CN109576204B - 一种使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，包括：步骤1、按重量份数分别准备以下原料：谷物膨化粉30～50份，酵母膏2～5份，红糖5～8份，中药添加剂；中药添加剂的重量份数为：W＝aW1+0.01W2+0.02W3；式中，a为重量调节参数，a＝0.01～0.03；其中，W1为谷物膨化份的重量份数，W2为酵母膏的重量份数；W3为红糖的重量份数；步骤2、把原料依次投入搅拌锅中，干搅拌30～40分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90～93％，搅拌60～80分钟，得到预处理益生菌培养基；将预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌25～30min，得到益生菌培养基；步骤3、将待培育的益生菌菌株经复苏扩大后制成种子液；步骤4、将种子液接种到益生菌培养基中进行增菌，调节增菌温度为37℃，增菌培养时间为18～24h。
Description
技术领域
本发明属于益生菌培养发酵技术领域，特别涉及一种使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法。
背景技术
益生菌是一类定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡，对人体健康有重要作用的活的微生物的总称，广泛应用于食品、保健品和药品生产中。研究发现，益生菌在人体肠道内的数量对益生菌发挥保健和治疗功效起到决定性作用，除了益生菌在体内增殖，在加工过程中和贮藏期间保证其存活和保持生物活性等因素外，足量的活菌数是益生菌补充剂产品发挥其有效性的必要前提。
植物性谷物原料为培养基，作为发酵底物，谷物不但可以为益生菌的生长提供必要的碳源和氮源、降低发酵成本；经过发酵后的谷物可以明显提高其营养价值和功能特性，发酵后产生的乳酸、乙酸乙酯、乙醛等芳香成分可改善谷物制品的风味和香气。谷物作为益生菌发酵基质可以为其提供生长必须营养物质，有效增殖益生菌，但这些谷物培养基在进行发酵培养之前均需进行复杂的预处理，包括去种皮、蒸煮、酶解等复杂处理工艺。谷物膨化粉是经高温、高压膨化制得，熟化过程中可以最大限度降低营养的损耗。经膨化产生的高温高压、高剪切力可以使谷物中的淀粉颗粒膨化并精华，打开淀粉分子连接，增加食糜颗粒的表面积、提高淀粉的消化吸收率；同时膨化使蛋白质肽链裂解为肽和氨基酸，大大提高蛋白质的吸收率。使用膨化谷物可以有效简化发酵工艺、缩短发酵周期，从而降低发酵成本。
同时，许多食物即药物，它们之间并无绝对的分界线，很多药食同源的中药材可以很好促进益生菌的活菌数量，将植物性谷物原料作为培养基的发酵底物，适当添加中药添加剂能够更好的提高益生菌的性质。
发明内容
本发明提供了一种使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，本发明的目的之一是通过在微生物培养基中添加中药添加剂，以提高最大活菌数。
本发明的目的之二是在在制备过程中通对种子接种液的接种比例和增菌培养时间进行精确控制，以进一步提高最大活菌数。
本发明提供的技术方案为：
一种使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，包括：
步骤1、按重量份数分别准备以下原料：
谷物膨化粉30～50份，酵母膏2～5份，红糖5～8份，中药添加剂；
所述中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3；
式中，a为重量调节参数，a＝0.01～0.03；其中，W1为谷物膨化份的重量份数，W2为酵母膏的重量份数；W3为红糖的重量份数；
步骤2、把所述原料投入搅拌锅中，干搅拌30～40分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90～93％，搅拌60～80分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌25～30min，得到益生菌培养基；
步骤3、将待培育的益生菌菌株经复苏扩大后制成种子液；
步骤4、将所述种子液接种到所述益生菌培养基中进行增菌，增菌温度为37℃，增菌培养时间为18～24h。
优选的是，所述谷物膨化粉的成分为：
粳米5～10份，大麦5～7份，玉米5～8份，燕麦3～5份，赤小豆5～8份，扁豆3～5份，黄豆5～10份，黑芝麻2～6份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实3～5份，茯苓2～4份，当归1～2份，山药6～8份，大枣3～5份，葛根2～2.5份，百合2～3份，核桃3～4份。
优选的是，在所述步骤4中，所述种子液的接种比例为：
式中，ψ0为经验接种比例；ω为培养基的含水率，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和。
优选的是，在所述步骤4中，控制增菌培养时间为：
式中，t0为经验增菌培养时间，tmax为增菌培养最大时间，tmin为增菌培养最小时间，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和；e为自然对数的底数。
优选的是，在所述步骤3中，所述种子液制备过程为：
将所述益生菌菌种以1％的体积比例加入到MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10％的体积比例将复苏菌液接种到所述MRS培养基中，37℃静止培养12小时。
优选的是，所述MRS培养基的组分及质量份数如下：
蛋白胨20份，牛肉膏10份，酵母膏5份，柠檬酸氢二铵4份，葡萄糖20份，吐温80 3.2份，乙酸钠5份，磷酸氢二钾2份，硫酸镁0.25份，硫酸锰0.05份，琼脂18份，蒸馏水1000份。
优选的是，在所述步骤2中，向原料中加水后搅拌速度为：
其中，n0为设定的基础搅拌速度，ω为培养基的含水率，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和。
本发明的有益效果是：
本发明提供的使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，通过在微生物培养基中添加中药添加剂，能够提高最大活菌数。
本发明提供的使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，在制备过程中通对种子接种液的接种比例和增菌培养时间进行精确控制，能够进一步提高最大活菌数。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
本发明提供了一种基于中药添加剂的复合益生菌培养基，其组成成分为：谷物膨化粉30～50份，酵母膏2～5份，红糖5～8份，中药添加剂和水；
其中，培养基的含水率为90％～93％；
所述中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3；
式中，a为重量调节参数，a＝0.01～0.03；其中，W1为谷物膨化份的重量份数，W2为酵母膏的重量份数；W3为红糖的重量份数；
所述谷物膨化粉的成分为：
粳米5～10份，大麦5～7份，玉米5～8份，燕麦3～5份，赤小豆5～8份，扁豆3～5份，黄豆5～10份，黑芝麻2～6份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实3～5份，茯苓2～4份，当归1～2份，山药6～8份，大枣3～5份，葛根2～2.5份，百合2～3份，核桃3～4份。
本发明还提供了一种基于中药添加剂的复合益生菌培养基的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、按重量份数分别称取如下原料：
谷物膨化粉30～50份，酵母膏2～5份，红糖5～8份，中药添加剂；
所述中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3；
式中，a为重量调节参数，a＝0.01～0.03；其中，W1为谷物膨化份的重量份数，W2为酵母膏的重量份数；W3为红糖的重量份数；
所述谷物膨化粉的成分为：
粳米5～10份，大麦5～7份，玉米5～8份，燕麦3～5份，赤小豆5～8份，扁豆3～5份，黄豆5～10份，黑芝麻2～6份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实3～5份，茯苓2～4份，当归1～2份，山药6～8份，大枣3～5份，葛根2～2.5份，百合2～3份，核桃3～4份。
步骤二、把所述原料依次投入搅拌锅中，干搅拌30～40分钟；
步骤三、向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90～93％，搅拌60～80分钟，得到预处理益生菌培养基；
步骤四、将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌25～30min。
本发明还提供了一种使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，其包括如下步骤：
步骤1、按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉30～50份，酵母膏2～5份，红糖5～8份，中药添加剂；
所述中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3；
式中，a为重量调节参数，a＝0.01～0.03；其中，W1为谷物膨化份的重量份数，W2为酵母膏的重量份数；W3为红糖的重量份数；
所述谷物膨化粉的成分为：
粳米5～10份，大麦5～7份，玉米5～8份，燕麦3～5份，赤小豆5～8份，扁豆3～5份，黄豆5～10份，黑芝麻2～6份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实3～5份，茯苓2～4份，当归1～2份，山药6～8份，大枣3～5份，葛根2～2.5份，百合2～3份，核桃3～4份。
步骤2、配制培养基
把所述原料依次投入搅拌锅中，干搅拌30～40分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90～93％，搅拌60～80分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌25～30min后，培养基制备完成。
步骤3、益生菌种子液的制备
将保存的益生菌菌株，经复苏扩大后制成种子液，将鼠李糖乳杆菌种以1％(v/v)的比例加入到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10％(v/v)的比例将复苏菌液接种到改良MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行益生菌菌种子液的制备。
其中，所述的改良MRS培养基的配方如表1所示；
表1改良MRS培养基
所述的改良乳酸菌培养基(改良MRS)配置好后于115℃、0.1Mpa下灭菌30min，灭菌后自然冷却后，可用于进行种子液的制备。
步骤4、益生菌的增菌培养
将步骤3中得到的益生菌种子液接种到步骤2得到的培养基中进行增菌，增菌培养温度为37℃。
在另一种实施例中，益生菌菌株为植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、粪肠球菌、唾液乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或发酵乳杆菌。
在另一实施例中，所述谷物膨化粉的目粒度为80～100目。
在另一实施例中，设定重量调节参数为：
其中，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和。
在另一实施例中，种子液加至增菌培养基的接种比例为3％(体积比)，增菌培养时间为18～24h。
在另一实施例中，设定培养基原料干搅拌的搅拌速度为：30～50r/min。
加水后搅拌速度为：
其中，n0为设定的基础搅拌速度，n0＝200r/min；ω为培养基的含水率，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和。
在另一实施例中，所述去离子水的温度为20～30℃。
在另一实施例中，种子液接种比例为：
式中，ψ0为经验接种比例，ψ0＝3％；ω为培养基的含水率，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和。
在另一实施例中，增菌培养时间为：
式中，t0为经验增菌培养时间，tmax为增菌培养最大时间，tmin为增菌培养最小时间，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和；e为自然对数的底数。
实施例1
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉30份，酵母膏2份，红糖5份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米5份，大麦5份，玉米5份，燕麦3份，赤小豆5份，扁豆3份，黄豆5份，黑芝麻2份；
中药添加剂的成分为：
芡实3份，茯苓2份，当归1份，山药6份，大枣3份，葛根2份，百合2份，核桃3份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.42；
式中，a取值为0.01。
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
实施例2
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8份，山药7份，大枣4份，葛根2.3，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.56；
式中，a取值为0.01。
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
实施例3
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉50份，酵母膏5份，红糖8份，中药添加剂；
粳米10份，大麦7份，玉米8份，燕麦5份，赤小豆8份，扁豆5份，黄豆10份，黑芝麻6份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实5份，茯苓4份，当归2，山药8份，大枣5份，葛根2.5份，百合3份，核桃4份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.71；
式中，a取值为0.01。
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
实施例4
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝1.66；
式中，a取值为0.03。
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
实施例5
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.92；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
对比例1
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝1.76；
a取值为0.04。
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
对比例2
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.36
a取值为0.005。
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
对比例3
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.92；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为200r/min。
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
对比例4
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.92；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为150r/min。
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
对比例5
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.92；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为3.2％。
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
对比例6
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.92；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为2.5％。
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
对比例7
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.92；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为：
增菌培养时间为26h。
对比例8
按重量份数分别准备基于中药添加剂的复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份，中药添加剂；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实4份，茯苓3份，当归1.8，山药7份，大枣4份，葛根2.3份，百合2.5份，核桃3.5份。
中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3＝0.92；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为2.5％。
增菌培养时间为16h。
对比例9
按重量份数分别准备复合益生菌培养基的原料：
谷物膨化粉40份，酵母膏4份，红糖6份；
谷物膨化粉的成分为：
粳米8份，大麦6份，玉米6份，燕麦4份，赤小豆6份，扁豆4份，黄豆8份，黑芝麻5份；
把上述原料依次投入搅拌锅中，设定搅拌锅的搅拌速度为40r/min，干搅拌30分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90％，搅拌70分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌30min。
其中，加水后搅拌速度为：
采用鼠李糖乳杆菌进行制备种子液；
种子液加至增菌培养基的接种比例为3.2％。
增菌培养时间为：
式中，t0取值为20h，tmax＝24h，tmin＝18h。
试验例
对实施例1～5和对比例1～9进行活菌数测定，采用流式细胞仪计数法测定发酵液中益生菌菌数，获得增菌培养基中益生菌的活菌数与死菌数。流式细胞仪计数法的具体操作如下所述：
步骤1、样品准备，将取出的发酵液进行适当的稀释，使待检测菌液样品中活菌数的数量范围在5.5×105～6.5×105CFU/mL。稀释后的发酵液样品经300目纱网过滤，取稀释后的待检样品200μL加入到1.5mL的EP管中，于37℃恒温培养箱温浴3分钟；
步骤2、样品染色，待检样品200μL中加入2μL 100×Sybr Green I和2μL 100×PI，37℃避光染色10分钟。Sybr Green I和PI(Propidium Iodide)是两种常见的DNA荧光染料。Sybr Green I能穿透活细胞和死细胞的细胞膜，而PI不能很好地穿透活细胞的细胞膜。利用Sybr Green I和PI染色细菌，可将细菌分为三群：Sybr Green I(+)PI(-)的活细菌，SybrGreen I(+)PI(+)的死细菌，以及处于两群之间的损伤细菌；
步骤3、C6Accuri绝对计数，C6Accuri流式细胞仪分析样品，阈值设为FSC-H大于10000，流速选择慢速，采样量设置为60μL，进行绝对计数检测；
步骤4、以FL1-H为横坐标，FL2-A为纵坐标，画细胞密度图。通过分析水样密度图、菌液以及加热后的菌液，根据这些样品的细胞分群，圈设门计数；
实验结果如表2所示，经过本发明处理后的培养基进行活菌实验，实施例1～5的最大活菌数均在5.3×108CFU/mL以上，实施例5中最大活菌数可达到6.0×108CFU/mL，与未添加中药添加剂的培养基(对比例9)相比有了显著提高，同时与中药添加剂份数超过设定范围(对比例1)，中药添加剂份数低于设定范围(对比例2)，加水后搅拌速度未根据原料质量份数精确化处理的培养基(对比例3、4)，种子液接种比例未根据原料质量份数精确化处理的培养基(对比例5、6)和增菌培养时间未根据原料质量份数精确化处理的培养基(对比例7、8)均有明显的提高。此外，实施例5中精确控制中药添加剂的量，相比其他实施例(在设定范围内任意确定添加中药添加剂份数)最大活菌数更高。
表2最大活菌数
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。
Claims (4)
1.一种使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、按重量份数分别准备以下原料：
谷物膨化粉30～50份，酵母膏2～5份，红糖5～8份，中药添加剂；
所述中药添加剂的重量份数为：
W＝aW1+0.01W2+0.02W3；
式中，a为重量调节参数，a＝0.01～0.03；其中，W1为谷物膨化份的重量份数，W2为酵母膏的重量份数；W3为红糖的重量份数；
所述谷物膨化粉的成分为：
粳米5～10份，大麦5～7份，玉米5～8份，燕麦3～5份，赤小豆5～8份，扁豆3～5份，黄豆5～10份，黑芝麻2～6份；
所述中药添加剂的成分为：
芡实3～5份，茯苓2～4份，当归1～2份，山药6～8份，大枣3～5份，葛根2～2.5份，百合2～3份，核桃3～4份；
步骤2、把所述原料投入搅拌锅中，干搅拌30～40分钟；向搅拌后的原料中加入去离子水，加水后培养基含水率控制在90～93％，搅拌60～80分钟，得到预处理益生菌培养基；将所述预处理益生菌培养基在115℃、0.1Mpa条件下灭菌25～30min，得到益生菌培养基；
步骤3、将待培育的益生菌菌株经复苏扩大后制成种子液；
步骤4、将所述种子液接种到所述益生菌培养基中进行增菌，增菌温度为37℃，增菌培养时间为18～24h；
在所述步骤4中，所述种子液的接种比例为：
式中，ψ0为经验接种比例；ω为培养基的含水率，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和；
在所述步骤4中，控制增菌培养时间为：
式中，t0为经验增菌培养时间，tmax为增菌培养最大时间，tmin为增菌培养最小时间，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和；e为自然对数的底数。
2.根据权利要求1所述的使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，其特征在于，在所述步骤3中，所述种子液制备过程为：
将所述益生菌菌种以1％的体积比例加入到MRS培养基中，37℃静止培养12小时进行菌种的复苏；按10％的体积比例将复苏菌液接种到所述MRS培养基中，37℃静止培养12小时。
3.根据权利要求2所述的使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，其特征在于，所述MRS培养基的组分及质量份数如下：
蛋白胨20份，牛肉膏10份，酵母膏5份，柠檬酸氢二铵4份，葡萄糖20份，吐温80 3.2份，乙酸钠5份，磷酸氢二钾2份，硫酸镁0.25份，硫酸锰0.05份，琼脂18份，蒸馏水1000份。
4.根据权利要求3所述的使用中药添加剂的混合益生菌的制备方法，其特征在于，在所述步骤2中，向原料中加水后搅拌速度为：
其中，n0为设定的基础搅拌速度，ω为培养基的含水率，WJ为粳米和大麦的重量份数之和，Wc为玉米和燕麦的重量份数之和；WZ为黄豆和黑芝麻的重量份数之和，WD为赤小豆和扁豆的重量份数之和。
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