfert de la suspension obtenue en a) dans un milieu liquide frais et à nouveau culture un temps suffisant pour obtenir une augmentation de la biomasse d'au moins 300%; c) De façon optionnelle, répétition de l'étape b) ; 10 d) Transfert des suspensions cellulaires obtenues aux stades a) à c) dans un bioréacteur avec du milieu liquide frais, et conduite de la culture dans des conditions telles et pendant un temps suffisant pour obtenir une biomasse cellulaire contenant les métabolites d'intérêt c'est-à-dire les phénylpropanoides glycosides et acides léontopodiques en quantités suffisantes, cette étape de production en bioréacteur comprenant une étape d'élicitation réalisée en modifiant les taux de 15 nutriments du milieu de culture. Le bioréacteur : Volume : de 5 à 50 fois plus grand que le volume de biomasse utilisée comme inoculum ; surface interne du bioréacteur lisse et uniforme (pas d'arêtes ou d'angles pouvant provoquer la rupture des parois des cellules).

20 Conditions de culture : Milieu de culture : milieu comprenant des sels minéraux (solution de macroéléments et de microéléments), des vitamines, des hormones végétales ainsi que du sucrose. De l'agar végétal est ajouté dans les milieux solides. Température : entre 15°C et 35°C, de préférence entre 20°C et 30°C et de façon encore plus préférée à 25 25°C. Durée : entre 7 et 21 jours, de préférence entre 10 et 14 jours. Agitation de la biomasse : il est important que la biomasse soit aérée de façon optimale, et que dans le même temps, elle soit gardée agitée soit par un moyen interne, soit par un moyen externe. Il est nécessaire que l'agitation, bien que faible, soit efficace, surtout dans les étapes finales, quand la 30 biomasse est en quantité importante. Pour les besoins de la présente invention, des moyens appropriés d'agitation par voie interne sont des hélices tournant entre 20 et 120 tours/min, de préférence à 60 tours/min, ou par voie externe des moyens d'agitation orbitale tournant de préférence entre 40 et 200 tours/min et de préférence à environ 120 tours/min. Oxygénation : normalement réalisée en utilisant de l'air stérile, à un débit de 0,5 à 4 litres par minute, de 35 façon préférentielle entre 2 et 2,5 litre par minute, pour un volume de 10 litres de biomasse. De façon alternative, des mélanges de gaz contenant de 10% à 100% v/v d'oxygène peuvent être utilisés. Il sera 3031454 15 préférable d'utiliser des moyens de diffusion de l'air ou de l'oxygène avec une buse ayant un débit compris entre 10 ml/mn et 600 ml/mn et de façon préférentielle entre 50 ml/mn et 350 ml/mn. Traitement de la biomasse obtenue Filtration pour éliminer le milieu de culture et récupérer la biomasse de cellules. Cette biomasse peut être 5 caractérisée par son taux équivalent de cellules lyophilisées. Homogénéisation sous haute pression de la biomasse cellulaire : permet une réduction de la taille des agrégats cellulaires ; certaines cellules peuvent être éclatées et on peut être alors en présence d'un mélange de cellules entières et de cellules broyées, de préférence en gardant 10% de cellules entières. Caractérisation des composés actifs contenus dans les cellules par détermination analytique de 10 métabolites primaires et secondaires produits par la culture incluant la teneur en protéines, phenylpropanoïdes glycosides dont acides léontopodiques A et B. Optionnellement : 1) séchage des cellules notamment par lyophilisation ou atomisation pour permettre une plus grande stabilité des composés d'intérêt, améliorer le stockage à long terme sans avoir à ajouter des 15 conservateurs. 2) extraction du contenu des cellules par broyage/lyse/éclatement des cellules et séparation des phases liquide et solide (par centrifugation ou filtration ou autre), afin d'obtenir un extrait cellulaire particulier. 3) Purification de l'extrait cellulaire pour augmenter la teneur en acides léontopodiques.

20 B) Préparation d'un ingrédient actif pour une utilisation selon l'invention La biomasse de cellules, soit telle qu'obtenue ci-dessus après filtration, soit sous forme séchée, ou encore l'extrait en résultant, peuvent être mélangés à un milieu physiologiquement acceptable formant l'excipient. À titre d'exemple préférentiel, ce milieu physiologiquement acceptable est une matrice hydrophile dans 25 laquelle les cellules sont mises en suspension, par exemple dans le cas d'une composition cosmétique du glycérol et/ou du butylène glycol. Des additifs peuvent être aussi ajoutés le cas échéant, comme des agents antimicrobiens, des anti-oxydants, des agents stabilisants, des agents agissant sur le pH, des agents émulsifiants ou des agents épaississants, notamment un épaississant comme la gomme xanthane qui va favoriser le maintien en suspension des cellules.

30 Un ingrédient actif à usage cosmétique peut ainsi être formé pour la mise en oeuvre de l'invention, comprenant par exemple 20% en poids de biomasse fraiche de cellules dédifférenciées entières (correspondant à environ 1% de cellules sèches), dans un mélange excipient physiologiquement acceptable constitué de glycérol (environ 80%) et de gomme xanthane (0,3% en poids), ledit ingrédient ayant un taux au final d'environ 0,05% d'acides léontopodiques A et B (environ 15% d'acide A et 85% 35 de B). Cet ingrédient est ensuite utilisable pour préparer des formulations cosmétiques comme exposé ci-dessous au point Galénique F).

3031454 16 Il va de soi que selon l'invention on pourrait utiliser des cellules végétales comprenant un taux différent d'acides léontopodiques, notamment plus élevé, soit obtenues directement grâce au procédé in vitro (par exemple grâce à une élicitation appropriée permettant d'augmenter le taux), soit obtenues par une phase de purification/concentration des cellules obtenues (par exemple par une étape de concentration après 5 extraction du contenu cellulaire). A titre d'exemple, il est possible de fabriquer des cellules végétales sous forme d'un extrait purifié comprenant un taux d'acides léontopodiques élevé, par exemple un taux de 25% par rapport à la matière sèche, lesdites cellules étant elles-mêmes utilisées pour fabriquer un ingrédient actif comme expliqué ci-dessus.

10 C) Résultats de tests in vitro Les tests in vitro ont été réalisés à partir d'un extrait Ethanol/Eau (70/30) de cellules lyophilisées de la culture cellulaire de Leontopodium Alpinium (21% de cellules lyophilisées obtenues selon l'exemple ci-dessus dans le mélange de solvants). Cette solution est la solution mère. Si on prend 0,2% de cette solution dans un milieu test, la solution résultante sera à 420ppm d'équivalent-cellules. On parlera par 15 la suite d'un extrait cellulaire à X équivalent cellules. 1) Restauration de l'homéostasie des cellules du derme Les essais ci-dessous ont été réalisés en utilisant si besoin des modèles expérimentaux de vieillissement accéléré (par irradiations UVA ou UVB) afin de démontrer l'intérêt du produit selon l'invention pour la restauration de l'homéostasie des cellules du derme. 20 a) Synthèse des thrombospondines (TSP) Principe : Des kératinocytes humains normaux (KHN) en culture ont été mis en présence de l'extrait cellulaire selon l'invention à 140 et 280 ppm d'équivalent-cellules, pendant 48h. Les synthèses de TSP-1 et -2 ont été évaluées par une méthode ELISA dans le milieu de culture des cellules. Tableau 1 : Production de TSP-2 par des KHN +/-l'extrait cellulaire selon l'invention (n=3). TSP-2 (ng/106 cell.) Variation (%) Contrôle 5,87 ± 0,28 Référence 140ppm 7,57 ± 1,37 +29%; dns 280ppm 9,2 ± 0,32 +57% ; p<O, 01 25 Ces résultats montrent que l'extrait cellulaire selon l'invention a 280ppm d'équivalent cellules induit significativement la production de TSP-2 chez le KHN (+57%, p<0.01). Cette augmentation de TSP permet de limiter l'activité des MMP avec pour conséquence d'améliorer la qualité du derme. b) Réduction de la synthèse des MMP stress-induites 30 Principe : Des fibroblastes humains dermiques (FHD) en culture ont été mis en présence de l'extrait cellulaire selon l'invention (à 70; 140 ou 280ppm d'équivalent-cellules) pendant 24h puis, après rinçage, les tapis ont été exposés à une irradiation UVA afin d'augmenter le pool de production des 3031454 17 MMP par ces cellules et ainsi de modéliser un vieillissement accéléré des cellules. Les cellules ont ensuite été remises dans le milieu de culture au contact de l'extrait selon l'invention pendant 24h. La production de MMP dans le milieu de culture a été suivie à l'aide de méthodes Multiplex / ELISA. Tableau 2 : Variation de la production de MMP suite à une irradiation UVA sur des fibroblastes au 5 contact de l'extrait cellulaire selon l'invention (n=4). MMP-1 Variation MMP-7 Variation MMP-9 Variation (pg/mL/106cel) (%) (pg/mL/106cel) (%) (pg/mL/10 6 (%) cel) Contrôle 1622 ± 47 Référence 657 ± 196 Référence 22,5 ± 3,1 Référence 7Oppm ± -42%; 388 ± 136 -41%; 18,8 ± 2,2 -17% ; 942 82 p<0,01 p<0,07 dns 140ppm 794 ± 55 -51% ; 266 ± 134 p-5<90%,02; 16,8 ± 1,9 -25%; p<0,01 p=0,02 280ppm 762 ± 40 -53%; 289± 159 -56%; 17,8 ± 1 8 -21%; p<0,01 p<0,03 ' p<0,04 Le stress UVA, modélisant le vieillissement, appliqué sur les fibroblastes a bien augmenté la production des MMP-1 (+292%, p<0,01), des MMP-7 (+48%, p=0,08) et des MMP-9 (+51% ; p<0,01). Le contact des cellules avec l'extrait selon l'invention à 280ppm d'équivalent-cellules a permis de réduire fortement l'induction de MMP-1 (-53%, p<0,01), MMP-7 (-59%, p<0.02) et MMP- 10 9 (-25%, p=0,02). Ainsi, l'extrait selon l'invention permet de limiter la formation des protéases fragmentant la matrice extracellulaire du derme. c) Augmentation de la synthèse des TIMP stress induites Principe : En parallèle de l'essai précédent, la production de TIMP a été suivie à l'aide de méthodes Multiplex / ELISA dans le milieu de culture.

15 Tableau 3 : Variation de la production des TIMP suite à une irradiation UVA sur des fibroblastes au contact de l'extrait cellulaire selon l'invention (n=4). TIMP-1 Variation (%) TIMP-2 Variation (%) (ng/mL/106cell.) (ng/mL/106 cell.) Contrôle 34,5 ± 9,0 Référence 10,3 ± 2,4 Référence 140ppm 87,6 ± 17,6 +154% ; p<0,01 22,1 ± 2,9 +115% ; p<0,01 280ppm 93,0 ± 2,5 +170% ; p<0,01 24,8 ± 0,9 +141% ; p<0,01 TIMP-3 Variation ( TIMP-4 Variation (ng/mL/106 cell.) (%) (pg/mL/106 cell.) (%) Contrôle 16,2 ± 3.2 Référence 294 ± 45 Référence 140ppm 26,1 ± 5.3 +61% ; p<0,02 388 ± 35 +32%;p<0,02 280ppm 28,4 ± 3.7 +75% ;p<0,01 402 ± 11 +37% ;p<0,01 Le contact des cellules avec l'extrait cellulaire selon 1 invention à 280ppm d'équivalent cellules a permis de ré-activer l'induction de TIMP-1 (+170%, p<0,01), TIMP-2 (+141%, p<0,01), TIMP-3 3031454 18 (+75%, p<0, 01), et TIMP-4 (+37%, p<0, 01). Ainsi, le produit selon l'invention permet d'induire fortement les inhibiteurs spécifiques des MMP. d) Effet selon l'invention de l'extrait sur la production basale de macromolécules dermiques 5 - Collagène I Des fibroblastes humains dermiques (FHD), sont ensemencés. Une fois la confluence atteinte les cellules sont mise en contact avec la VitC +/- l'extrait selon l'invention à 140ppm d'équivalent cellules et remises en culture pendant 72h. Les surnageants sont prélevés et les tapis cellulaires extraits pour quantifier le nombre de cellules. Le dosage du collagène I est réalisé sur les surnageants par 10 méthode ELISA. Aucune toxicité n'a été notée par rapport au contrôle. Tableau 4 : Synthèse de Collagène I sur des FHD (n=5) [Co111] ng/ 10E6 cellules Variation (%) Contrôle 11994,4 ± 347,8 Référence 140ppm 16385,8 ± 487,1 36,6 ; p<0,01 - Collagène IV Des fibroblastes humains dermiques (FHD), sont ensemencés. Une fois la confluence atteinte les cellules sont mises en contact avec la VitC +/- l'extrait selon l'invention à 140ppm d'équivalent 15 cellules et remises en culture pendant 72h. Les surnageants sont prélevés et les tapis cellulaires extraits pour quantifier le nombre de cellules. Le dosage du collagène IV est réalisé sur les surnageants par méthode ELISA. Aucune toxicité n'a été notée par rapport au contrôle. Tableau 5 : Synthèse de Collagène IV sur des FHD (n=5) [Co114] ng/ 10E6 cellules Variation (%) Contrôle 7,8 ± 0,5 Référence 140ppm 12,6 ± 1,7 61,5 ; p<0,01 - Acide hyaluronique 20 Des fibroblastes humains dermiques (FHD), sont ensemencés. Une fois la confluence atteinte les cellules sont mises en contact avec l'extrait cellulaire selon l'invention à 210ppm et 420ppm d'équivalent-cellules puis remises en culture pendant 72h. Les surnageants sont prélevés et les tapis cellulaires extraits pour quantifier le nombre de cellules. Le dosage de l'acide hyaluronique est réalisé sur les surnageants par méthode ELISA. Aucune toxicité n'a été notée par rapport au contrôle.

25 Tableau 6 : Synthèse d'acide hyaluronique (AH) par des FHD (n=5) [AH] ng/10E6 cell. Variation (%) Contrôle 2546 ± 373 Référence 210ppm 3068 ± 190 20,5 ; p<0,05 420ppm 4067 ± 1123 59,7 ; p<0,05 3031454 19 Pour les 3 macromolécules testées, il existe une stimulation de leur production par des fibroblastes en présence de l'extrait cellulaire selon l'invention. 2) Amélioration du dynamisme cellulaire et énergétique a) Contraction de dermes modélisés 5 Principe : Des FHD en culture ont été vieillis de façon accélérée à l'aide d'H202. Les cellules ont ensuite été remises dans leur milieu de culture pour 24h. Puis, ces cellules ont été incluses dans un modèle de derme et, après polymérisation, ont reçu l'extrait cellulaire selon l'invention (140 ou 280ppm d'équivalent cellules). La contraction du modèle de derme a été suivie pendant 4jours, des photos ont permis de quantifier les différences par analyse d'image.

10 Tableau 7 : Modulation de la contraction d'un modèle de derme par des FHD +/- un extrait cellulaire selon l'invention (n=6). Contraction Variation (%) Variation (%) (unités arbitraire) Sans H202 5143 ± 1157 Référence H202 3459 ± 488 -33% ; p<0,01 Référence H202+140ppm d'équivalent cellules 4114 ± 346 - +19% ; p<0,05 H202+280ppm d'équivalent cellules 5319 ± 925 - +54% ; p<0,01 Ces résultats confirment que le contact des cellules avec H202 permet de réduire les capacités contractiles de ces cellules (-33% ; p<0, 01). L'extrait selon l'invention à 280ppm d'équivalent cellules 15 permet de réduire, de façon dose-dépendante, l'effet du vieillissement accéléré sur la capacité contractile des cellules (+54% de contraction par rapport au contrôle ; p<0, 01). b) Dynamisme mitochondrial Principe : Les cellules âgées sont plus rétractées que les cellules jeunes. La préservation de la forme de la cellule ainsi que de l'aspect de son réseau mitochondrial sont donc de bons indicateurs de leur 20 dynamisme. Des fibroblastes humains dermiques (FHD) en culture ont été stressés à l'aide d'une exposition UVB afin d'obtenir un phénotype rétracté et un réseau mitochondrial fragmenté. Juste après l'irradiation, les cellules ont ensuite été remises dans leur milieu de culture avec l'extrait cellulaire selon l'invention (280ppm d'équivalent cellules) et fixées après 18h. Les cellules ont alors été marquées à l'aide du colorant spécifique Mitotraker et le réseau a été quantifié à partir de photos en 25 extrayant au préalable les connections du réseau à l'aide d'un outil informatique spécifique. Les photos montrent que l'exposition, même mineure des FHD aux UVB, provoque leur rétractation et une fragmentation de leur réseau mitochondrial (moins de mitochondries en filaments, plus de structures punctiformes). Le contact avec l'extrait cellulaire selon l'invention, mis juste après l'irradiation, permet de normaliser l'aspect des cellules en maintenant leur phénotype non rétracté et 30 de redonner au réseau mitochondrial un aspect moins fragmenté.

3031454 20 Tableau 8 : Modulation des connections mitochondriales par des FHD +/- un extrait cellulaire selon l'invention (n=28). Connections Variation (%) Variation (%) mitochondriales (unités arbitraire) Non irradié 133 ± 45 Référence UVB 104 ± 41 -22% ; p<O, 02 Référence UVB + 280ppm d'équivalent cellules 136 ± 70 +31%; p<0,05 Ces résultats montrent donc que le réseau mitochondrial est fortement perturbé plusieurs heures après une irradiation UVB, même faible (22% de connections en moins; p<0.02). Le contact avec l'extrait 5 cellulaire selon l'invention mis après l'irradiation permet de maintenir le réseau et les connections au niveau du contrôle non irradié (+31%, p<0.05 vs UVB seul). L'extrait cellulaire selon l'invention permet donc de restaurer le dynamisme cellulaire et mitochondrial. D) Galénique Différentes formulations cosmétiques sont décrites ci-après. Des ingrédients actifs additionnels, venant le 10 cas échéant en soutien et/ou en complément de l'activité de l'ingrédient actif selon l'invention à base de cellules indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinum, peuvent être ajoutés dans la phase appropriée selon leur nature hydrophobe ou hydrophile. Ces ingrédients peuvent être de toute catégorie selon leur(s) fonction(s), le lieu d'application (corps, visage, cou, buste, mains, etc.), l'effet final recherché et le consommateur ciblé, par exemple spécifiques anti-rides, hydratant, anti-cernes, 15 raffermissant, anti-glycation, volumateur, apaisant, myo-relaxant, anti-rougeurs, detoxifiant, etc. Ingrédient actif utilisé dans les formulations galéniques données ci-après : 20% en poids, par rapport au poids total de la composition de l'ingrédient, de cellules indifférenciées ou dédifférenciées fraiches (biomasse) selon l'invention (correspondant à environ 1% de cellules sèches), l'ingrédient ayant une teneur finale en acides léontopodiques A et B d'environ 0,05% dans un mélange excipient 20 physiologiquement acceptable constitué de glycérol, d'épaississant gomme xanthane et d'acide citrique pour régler le pH le cas échéant. Cet ingrédient est préconisé entre 0,1 et 10%, de préférence entre 1 et 5%, de préférence encore entre 2 et 3% et généralement 2%. 1) Forme « Crème », bien adaptée notamment pour le cou PRODUIT % NOM INCI Phase A Qsp100 Water Carbomer 0,30 H20 Optasense G83TM 25 3031454 21 Phase B Brij S2-SS-(RB)TM 0,40 Steareth-2 Brij S10-S0-(RB)TM 1,20 Steareth-10 Crodafos CES-PA-(RB)TM 4,00 Cetearyl Alcohol & Dicetyl Phosphate & Ceteth- 10 Phosphate Crodacol CS 90-PA-(RB)TM 1,50 Cetearyl Alcohol Laurocapram 2,50 Laurocapram BRB CM 56TM 2,00 Cyclopentasiloxane & Cyclohexasiloxane Crodamol OSU-LQ-(RB)TM 7,00 Diethylhexyl Succinate Phase C Glycérine 4,00 Glycerin Octanediol 0,50 Caprylyl Glycol Phase D Phénoxyéthanol qs Phenoxyethanol Phase E Sorbate de potassium qs Potassium Sorbate Phase F H20 4,00 Water NaOH 30 % 0,40 Sodium Hydroxide Phase G Ingrédient actif selon l'invention 1,00 à 5,00 / Phase H Parfum 0,10 Fragrance Protocole : peser la phase A et laisser gonfler sans agitation pendant 30 min. Mettre la phase A à chauffer à 75°C au bain-marie. Peser la phase B et mettre à chauffer à 75°C au bain-marie. Bien mélanger. Peser et Fondre la phase C à 45°C. Rajouter la phase D dans la phase C, préalablement refroidie. Verser la phase C+D dans la phase A, sous agitation staro v= 500 tlmn. Bien homogénéiser.

5 Verser la phase B dans la phase précédente, sous agitation staro v= 1000 t/mn. Bien homogénéiser. Extemporanément, rajouter la phase E, bien homogénéiser. Rajouter la phase F, bien homogénéiser. Rajouter la phase G, en dessous de 45°C, bien homogénéiser, 1 heure. Rajouter la phase H, bien homogénéiser. Exemples d'ingrédients pouvant être ajoutés à cette formulation : 10 - MATRIXYL synthe'6TM : ingrédient actif anti-rides à base de peptides, commercialisé par Sederma (W02010/082175), qui aide à réparer les dommages cutanés causés par le vieillissement. - MATRIXYL 3O00TM : ingrédient actif anti-rides à base de peptides commercialisé par Sederma (W02005/048968), qui aide à réparer les dommages cutanés causés par le vieillissement. - PRODIZIATM : ingrédient actif commercialisé par Sederma, qui combat les signes cutanés de la 15 fatigue causés par le glycation et la glycoxydation. 2) Forme « Sérum » PRODUIT % NOM INCI Phase A Qsp100 Water qs Potassium Sorbate H20 Sorbate de potassium 3031454 22 Phase B Butylène glycol 3,00 Butylene Glycol Phénoxyéthanol qs Phenoxyethanol Keltrol CG-SFTTM 0,30 Xanthan Gum Satiagel VPC 614TM 0,20 Chondrus Crispus (Carrageenan) Extract Parfum 0,10 Fragrance Phase C H20 0,20 Water Acide lactique 0,02 Lactic Acid Phase D Ingrédient actif selon l'invention 1,00 à 5,00 / Protocole : Peser la phase A et mettre sous agitation hélice v=300 tr/min. Peser et homogénéiser la phase B. Ajouter la phase B dans la phase A sous agitation rapide hélice v=600 tr/min. Laisser homogénéiser pendant 1 heure. Ajuster le pH à 6,00±0,10 avec la phase C. Ajouter la phase D dans la phase précédente et bien homogénéiser.

5 Exemples d'ingrédients pouvant être ajoutés à cette formulation : - KOMBUCHKATm : ingrédient actif commercialisé par Sederma (W02004/012650), ayant un effet sur l'éclat du teint, anti-glycation, redensifiant de la population adipocytaire, et améliorant la qualité de la peau (lissage, éclat). - REVIDRATTm : actif commercialisé par Sederma, qui notamment améliore la cohésion de 10 l'épiderme et son hydratation. - IDEALIFTTm : ingrédient actif commercialisé par Sederma (W02010/136965) qui combat la flaccidité du visage et améliore la résistance à la gravité. 3) Forme « Lotion », bien adaptée notamment pour le cou PRODUIT % NOM INCI Phase A H20 Qsp100 Water Sorbate de Potassium 0,10 Potassium Sorbate Phase B Glycérine 2,00 Glycerin Phénoxyéthanol qs Phenoxyethanol Keltrol CG-SFTTM 0,60 Xanthan Gum Vivapur CS 032TM 0,25 Microcrystalline Cellulose (and) Xanthan Gum Phase C Span 40-PW-(MV)TM 1,00 Sorbitan Palmitate Span 60-PW-(MV)TM 1,50 Sorbitan Stearate Crodamol GTCC-LQ-(MV)TM 4,00 Caprylic/Capric Triglyceride Prisorine 3505TM 4,00 Isostearic Acid Phase D H20 0,30 Water Acide lactique 0,03 Lactic Acid Phase E Ingrédient actif selon l'invention 1,00 à 5,00 / Phase F Parfum 0,10 Fragrance 3031454 23 Protocole : Peser la phase A. Peser et mélanger la phase B. Ajouter la phase B dans la phase A, sous agitation hélice v=800 tr/min. Bien homogénéiser. Mettre la phase A+B à chauffer à 75°C au bain-marie. Peser et mettre la phase C à chauffer à 75°C au bain-marie. Verser la phase C dans la phase A+B, sous agitation staro très forte v=1000 tr/min ; bien homogénéiser. Ajuster le pH à 5,60±0,10 avec la phase D 5 en dessous de 35°C. Ajouter la phase E ; bien homogénéiser. Ajouter la phase F ; bien homogénéiser. Exemples d'ingrédients pouvant être ajoutés à cette formulation : - PACIFEELTM : ingrédient actif apaisant commercialisé par Sederma comprenant un extrait de la plante Mirabilis Jalapa, qui apaise et améliore le confort des peaux sensibles et réactives. - RESISTEMTm : ingrédient anti-âge commercialisé par Sederma (W02012/104774), aidant la peau 10 à construire son propre système de défense anti-âge, à base d'un extrait obtenu par culture cellulaire de la plante Globularia cordifolia. - MEIRITAGETm : ingrédient actif anti-age à base de trois extraits de plantes (Astragalus membranaceus (Huang Qi), Bupleurum falcatum (Chai Hu) et Atractylodes macrocephala (Bai Zhu), qui améliore l'uniformité et l'éclat du teint. 15 4) Forme « Gel » pour le contour des yeux, particulièrement adaptée notamment pour la «vallée des larmes» PRODUIT % NOM INCI Phase A H20 Qsp100 Water Sorbate de Potassium 0,10 Potassium Sorbate Disulfite de Sodium 0,01 Sodium Sulfite Phase B Keltrol CG-SFTTM 0,50 Xanthan Gum N-HANCE HP4OTM 0,25 Hydroxypropyl Guar ZemeaTM 1,90 Propanediol Phénoxyéthanol qs Phenoxyethanol Phase C Crodamol ISIS-LQ-(MV)TM 2,90 Isostearyl Isostearate Span 20-LQ-(SG)TM 0,70 Sorbitan Laurate Ethanol 4,80 Ethanol Parfum 0,10 Fragrance Phase D H20 2,00 Water Acide lactique 0,02 Lactic Acid Phase E Ingrédient actif selon l'invention 1,00 à 5,00 / Protocole : Peser la phase A et bien homogénéiser. Peser la phase B et bien homogénéiser. Ajouter la phase B à la phase A lentement sous agitation hélice v=600tr/min, pendant 30 min. Peser la phase C et mélanger. Rajouter la phase C dans la phase A+B sous agitation forte Staro v=3000t/min. Ajuster le pH à 20 5,50±0,10 avec la phase D. Ajouter la phase E dans la phase précédente et bien homogénéiser.

3031454 24 Exemples d'ingrédients pouvant être ajoutés à cette formulation : - MATRIXYL synthe'6TM : ingrédient actif anti-rides à base de peptides commercialisé par Sederma (W02010/082175) qui aide à réparer les dommages cutanés causés par le vieillissement. - HALOXYLTM : actif commercialisé par Sederma (W02005/102266), qui améliore le contour des 5 yeux en résorbant les cernes. 3% de cet ingrédient peuvent par exemple être ajoutés en fin de formulation. - EYELISSTm : est un actif commercialisé par Sederma (W02003/068141), qui aide à prévenir et lutter contre l'apparition des poches sous les yeux. 3% de cet ingrédient peuvent par exemple être ajoutés en fin de formulation. 10 5) Forme serum « base de teint » avec protection solaire PRODUIT % NOM INCI Phase A H20 Qsp100 Water Sorbate de potassium 0,10 Potassium Sorbate Phase B Glycérine 2,00 Glycerin Phénoxyéthanol qs Phenoxyethanol Keltrol CG-SFTTM 0,60 Xanthan Gum Vivapur CS 032TM 0,25 Microcrystalline Cellulose & Xanthan Gum Phase C Eusolex 4360TM 1,80 Benzophenone-3 Eusolex 2292TM 3,50 Ethylhexyl Methoxycinnamate & BHT Span 40-PW-(MV)TM 1,00 Sorbitan Palmitate Span 60-PW-(MV)TM 1,50 Sorbitan Stearate Crodamol GTCC-LQ-(RB)TM 1,35 Caprylic/Capric Triglyceride Prisorine 3505TM 1,35 Isostearic Acid Phase D H20 0,20 Water Acide Lactique 0,02 Lactic Acid Phase E Ingrédient actif selon l'invention 1,00 à 5,00 Phase H Parfum 0,10 Fragrance Protocole : Peser et mettre la phase A sous agitation hélice v=500temin. Peser la phase B et bien homogénéiser. Ajouter la phase B dans la phase A sous agitation hélice v=800temin ; bien homogénéiser. Mettre la phase A+B à chauffer à 75°C au bain marie. Peser la phase C et mettre à chauffer au bain marie à 75°C. Ajouter la phase C dans la phase A+B sous agitation staro 15 v=1000tr/min. Homogénéiser 30 min. Ajuster le pH à 5,80±0,1 avec la phase D, en dessous de 35°C. Ajouter la phase E, bien homogénéiser. Ajouter la phase F, bien homogénéiser. Eusolex 4360TM est un filtre UVA et Eusolex 2292TM un filtre UVB. Exemples d'ingrédients pouvant être ajoutés à cette formulation : - DERMAXYLTm : ingrédient actif anti-âge commercialisé par Sederma (W02004/101609) qui 20 lisse les rides et répare la barrière cutanée. 3031454 25 - VENUCEANETM : ingrédient actif commercialisé par Sederma (W02002/066668) qui prévient des signes visibles du photovieillissement (taches, rides, sécheresse...), protège les structures cellulaires des dommages engendrés par les UV et renforce l'intégrité de la peau. - MELASLOWTm : actif commercialisé par Sederma qui favorise l'éclaircissement du teint et la 5 dépigmentation des taches (extrait de Mandarine du Japon Citrus reticulata Blanco var. unshiu). 6) Forme crème pH acide PRODUIT % NOM INCI Phase A H20 Qsp100 Water Sorbate de Potassium 0,10 Potassium Sorbate Phase B Glycerin 5,00 Glycerin Phénoxyéthanol qs Phenoxyethanol Keltrol CG-SFTTM 0,60 Xanthan Gum Supercol GF 0,25 Cyamopsis Tetragonoloba (Guar) Gum Phase C Span 40-PW-(MV)TM 1,00 Sorbitan Stearate Span 60-PW-(MV)TM 1,50 Sorbitan Palmitate Crodamol IPIS-LQ-(MV)Tm 4,00 Isopropyl Isostearate Prisorine 3505TM 4,00 Isostearic Acid Phase D H20 Qsp100 Water Acide lactique 0,04 Lactic Acid Phase E Ingrédient actif selon l'invention 1,00 à 5,00 Phase F Parfum 0,10 Fragrance Phase G FruitbioTM 0,90 Water (Aqua) - Lactic acid - Camelia sinensis leaf extract - Glycerin - Citric acid - Malic acid Protocole : Peser la phase A et mettre sous agitation hélice v=130t/mn. Peser et homogénéiser la phase B. Ajouter la phase B dans la phase A sous agitation hélice v=400t/mn, bien homogénéiser pendant 30 min. Mettre à chauffer la phase A+B à 75°C au bain-marie. Peser la phase C et mettre à chauffer à 75°C 10 au bain-marie. Ajouter la phase C dans la phase A+B, sous agitation staro v=1000t/min ; homogénéiser 30 min. Ajuster le pH à 5,60±0,10 avec la phase D, en dessous de 35°C. Ajouter la phase E dans la phase précédente, bien homogénéiser. Ajouter la phase F, bien homogénéiser. Ajuster le pH à 3,50±0,10 avec la phase G. FruitbioTM est un ingrédient actif commercialisé par Sederma constitué d'un complexe d'ahydroxyacides associé à un extrait de thé vert.

15 Exemples d'ingrédients pouvant en outre être ajoutés à cette formulation : - CALMOSENSINETm : ingrédient actif calmant commercialisé par Sederma (W01998/07744) contenant le lipo-dipeptide Tyr-Arg. Il diminue les sensations d'inconfort. - PHYTOTONINETm : actif commercialisé par Sederma comprenant une association synergique de trois actifs végétaux, les flavonoïdes de fleurs d'Arnica montana, les saponosides de rhyzomes de 3031454 26 Polygonatum multiflorum (Sceau de Salomon) et les proanthocyanidols de cônes de Cupressus sempervirens (Cyprès) ; améliore nettement l'apparence de la peau « couperosée ». - CHROMOCARETm : actif anti-âge associant un extrait de Rabdosia rubescens riche en oridonine et d'un extrait de Siegesbeckia orientalis riche en darutoside, commercialisé par Sederma 5 (W02010/119423) qui unifie et rajeunit le teint. 7) Forme crème épaisse, notamment pour une crème de nuit PRODUIT % NOM INCI Phase A H20 Qsp100 Water Sulfate de Magnésium 1,10 Magnesium Sulfate Phase B Glycérine 5,00 Glycerin Phénoxyéthanol qs Phenoxyethanol Phase C Beeswax BP-EP 139901TM 2,00 Cera Alba Crodamol MM-PA-(RB)TM 3,00 Myristyl Myristate Arlacel 986-S0-(MV)TM 3,50 Sorbitan Isostearate & Hydrogenated Castor Oil & Cera Alba & Stearic Acid Cithrol PG32IS-LQ-(MV)TM 1,50 Polyglyceryl-3 Diisostearate Crodamol GTCC-LQ-(MV)TM 7,00 Caprylic/Capric Triglyceride Crodamol GTIS-LQ-(MV)TM 2,00 Triisostearin Squalane 6,00 Phase D Ceramide 2TM Ceramide NG Crodamol ISIS-LQ-(MV)TM Isostearyl Isostearate Phase E Ingrédient actif selon l'invention 1,00 à 5,00 / Phase F Parfum 0,10 Fragrance Protocole : Peser la phase A. Peser et mélanger la phase B. Ajouter la phase B dans la phase A et bien mélanger. Mettre la phase A+B à chauffer à 75°C au bain-marie. Peser la phase C et la mettre à chauffer à 75°C au bain-marie. Bien homogénéiser. Chauffer la phase D à 90°C sur une plaque 10 chauffante tout en mélangeant avec une spatule. Ajouter la phase D à la phase C à 75°C au bain marie. Ajouter la phase E à la phase A+B à 75°C au bain marie. Ajouter lentement la phase A+B+E à la phase C+D sous agitation forte (s=2500tr/min, puis 1500tr/min hors bain marie). Ajouter la phase F. Le CERAMIDE 2TM est un ingrédient actif commercialisé par Sederma, constitué d'une substance pure identique aux céramides présents dans la peau, lesquels constituent 40 à 50% des lipides cutanés.

15 Cet ingrédient possède une fonction restructurante, maintient l'hydratation et l'intégrité de la barrière cutanée. E) Tests in vivo L'évaluation de l'efficacité in vivo du traitement selon l'invention a été menée sur le cou et sur le pli de la vallée des larmes.

20 3031454 27 Principe L'étude a été menée sur des femmes d'âge moyen 59 ans (41 - 71ans) présentant plusieurs signes visibles de l'âge : - sur le cou avec une mesure de la surface tombante, par analyse d'images sur photographies 5 standardisées, ainsi qu'une évaluation experte sur ces mêmes photographies. - sur le pli de la vallée des larmes (« tear trough » en anglais, creux dans lequel viennent s'écouler les larmes avant de rouler sur les joues), avec une mesure de sa surface par projection de franges. Pour le cou, un panel de 31 personnes d'âge moyen 60ans (45 - 71ans) a été retenu sur la base de l'importance visible de la surface tombante.

10 Pour la vallée des larmes, 21 personnes, âgées de plus de 55ans, ont été incluses sur la base de l'importance visible de ce type de pli (âge moyen 64ans (56 - 71ans)). Protocole Critères d'inclusion particuliers Les volontaires devaient présenter une surface tombante certaine de leur peau du cou et présenter un 15 pli nettement visible au niveau de la zone dite « Vallée des larmes ». Une constance hormonale durant les 3 mois précédant le test et pendant le testa été demandée. Une période de wash-out de 7 jours était exigée, au cours de laquelle le volontaire n'utilisait sur le visage qu'une simple crème hydratante. Lors du test, une exposition solaire modérée et l'usage exclusif des produits fournis était demandé. Type d'études et durée 20 L'étude a été menée en simple aveugle sur le cou et le visage. Chaque volontaire a appliqué une crème selon l'invention (formule de l'exemple 1 de la galénique à 2%) et une crème placebo en contra-latéral sur son visage, sauf pour le cou où, pour des raisons pratiques, elles n'ont appliqué que la crème à 2% selon l'invention. Les 2 crèmes ont été appliquées en massage bi-quotidien pendant 6 semaines. Le synopsis de l'étude peut se résumer selon le schéma ci-dessous.

25 TO T 3 semaines T 6 semaines Dermatop, pli de la vallée des Dermatop, pli de la vallée des larmes larmes Photos visage & cou Photos cou Photos visage & cou Les études statistiques ont été effectuées à l'aide du test t de Student ou, si besoin, avec un test non 30 paramétrique de Wilcoxon. Les tests unilatéraux ont été effectués sur séries appariées. Etude de la surface tombante du cou et lissage L'efficacité du produit selon l'invention sur le cou a consisté à mesurer la partie tombante du cou par une analyse d'images de photographies standardisées, et en une évaluation experte sur ces mêmes photographies.

35 Des photos ont été réalisées à TO et T3semaines à l'aide d'un banc photographique (Société Orion Concept, France) munis d'un appareil numérique haute définition, d'un éclairage spécifique ainsi que d"un système de contention des volontaires. La position du visage, les paramètres photos et d'éclairage étaient standardisés et contrôlés afin d'être reproduits au cours du temps. La surface tombante du cou a été mesurée sur photo prise de profil, par analyse d'image. Des repères anatomiques inamovibles (cicatrices, taches..) ont été utilisés pour définir précisément les contours de la surface du cou incluant la surface tombante.

3031454 28 Tableau 9 : Surface (en mm2) TO T3sem. Moyenne ± E-type 101,2 ± 40 90,5 ± 42 % variation vs.TO référence -10,6% Significativité vs. TO Répondeurs p<0,01 77% Ces résultats montrent une diminution dès 3 semaines, de la surface tombante du cou ; cette diminution atteint environ 11% (p<0,01) de la surface mesurée à TO. En parallèle, un fort taux de répondeur a été observé (77%). Concernant l'effet de lissage de la peau du cou, celui-ci a été apprécié par un panel de 7 juges experts 5 qui ont visualisé les photos des 28 volontaires ayant des plis sur le cou. Les experts ont trouvé un effet de lissage dans 56% des cas après 6semaines. Etude du pli de la vallée des larmes La vallée des larmes (« tear trough » en anglais) est le creux dans lequel viennent s'écouler les larmes avant de rouler sur les joues. Ce creux sous-orbitaire est en continuité avec la paupière inférieure et va 10 parfois se prolonger entre la joue et la pommette. Il se creuse significativement avec l'âge d'où l'augmentation de son volume. Les facteurs généralement mis en cause sont la fonte graisseuse et la flacidité. Afin de tester l'efficacité du traitement selon l'invention sur ce site, un système sans contact FOITS (« Fast Optical In vivo Topometry System ») a été utilisé. Ce système est basé sur l'analyse de la 15 projection de franges optiques sur la zone cutanée étudiée, ici la vallée des larmes. L'appareil utilisé (Société Dermatop ; Eotech, France) est constitué d'un projecteur et d'une caméra qui sont solidaires et forment un angle précis, permettant la triangulation. L'étude de la déformation des franges par le relief de la zone permet une reconstruction 3D du relief. L'objectivation de l'effet selon l'invention a été faite, à l'aide du logiciel AevaTM (Eotech, France), en 20 analysant les données sur l'étendue de la vallée des larmes mesurée par sa circonférence. En parallèle, le paramètre volume de cette vallée a été obtenu par la même technique. Tableau 10 : Variation de l'étendue de la vallée des larmes et du volume après application selon l'invention. (N=21 volontaires ; >55ans) Etendue de la Vallée des larmes Volume de la vallée des larmes (mm) (mm3) Selon l'invention Placebo Selon l'invention Placebo TO T6 TO T6 TO T6 TO T6 Moyenne ± E- type 55,6 50,6 51,6 51,6 6,8 6,2 7,4 7,8 ± 15,1 ± 14,0 ± 13,0 ± 14,1 ± 5,2 ± 4,9 ± 6,9 ± 6,7 variation vs.TO x -9% x 0,0% X -8,8% x +5,4% 3031454 29 Significativité vs. TO p<0,01 dns p=0,082 dns -33% X -84% X Maximum 86% x 62% x Répondeurs Significativité vs. Placebo x p<0,01 x x X p<0,01 x x dns : différence non significative. Les résultats montrent que le traitement selon l'invention conduit à une réduction de 9% de l'étendue de la vallée des larmes (mesurée en circonférence), cette réduction étant significative par rapport au placebo (p<0,01). En contra-latéral l'application d'un placebo ne produit aucun changement 5 significatif. Par ailleurs, le volume de la vallée des larmes de ces personnes de plus de 55ans, est réduite de 8,8%, cette réduction étant significative (p<0,01) par rapport au placebo.

Claims

REVENDICATIONS1. Utilisation de cellules végétales indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro pour un traitement cosmétique non thérapeutique pour restaurer l'homéostasie des cellules de la peau âgée et accroître leur activité métabolique et énergétique.
2. Utilisation selon la revendication 1 de cellules végétales entières et/ou lysées.
3. Utilisation selon la revendication 2 d'un extrait cellulaire desdites cellules entières et/ou lysées.
4. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 3, de cellules végétales sous forme séchée.
5. Utilisation selon la revendication l'une des revendications 1 à 4, d'une composition cosmétique comprenant lesdites cellules végétales mises en suspension et/ou solubilisées dans un milieu physiologiquement acceptable.
6. Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que le milieu physiologiquement acceptable est une matrice hydrophile.
7. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que le traitement est topique.
8. Utilisation selon l'une des revendications 1 à 7, pour un traitement réparateur tenseur et de lissage sur une peau âgée.
9. Utilisation selon la revendication 8, pour un traitement cosmétique de la surface tombante du cou et/ou du pli de la vallée des larmes.
10. Utilisation de cellules végétales indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro pour la fabrication d'un ingrédient actif cosmétique non thérapeutique pour restaurer l'homéostasie des cellules de la peau âgée et accroître leur activité métabolique et énergétique.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que l'ingrédient actif comprend au moins 0,04% d'acides léontopodiques A et B.
12. Ingrédient actif cosmétique, pour une utilisation selon l'une des revendications 1 à 9, comprenant des cellules végétales indifférenciées ou dédifférenciées de Leontopodium alpinium obtenues par un procédé de culture cellulaire in vitro et comprenant au moins 0,04% d'acides léontopodiques A et B dans une matrice physiologiquement acceptable.
13. Ingrédient selon la revendication 12, caractérisé en ce que les cellules végétales sont entières et/ou lysées.
14. Ingrédient selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend un extrait cellulaire desdites cellules entières et/ou lysées.35