KR20150024502A

KR20150024502A - 피부 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20150024502A
Application number: KR20130101434A
Authority: KR
Inventors: 장영표; 정세영; 김동일
Original assignee: 경희대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-27
Filing date: 2013-08-27
Publication date: 2015-03-09

Abstract

본 발명은 승마갈근탕 추출물 또는 이로부터 분리 동정된 승마갈근탕 유래 화합물들을 포함하는 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 안전한 천연 제제를 이용한 것으로 부작용이 없으며 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제(MMP-1) 발현 저해 및 Type-1 procollagen 발현 증가 등을 통해 주름 개선, 탄력 증진 효과를 가진다.

Description

피부 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물 {A cosmetic composition for preventing and improving skin winkle}

본 발명은 승마갈근탕을 포함하는 피부 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

주름이 형성되는 원인은 자연적 노화에 의한 주름의 생성과 자외선 노출(광노화)에 의한 주름의 생성으로 크게 나눌 수 있는데, 두 가지 원인에 의한 주름 형성 메커니즘은 아직까지 정확하게 밝혀져 있지 않은 상태이다. 자연적 노화와 광노화에 의한 피부변화와 관련되어 발견되는 공통적인 현상은 진피 내의 주 구성단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형, 진피의 기질인 히아루론산의 감소에 의한 피부 탄력 감소이다. 특히 지금까지의 연구결과에 의하면 진피 내 주 단백질인 콜라겐 및 엘라스틴의 감소 및 변형이 주름의 생성 및 피부의 탄력저하에 직접적으로 관여하는 것으로 알려져 있다.

콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서 세포외 간질에 존재하고, 중요한 기능으로는 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포 접착의 지탱, 세포분할과 분화(유기체의 성장 혹인 상처 치유시)의 유도 등이 알려져 있다. 이러한 콜라겐은 연령 및 자외선 조사에 의한 광노화에 의해 감소하며, 이는 피부의 주름 형성과 밀접한 연관이 있다고 알려져 있다. 또한 근래에 들어 피부 노화에 대한 광범위한 연구 결과가 보고되면서 피부에서의 콜라겐의 중요한 기능이 밝혀지고 있다. 콜라겐 합성을 촉진하여 주름개선효과를 나타내는 유효성분들이 알려져 있다. 예를 들어, 레티노산(retinoic acid), TGF(Transforming growth factor), 동물 태반 유래의 단백질, 베툴린산(betulinic acid), 클로렐라 추출물 등이 콜라겐 합성 촉진 물질로서 알려져 있다.

승마갈근탕은 방제학에 수록되어 있는 승마, 갈근, 작약, 감초의 4가지 한약재로 구성되어 있다. 사용된 한약재는 오래 전부터 외부로 나타나는 피부 발진에 응용되어 온 처방을 현재에 맞게 수정보완하여 개발한 처방으로, 최근 항 알레르기 및 면역반응, 항히스타민 효과, 항염증 등이 입증되어 알레르기 질환의 하나인 두드러기에, 외부 인자의 풍열을 제거하고 오장육부의 부조화로 인한 허약을 조절, 혈허생풍하여 기혈상태와 순환을 개선할 목적으로 사용하였다.

승마갈근탕의 성분으로, 승마(Cimicifugae Rhizoma)는 숲 속에서 자라는 미나리아 재비과의 다년생 초본으로 동속 식물로는 왜승마(Cimicifuga japonica S.), 눈빛승마(Cimicifugae dahurica M.), 촛대승마(Cimicifuga simplex T.), 황새승마(Cimicifugae foetida L.) 등이 있다. 예로부터 약용으로 사용되어 열이 나거나 부종을 내리고 두드러기에도 사용되었다. 7~8월에 줄기 끝이 겹층상 차례의 자잘한 흰색 꽃이 모여 달린다.

갈근(Puerariae Radix)은 콩과 식물의 다년생 초본인 칡(Pueraria lobata O.)의 뿌리를 건조시킨 것으로 한국, 중국, 일본 각 지역의 산에 자생한다. 한의학에서는 칡의 여러 부위를 각각 분류하여, 칡뿌리를 건조한 것을 갈근, 꽃은 갈화, 열매는 갈곡 또는 갈실, 잎은 갈엽, 덩굴은 갈만이라 부르며 질병의 증상 및 치료방법에 따라 각각 다르게 사용하여 왔다. 한방에서 갈근은 기육을 풀어 주는 작용을 하므로 감기 몸살이나 발진성 질환, 항강통 등에 해표 시킬 목적으로 사용되며, 비장과 위장의 기를 상승하게 도와주어 진액을 만들어 갈증을 해소하게 하고 지사시키는 작용을 한다.

감초(Glycyrrhizae Radix)는 콩과(Leguminosae)에 속하는 다년생초본이며, 유럽감초(Glycyrrhiza glabra L.), 만주감초(Glycyrrhiza uralensis F.) 또는 기타 동속식물의 뿌리와 주출경을 그대로 또는 주피를 제거한 것이다. 감초의 약리작용으로 부신피질 호르몬 작용, 항염 활성증 및 항알레르기 작용, 소화계통에 대한 작용, 해독 작용, 지질대사에 대한 작용, 실험성 황달에 대한 영향, 진해 작용, 진통 및 항경련 작용, 비뇨 및 생식기계통에 대한 작용, 항종양 작용, 기타 체중증가작용, 근력 증강 작용, 혈압 상승 작용, 용혈 작용, 억균 작용, 항균작용, 해열작용, 조충에 대한 구충 작용 등이 밝혀졌다. 약용으로 주로 뿌리와 포복경을 이용한다.

작약은 꽃이 분홍으로 피는 것과 흰색으로 피는 것으로 구분되는데 백작약이 효과가 월등히 우수하고, 대개 뿌리를 약으로 이용하는데 신맛을 가지고 있어 기가 약해진 사람의 기운을 회복시킨다. 과로나 감기기운 있을 때 흔히 우리가 먹는 쌍화탕의 주 약제가 작약이다. 백작약은 피를 잘 돌게 하고 상처를 아물게 하고 기미를 예방 치료한다.

한국특허공개공보 제2011-0038551호, 2011. 04. 14

본 발명의 목적은 주름 개선 및 탄력 증진 효과를 가지는 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명자들은 주름 개선 및 탄력 증진 등의 항노화 활성을 갖는 화장료 조성물을 개발하고자 예의 연구한 결과, 승마갈근탕이 우수한 항노화 활성을 가짐을 확인하였으며, 이로부터 분리되어 그 구조가 동정된 푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid), 다이진(Daizin) 등이 주름 개선에 우수한 활성을 나타냄을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이렇게 분리된 푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid) 및 다이진(Daidzin)은 각각 하기 화학식 1 내지 5의 구조를 가진다.

[화학식 1]

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

[화학식 5]

따라서, 본 발명은 승마갈근탕 추출물을 포함하는 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid) 및 다이진(Daidzin)을 함유하는 승마갈근탕 추출물을 포함하는 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 승마갈근탕 추출물로부터 분리된 푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid) 및 다이진(Daidzin)으로부터 선택되는 1 이상을 유효성분으로 함유하는 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 승마갈근탕 추출물, 및 이로부터 분리동정된 푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid) 또는 다이진(Daidzin)은 안전한 천연 제제를 이용한 것으로 부작용이 없으며 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제(MMP-1) 발현 저해, 및 Type-1 procollagen 발현 증가 등을 통해 주름 개선, 탄력 증진 효과 등을 가진다.

본 발명에 있어서, 승마갈근탕 추출물에 함유되는 승마, 갈근, 작약 및 감초는 국내외에서 저비용으로 원료 확보가 용이하며 구입하거나 직접 채취한 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 승마갈근탕의 원료인 승마, 갈근, 작약 및 감초는 승마 40중량% 내지 50 중량%, 갈근 15중량% 내지 20 중량%, 작약 15중량% 내지 20 중량% 및 감초 15중량% 내지 20 중량%로 구성되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 승마갈근탕 추출물은 농축된 액상일 수도 있고, 동결 건조된 분말형태일 수도 있다.

본 발명에 있어서 승마갈근탕의 제조는 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 추출 방법 등을 사용하여 제조할 수 있으며, 추출 회수는 1 내지 5회인 것이 바람직하다. 추출 용매는 물, 알코올 또는 이의 혼합물, 바람직하게는 물, 에탄올 수용액을 사용하는 것이 좋으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 용매의 양은 승마, 갈근, 작약 및 감초의 총중량의 5 내지 15 배로 한다. 열수(물) 추출물의 경우 100~110℃에서 4~5시간 동안 수욕 환류추출하는 것을 2 내지 4회 반복하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 또한 상기 승마갈근탕 추출물을 추가로 분리하여 얻어진 승마갈근탕 분획물을 제공한다. 분획분리는 당해 분야에 알려진 분리법에 의해 수행된다. 바람직하게는 승마갈근탕을 물에 현탁한 후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 등의 용매를 이용하여 추출하여 승마갈근탕 가용 추출물을 수득할 수 있다.

또한, UPLC-DAD 등을 통해서 승마갈근탕의 주요 지표물질의 분석이 가능하며, 물질 분석시 아세토니트릴 및 물을 이동상으로 하여 분석을 하는 것이 바람직하다.

본 발명의 주름 예방 및 개선 효과를 가지는 승마갈근탕 유래 화합물들은 통상의 치환기들의 합성 및 분획 방법을 통하여도 합성할 수 있다.

본 발명에서 승마갈근탕 추출물 또는 이로부터 분리 동정된 승마갈근탕 유래 화합물들은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상 형태로 0.001% ~ 10중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 화장료 조성물 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.01∼5중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.

본 발명에서 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 승마갈근탕 추출물 또는 이로부터 분리 동정된 승마갈근탕 유래 화합물들 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 폴리옥시에칠렌 경화피마자유, 글리세롤, 글리세린, 지방족 에스테르, 페녹시에탄올, 트리에탄올아민, 폴리에틸렌 글리콜, 밀납, 폴리솔베이트 60, 솔비탄세스퀴오레이드, 파라핀, 소르비탄 스테아레이트, 친유형 모노스테아린산 글리세린, 스테아린산, 글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트, 카르복시폴리머, 시토스테롤, 폴리글리세릴 2-올레이트, 세라마이드, 콜레스테롤, 스테아레스-4, 디세틸포스페이트, 마카다미아 오일, 카르복시비닐폴리머, 산탄검 또는 소르비탄의 지방산 에스테르 등이 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올, 부틸렌글리콜 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 하이드록시에틸셀룰로오즈, 소디움히아루로네이트, 페녹시에탄올, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 승마갈근탕 추출물, 및 이로부터 분리동정된 푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid) 또는 다이진(Daidzin)은 안전한 천연 제제를 이용한 것으로 부작용이 없으며 콜라겐 생성 촉진, 콜라게나아제(MMP-1) 발현 저해 및 Type-1 procollagen 발현 증가 등을 통해 주름 개선, 탄력 증진 효과를 가진다.

도 1은 승마갈근탕의 지표 활성 성분 탐색을 위한 UPLC 분석 결과와 이의 Major peak의 UV-Spectra를 나타낸 도이다.
도 2는 푸에라린, 3'-메톡시푸에라린 및 다이진의 질량 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 승마갈근탕 처리에 따른 세포 생존률 변화를 나타낸 도이다.
도 4는 승마갈근탕 처리에 따른 Type-1 Procollagen의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 5는 승마갈근탕 처리에 따른 MMP-1 의 발현 변화를 나타내는 도이다.
도 6는 승마갈근탕 처리에 따른 MMP-1 및 Type-1 Procollagen의 단백질 발현 변화를 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타내는 도이다.

이하, 하기 실시예 및 실험예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1. 승마갈근탕 추출물의 제조

승마갈근탕 추출물을 제조하기 위하여, 승마(원산지:중국 내몽고산), 갈근(원산지:경북산), 감초(원산지:중국 내몽고산), 작약(원산지:중국산)을 승마, 갈근, 감초는 (주)옴니허브에서 구입하고, 작약은 (주)이풀잎에서 구입하여 물로 세척하고 음건한 후에 사용하였다.

상기 승마, 갈근, 감초 및 작약을 각각 승마 50 g, 갈근 25g, 감초 25g, 작약 25g을 증류수 1L에 넣고 환류관을 장착한 후 100℃에서 4시간 동안 환류추출하여 22 g의 승마갈근탕 추출물을 제조하였다.

실험예 1. 승마갈근탕의 지표 성분 분석

승마갈근탕에 포함된 주요 지표 물질을 검출하기 위하여 UPLC-DAD 분석을 수행하였다.

UPLC-DAD 분석은 PDA detector, Sample Manager-FTN, Quaternary solvent manager로 구성된 Waters AcQuity Ultra Performance LF로 수행하였다. 분석은 내경 2.1mm, 직경 75mm, particle size 2.7μm인 ACQUITY UPLC HSS C18 Column을 사용하여 수행하였으며, 분석 파장 315nm에서 용매 A : Acetonitrile (0.1% Acetic acid) 및 용매 B : H₂O (0.1% Acetic acid)를 하기 표 1의 이동상 조건으로 하여 실험을 수행하였다.

시료는 상기 실시예 1에서 제조한 승마갈근탕 추출물을 30mg/ml 농도로 1차 정제수에 녹인 후에, Pore size 0.2 um의 PVDF syringe filter로 필터링하고 1ul의 Injection volume으로 실험을 수행하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1 (a)에 나타낸 바와 같이, 승마갈근탕의 주요 지표물질로 4 가지 종류의 Major Peak를 관찰하였다. 이들 각각을 기존 문헌의 분광학적 데이터와 비교 분석하여 4가지 성분을 추정하였으며, 각각 Rt = 12.498min의 peak 1번은 Puerarin (b), Rt = 14.317min의 peak 2번은 3'-Methoxypuerarin (c), Rt = 15.199min의 peak 3번은 ferulic acid 또는 isoferulic acid (d), Rt = 15.690min의 peak 4번은 갈근의 daidzin (e)의 성분임을 확인하였다.

보다 정확한 지표 성분 분석을 위해 UPLC-DAD-ESI-MS를 검토하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 질량 분석을 통해 Puerarin (a), 3'-Methoxypuerarin (b), Daidzin (c) 의 지표물질을 확인하였다.

실험예 2. 승마갈근탕의 세포 독성 여부 확인

MTT assay를 이용하여 승마갈근탕 추출물의 세포 독성 여부를 확인하였다. Human fibroblast 세포를 24 well plate에 10⁴cells/well의 수가 되도록 1 ㎖ 의 세포 현탁액을 분주하고 24 시간 후, 승마갈근탕 추출물을 농도 (0~400 ㎍/mL)에 따라 처리하였다. 투여 농도는 최종 농도로 하여서 시험 물질에 맞게 제조하였으며, 48시간 배양 후 phosphate buffered saline (PBS pH 7.4) 으로 2회 세척 후 배양액에 10배 희석한 MTT 시약 (0.5 mg/mL)을 처리하였다. 시약 처리 4 시간 후 배양액을 제거한 후 DMSO용액을 넣어 세포를 녹이고, 이 때 나타나는 포르마잔염의 농도를 560nm 에서 흡광도법을 이용하여 측정하였다.

세포 생존율은 하기 [식 1]에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 도 3에 나타내었다.

[식 1]

도 3에 나타낸 바와 같이, 세포에 처리한 농도까지 승마갈근탕 처리에 의해서 세포 성장률에 변화가 없음을 확인하였으며, 승마갈근탕이 세포 독성을 나타나지 않음을 확인하였다.

실험예 3. Type -1 procollagen 합성능 평가

Human fibroblast 세포를 이용하여 제1형 프로콜라겐(Type-1 procollagen) 합성 정도를 측정하였다.

Human fibroblast 세포를 배양접시 바닥에 접종한 후 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 U/mL penicillin, 그리고 100 mg/mL 의 streptomicin이 포함된 DMEM media를 이용하여 5% CO₂를 포함하는 37℃ 배양기 내에서 배양하였다.

프로콜라겐(Procollagen) 생합성능을 측정하기 위하여, Human fibroblast 세포를 12 well plate에 2×10⁴세포/웰로 분주하고 37℃를 유지하여 5% CO₂를 포함하는 배양기 내에서 24시간 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 24 시간 세포의 기아상태를 유지하며 이후 시험 물질을 세포 배양 배지에 희석하여 농도별 (0~400 ㎍/mL)로 세포에 처리한 후 37℃를 유지하여 48 시간 배양하였다. 48 시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 Procollagen Type-1 C-Peptide (PIP)Elisa kit (Takara Bio Inc., JAPAN)를 사용하여 프로콜라겐 양을 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후, 1N NaOH로 라이시스(lysis)시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 프로콜라겐 합성 양을 측정하였다. 각각의 프로콜라겐 양과 단백질 양은 검량선에 따라 계산하였다. 단백질 양의 측정은 로우리법(Lowry method)를 기본으로 한 BCA protein assay kit(Thermo Scientific, 23225)를 사용하여 측정하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 유의성있게 콜라겐 전구 물질인 Type-1 Procollagen의 수치가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4. 콜라게나아제 ( MMP -1) 발현 저해효과 확인

Human fibroblast 세포를 이용하여 콜라게나아제(MMP-1)의 발현 저해효과를 측정함으로써 주름개선 효과를 확인하였다.

Human fibroblast 세포를 24-well plate 바닥에 접종한 후 10% fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 U/mL penicillin, 그리고 100 mg/mL 의 streptomicin이 포함된 DMEM media를 이용하여 5% CO₂를 포함하는 37℃ 배양기 내에서 배양하였다. 그 후, 배지를 제거하고 24 시간 세포의 기아상태를 유지하며 이후 시험 물질을 세포 배양 배지에 희석하여 농도별 (0~400 ㎍/mL)로 세포에 처리한 후 37℃를 유지하여 48 시간 배양하였다. 48 시간 후에 배양된 세포의 배지를 수거하여 MMP-1 Elisa kit (Calbiochem, Germany)를 이용하여 콜라게나제 농도를 측정하였다. 한편, 바닥에 부착되어 있는 세포는 PBS(Phosphate Buffered Saline)로 세척한 후, 1N NaOH로 라이시스(lysis)시켜 총 단백질 양을 측정하여 일정 단백질 당 프로콜라겐 합성 양을 측정하였다. 각각의 프로콜라겐 양과 단백질 양은 검량선에 따라 계산하였다. 단백질 양의 측정은 로우리법(Lowry method)를 기본으로 한 BCA protein assay kit(Thermo Scientific, 23225)를 사용하여 측정하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 농도 의존적으로 유의성있게 콜라겐 전구 물질인 MMP-1의 수치가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5. Western Blotting 을 통한 MMP -1 및 Type -1 Procollagen 발현 변화 확인

자외선 조사 후에 승마갈근탕이 MMP-1 및 Type-1 Procollagen의 발현에 미치는 영향을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다.

Human fibroblasts 세포 5×10⁴ 세포/웰을 6-well plate에 접종한 후 DMEM media를 이용하여 24 시간 동안 배양하였다. 배양액을 제거 한 후 PBS를 이용하여 2번 세척 후 각 웰당 0.5 mL의 PBS를 분주 한 후 자외선B를 조사하였다 (180 mJ/cm²). 자외선 조사 후 바로 PBS를 제거한 후 400 ㎍/mL의 승마갈근탕이 포함된 DMEM 배양액을 분주한 후 24 시간 동안 배양하였다. 24 시간 후 배양액을 제거한 후 라이시스 (lysis; 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.32 mM sucrose, protease inhibitor, 1 mM PMSF, 0.5 M EDTA (pH 8.0), 1 mM NaF, and 1 mM Na₃VO₄) 버퍼를 이용하여 세포에서 단백질을 추출하였다. 30 ㎍으로 정량한 단백질을 8% SDS-PAGE Gel에 전기영동을 실시한 다음 transfer buffer (25 mM Tris-HCl (pH 7.4), 192 mM glycine and 20% v/v methanol)를 이용하여 PVDF membrane에 transffer 시켰다. Membrane 을 5% skim mile에 상온에서 2 시간동안 블로킹 (blocking) 시킨 후 5% BCS 용액에 1:1000 희석한 1차 항체를 이용하여 4℃에서 쉐이킹 (55 rmp) overnight 시켰다. Overnight 후 membrane에서 용액을 제거 한 다음 10분 동안 3회 세척하였다. 5% skim milk에 2차 항체를 1:5000 희석한 후 membrane과 함께 상온에서 2 시간 쉐이킹 (60 rmp)을 실시하였다. Membrane 10 분간 3회 세척 후 chemiluminescence kit (Amersham International, UK)를 이용하여 밴드를 관찰하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 승마갈근탕 처리에 의하여 MMP-1의 단백질 발현이 감소되고 Type-1 Procollagen 발현이 증가한 것을 확인하였다.

제형예 1. 승마갈근탕 추출물을 함유한 화장수 제조

승마갈근탕 추출물(실시예 1)을 함유한 화장수(스킨로션)를 하기의 [표 2]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

[표 2] 승마갈근탕을 함유한 화장수 조성

제형예 2. 승마갈근탕 추출물을 함유한 영양로션 제조

승마갈근탕 추출물 (실시예 1)을 함유한 영양로션을 하기의 [표 3]의 함량으로 하기 제조 방법을 이용하여 1kg을 제조하였다.

[표 3] 승마갈근탕 추출물을 함유한 영양로션 조성

Claims

승마, 갈근, 작약 및 감초를 함유하는 승마갈근탕 추출물을 포함하는 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 승마갈근탕 추출물은 승마 40중량% 내지 50 중량%, 갈근 15중량% 내지 20 중량%, 작약 15중량% 내지 20 중량% 및 감초 15중량% 내지 20 중량%로 이루어진 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 승마갈근탕 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 하나 이상의 용매로 추출된 것인 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 승마갈근탕 추출물은 푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid) 또는 다이진(Daidzin) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 것인 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 주름 예방 및 개선은 콜라게나아제 발현 저해 또는 프로콜라겐 발현 증가에 의한 것인 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료는 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 팩, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가지는 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.
푸에라린(Puerarin), 3'-메톡시푸에라린(3'-Methoxypuerarin), 페룰산(Ferulic acid), 이소페룰산(Isoferulic acid) 또는 다이진(Daidzin) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 화합물을 포함하는 주름 예방 및 개선용 화장료 조성물.