CN117586918A - 一种含丁酸梭菌代谢产物和植物乳杆菌的复方制剂及其在棕榈粕发酵上的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种复方制剂，其特征在于，所述复方制剂含有植物乳杆菌和丁酸梭菌代谢产物，所述丁酸梭菌代谢产物来自丁酸梭菌的发酵液离心上清的冻干粉；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，其菌株号为PC01，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M2022106。本发明利用丁酸梭菌HZNDC‑1发酵液离心上清对甘露聚糖的酶解作用，提出了一种新的用途；利用植物乳杆菌PC01对甘露糖的代谢与增殖能力，将丁酸梭菌HZNDC‑1代谢产物酶解棕榈粕释放的甘露糖进行转化，积累益生性的代谢产物，提高棕榈粕发酵后的价值；同时植物乳杆菌是同型发酵的乳酸菌，代谢产物主要是乳酸，不会产生太多挥发性的产物造成发酵过程的损耗，为棕榈粕发酵领域提供了一种新的组合方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种含丁酸梭菌代谢产物和植物乳杆菌的复方制剂及其在棕榈粕发酵上的应用。
背景技术
近年来，随着饲料原料价格的飙升，养殖行业对廉价的非常规原料需求大增。棕榈粕作为棕榈油加工业的副产品，产量大、来源稳定、价格低廉，是较好的替代品之一。但是棕榈粕中含有13％～20％的纤维，其中58％～78％的纤维是不溶性甘露聚糖，适口性差，难以消化，限制了棕榈粕在饲料配方中的应用范围。
发酵料全称为微生物发酵饲料，是指在人为可控的条件下，通过接种特定的益生菌及酶制剂，使其在菌酶协同的作用下改性升值，以达到改善适口性、促进消化吸收、提高原料利用率的一种饲料。
现有的棕榈粕发酵工艺要么依赖于物理化学等预处理环节，加大了工艺的复杂性和生产的安全隐患；要么依赖于丰富的外源酶系和复杂的菌剂配伍，增加了生产成本；或者使用含酵母菌、芽孢杆菌等易产生酒精、二氧化碳等挥发性物质的发酵菌剂，使得发酵过程物料损耗过高；甚至有些需要特殊的不在饲料添加剂目录中的生产菌株，存在未知的饲喂风险。
发明内容
本发明首先提供了一种植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，其菌株号为PC01，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022106。
本发明还提供了一种复方制剂，所述复方制剂含有上述的植物乳杆菌和丁酸梭菌代谢产物，所述丁酸梭菌代谢产物来自丁酸梭菌的发酵液离心上清的冻干粉，所述丁酸梭菌的菌株保藏编号为：CCTCC NO：M 2021874。
优选地，所述复方制剂还包含载体。
优选地，所述载体包括麸皮或米糠粕。
优选地，所述复方制剂包含重量份：丁酸梭菌代谢产物0.4～0.5份，植物乳杆菌0.05～0.15份，载体0.35～0.55份。
优选地，所述植物乳杆菌活菌数为50～150亿cfu/g。
本发明还提供了上述的复方制剂在棕榈粕发酵上的应用。
本发明还提供了一种棕榈粕的发酵方法，所述发酵方法包括接种上述的复方制剂的步骤。
优选地，在接种上述的复方制剂后，控制水分45％～50％，温度35℃～40℃，进行静置发酵3～5天。
优选地，所述发酵方法采用固态发酵。
本发明与现有技术相比，至少具有如下有益效果：
1、丁酸梭菌代谢产物来自于发酵液离心上清，是丁酸梭菌HZNDC-1活菌制剂生产中的剩余物，本发明利用该剩余物对甘露聚糖的酶解作用，提出了一种新的用途；
2、利用植物乳杆菌PC01对甘露糖的代谢与增殖能力，将丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物酶解棕榈粕释放的甘露糖进行转化，积累益生性的代谢产物，提高棕榈粕发酵后的价值；同时植物乳杆菌是同型发酵的乳酸菌，代谢产物主要是乳酸，不会产生太多挥发性的产物造成发酵过程的损耗，为棕榈粕发酵领域提供了一种新的组合方案。
保藏说明
所述丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)HZNDC-1从牛肠道分离得到，于2021年7月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：丁酸梭菌(Clostridium butyricum)HZNDC-1，保藏编号为：CCTCC：NO：M 2021874，地址：中国湖北武汉武汉大学。参见CN115094010 B。
所述植物乳杆菌PC01从泡菜分离得到，于2022年1月21日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)，保藏编号为：CCTCC：NO：M 2022106，地址：中国湖北武汉武汉大学。
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。
实施例1：丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物处理棕榈粕的效果
(1)丁酸梭菌代谢产物制备：
丁酸梭菌种子液培养基(RCM)：牛肉浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉3g/L，葡萄糖5g/L，可溶性淀粉1g/L，氯化钠5g/L，乙酸钠5g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8±0.1，115℃，30min灭菌备用。
丁酸梭菌发酵培养基：超微豆粕粉14g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉8g/L，棕榈粕20g/L，葡萄糖10g/L，可溶性淀粉8g/L，磷酸二氢钾1.3g/L，七水合硫酸镁1.2g/L，氯化钠1g/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L，pH 6.8±0.1，115℃，30min灭菌备用。
挑取一环丁酸梭菌HZNDC-1的纯化单菌落接种于RCM液体培养基中，置于37℃厌氧工作站中培养24h，制成种子液。将丁酸梭菌HZNDC-1的种子液按2％接种于丁酸梭菌发酵培养基中，在5L发酵罐中培养32～38h，控制温度恒定为37℃，pH恒定为6.5，转数120rpm，全程氮气保压。所述丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)HZNDC-1从牛肠道分离得到，于2021年7月13日送至中国典型培养物保藏中心保藏，分类命名为：丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)HZNDC-1，保藏编号为：CCTCC：NO：M 2021874，地址：中国湖北武汉武汉大学。参见CN 115094010 B。
发酵结束后，4000rpm离心10min收集上清液；加入10％(w/v)的麦芽糊精作为载体混合均匀，倒入冻干盘，使液面高度为1～2cm，然后置于-80℃预冻6h；将预冻好的发酵液转移至真空冷冻干燥机(北京松源，LGJ-30FD)，干燥36～60h，得到丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物冻干粉。
(2)丁酸梭菌代谢产物处理棕榈粕：
分别取1g、2g、3g、4g、5g丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物冻干粉充分溶于700g水中，依次与1kg棕榈粕(约12％含水量)混合均匀，制备成试样1～5。取样测得各试样的含水量约47％～50％。将不同添加比例的试样分别装入自封袋，置于37℃，处理5天。所有组别设置3个重复。
使用丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物处理后的棕榈粕指标如下表1所示：
表1丁酸梭菌代谢产物处理前后棕榈粕指标对比
| 中性洗涤纤维(％) | 还原糖(％) | |
| 棕榈粕原料 | 72.05 | 0.51 |
| 试样1 | 69.85 | 1.93 |
| 试样2 | 67.03 | 2.56 |
| 试样3 | 63.74 | 4.48 |
| 试样4 | 61.98 | 6.05 |
| 试样5 | 61.65 | 6.27 |
注：表中数据为折干之后取平均值。
由表1可知，丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物对棕榈粕的惰性纤维结构具有一定的降解作用。随着添加量的增加，中性洗涤纤维的含量相对原料下降越多，而还原糖的含量也得到更多的积累。其中试样4与试样5效果相当，优选的，选取试样4和试样5的浓度作为后续复方制剂设计的基础。
实施例2：不同乳酸菌对甘露糖的代谢产酸能力比较
使用以甘露糖作为唯一碳源的液体培养基对20株乳酸菌进行代谢能力评估。
乳酸菌活化培养基(MRS)：牛肉浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，吐温-80 1mL/L，磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸锰0.05g/L，pH 6.3±0.1，121℃，15min灭菌备用。
乳酸菌评估培养基：牛肉浸粉10g/L，蛋白胨10g/L，酵母浸粉5g/L，甘露糖20g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，吐温-80 1mL/L，磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，七水合硫酸锰0.05g/L，pH 6.3±0.1，121℃，15min灭菌备用。
将20株乳酸菌(包括植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、凝结芽孢杆菌、布氏乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、食淀粉乳杆菌、清酒乳杆菌、发酵乳杆菌、短乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、瑞士乳杆菌)从甘油管中转接至MRS培养基中，37℃静置培养24h；将活化菌液按1％接种量分别接入乳酸菌评估培养基中，37℃静置培养24h；同时设置不接菌的空白对照组，所有组别设置3个重复。测定pH、OD600、甘露糖、乳酸等数据。结果如下表2所示：
表2不同乳酸菌菌株对甘露糖代谢能力对比
注：表中数据为平均值。
由表2可知，不同乳酸菌对甘露糖的利用能力存在较大差异，其中编号18的菌株在所评估的20株乳酸菌中表现最优。而18号菌株为分离至泡菜的植物乳杆菌PC01，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022106。说明植物乳杆菌PC01能够在以甘露糖为唯一碳源的培养基上快速生长，将甘露糖转化为乳酸。
实施例3：丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物与植物乳杆菌PC01的不同复方制剂对棕榈粕发酵效果的影响
为了探究丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物与植物乳杆菌PC01的不同复方制剂对棕榈粕发酵效果的影响，设计下表对比试验：
表3丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物与植物乳杆菌PC01的不同复方制剂设计
注：植物乳杆菌PC01菌粉活菌数为1000亿cfu/g。
分别取10g复方制剂充分溶于700g水中，依次与1kg棕榈粕(约12％含水量)混合均匀，制备成试样1～6。其中复方制剂7～12实际的添加量根据复方制剂1～6中对应的对照组中的有效成分进行调整，使得添加在棕榈粕中的有效成分保持一致。取样测得各试样的含水量约47％～50％。将不同添加比例的试样分别装入自封袋，置于37℃，处理5天。所有组别设置3个重复。测定中性洗涤纤维、还原糖、乳酸等数据。结果如下表4所示：
表4棕榈粕发酵前后指标对比
注：表中数据为折干之后取平均值。
由表4可知，单独的丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物(试样10)能够很好破坏棕榈粕的惰性结够，使中性洗涤纤维从73.23％降至62.73％。单独的植物乳杆菌PC01(试样11)和单独的麸皮(试样12)对棕榈粕没有任何效果。两两搭配时，麸皮与丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物配合(试样8)或者麸皮与植物乳杆菌PC01配合(试样7)时，均未发现协同作用的产生，说明麸皮在配方中只是惰性载体。而丁酸梭菌HZNDC-1代谢产物与植物乳杆菌PC01配合(试样1～6及试样9)时，由中性洗涤纤维转化而来的还原糖进一步代谢为乳酸，并且最高能够将植物乳杆菌的生物量积累至1.1亿cfu/g干基，说明两者能够产生协同增效的作用。前者破坏惰性结构，提升营养价值；后者积累益生物质，增强功能价值。且在所试验的范围内，试样6的各项指标最优。
实施例4：棕榈粕发酵前后体外消化模拟对比
为了探究棕榈粕发酵前后干物质消化率，选择实施例3中的试样6和棕榈粕原料进行单胃动物仿生消化仪测定(湖南中本智能，SDSⅢ)。
检测方法：将样品粉碎过60目筛，称取1g样品，按照第三代单胃动物仿生消化系统操作规程(具体操作参照湖北中本智能提供设备操作手册)进行操作得到样品干物质消化率。
所述干物质消化率的计算公式为：干物质消化率＝(消化前样品干物质重-消化后样品干物质重)/消化前样品干物质重×100％。
结果如下表5所示：
表5棕榈粕发酵前后干物质消化率对比
| 棕榈粕原料 | 发酵棕榈粕 | 提升率(％) | |
| 干物质消化率，猪(％) | 31.27 | 41.48 | 32.65 |
| 干物质消化率，鸡(％) | 22.35 | 35.92 | 60.72 |
| 干物质消化率，鸭(％) | 23.63 | 36.46 | 54.30 |
由表5可知，发酵棕榈粕干物质消化率(猪)由31.27％提高至41.48％，干物质消化率(鸡)由22.35％提高至35.92％，干物质消化率(鸭)由23.63％提高至36.46％，提升率分别是32.65％、60.72％、54.30％，大幅改善了棕榈粕的消化水平。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)，其菌株号为PC01，其在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022106。
2.一种复方制剂，其特征在于，所述复方制剂含有权利要求1所述的植物乳杆菌和丁酸梭菌代谢产物，所述丁酸梭菌代谢产物来自丁酸梭菌的发酵液离心上清的冻干粉，所述丁酸梭菌的菌株保藏编号为：CCTCC NO：M 2021874。
3.根据权利要求2所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂还包含载体。
4.根据权利要求3所述的复方制剂，其特征在于，所述载体包括麸皮或米糠粕。
5.根据权利要求3所述的复方制剂，其特征在于，所述复方制剂包含重量份：丁酸梭菌代谢产物0.4～0.5份，植物乳杆菌0.05～0.15份，载体0.35～0.55份。
6.根据权利要求2-4任一所述的复方制剂，其特征在于，所述植物乳杆菌活菌数为50～150亿cfu/g。
7.权利要求2-6任一所述的复方制剂在棕榈粕发酵上的应用。
8.一种棕榈粕的发酵方法，其特征在于，所述发酵方法包括接种权利要求2-6任一所述的复方制剂的步骤。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在接种权利要求2-6任一所述的复方制剂后，控制水分45％～50％，温度35℃～40℃，进行静置发酵3～5天。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述发酵方法采用固态发酵。
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