CN107475116A - 一种乳酸菌耐盐保护剂及其制备和使用方法 - Google Patents

一种乳酸菌耐盐保护剂及其制备和使用方法 Download PDF

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刘鑫
鲁来政
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Abstract

本发明提供一种乳酸菌耐盐保护剂及其制备和使用方法，用于解决现有技术中不同种乳酸菌菌种耐盐环境保护问题。耐盐保护剂直接来源于经梯度低温冷冻预处理或梯度高盐预处理后的相应乳酸菌细胞，分别经细胞破碎处理直接获得；原料易得，制备工艺简单，成本较低，耐盐保护效果好，具有较强的工业化实施性。

Description

一种乳酸菌耐盐保护剂及其制备和使用方法
技术领域
本发明涉及微生物保存技术领域，具体地，涉及一种乳酸菌耐盐保护剂及其制备和使用方法。
背景技术
乳酸菌是食品工业中一种重要的微生物，广泛应用于发酵食品，如肉制品、酱油及泡菜发酵等。在这些食品加工过程中，高盐浓度是乳酸菌在发酵过程中遇到的一个主要环境因素。高盐浓度胁迫会触发乳酸菌细胞内水分外流，细胞胞质分离，引起细胞结构和生理上的损伤，导致细胞停止生长，甚至死亡，无法达到发酵食品工业生产中所需的菌量，对乳酸菌发酵制品的品质和风味产生严重影响。同时乳酸菌发酵食品以及医用口服乳酸菌制品进入消化道过程中也会遇到盐胁迫条件，影响乳酸菌生理活性，限制了乳酸菌更广泛的应用。
因此，通过乳酸菌耐盐保护物质筛选研究，提高乳酸菌在高盐环境下的生存、生长和代谢能力，对于乳酸菌在发酵食品工业及相关领域应用都有重要价值。
目前已经报道的具有乳酸菌耐盐保护作用的物质有甜菜碱、氨基酸类、海藻糖、胆碱类物质、脱脂乳等，多为外源性物质；目前还没有不同胁迫预处理后乳酸菌细胞内源性物质对菌种盐胁迫保护作用的相关报道。甜菜碱作为乳酸菌的一种主要的相容性溶质，在微生物处于盐胁迫条件下，会在细胞内大量积累，可以通过调节渗透压，稳定酶构象、帮助多肽分子进行正确的折叠等机制对盐胁迫下的乳酸菌进行保护。胆碱类物质主要通过在有氧条件下转变为甜菜碱发挥作用，并且胆碱~甜菜碱路径仅在高渗透压条件下被激活。在盐胁迫条件下，乳酸菌细胞也会表达一些应激蛋白，如编码普遍应激反应蛋白(GSPs)、热激蛋白(HSPs)和盐胁迫蛋白(SSPs)等，此外一些小分子代谢物质还可作为信号分子激活与逆境适应相关的多种响应，特别是诱导抗性基因的表达，以维持乳酸菌在盐胁迫条件下的正常生长和繁殖。这些物质一经细胞破碎释放后也可能会对盐胁迫条件下的乳酸菌生长有保护作用。
此外，由于不同种乳酸菌细胞的特异性、不同种保护剂理化性质的不同及细胞和保护剂相互作用的复杂性，传统的寻找外源性耐盐保护剂工作量大，方法繁琐，且成本花费高。基于乳酸菌内源性耐盐保护剂的筛选具有特殊优势。
发明内容
解决上述问题所采用的技术方案是一种基于乳酸菌内源性耐盐保护剂及其制备和使用方法。
本发明提供的一种耐盐保护剂的制备方法，包括以下步骤：
将培养至对数期的菌体进行梯度降温处理或梯度高盐培养处理；
将菌体进行洗涤离心处理,收集菌体；
将菌体破碎；
离心收集上清液，并进行膜过滤除菌处理，获得耐盐保护剂。
优选的，所述的梯度降温处理包括在31℃~0、0~-45℃、-45~-80℃，每个温度梯度下处理0.5~5h。
优选的，所述的梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、3%NaCl、4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养2~6h、18~24h、60~70h。
优选的，所述将菌体进行洗涤离心处理，收集菌体包括：将菌体在转速为6000rpm，离心时间为10~20min，温度为0~6℃下进行离心；
用缓冲液洗涤，缓冲液为摩尔浓度0.075M的PBS溶液，其中, 菌体的质量和缓冲液的体积配比为1g：（30~50）ml；洗涤两次，弃上清，收集菌体。
优选的，所述将菌体破碎包括：采用超声破碎，破碎条件为：功率为300~350w，超声5s，停止5s，共超声30min~60min。
优选的，所述离心收集上清液，并进行膜过滤除菌处理，获得耐盐保护剂包括：离心条件为10000~15000rpm，时间为10~20min，温度为4℃；膜过滤孔径为0.22μm。
优选的，所述菌体为乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌中的任意一种。
本发明的目的还在于提供一种耐盐保护剂，是采用上述耐盐保护剂的制备方法制备的。
本发明的目的还在于提供一种耐盐保护剂的使用方法，包括以下步骤：发酵起始时，接种入乳酸菌后，同时将耐盐保护剂溶液添加到菌体发酵液中；其中，耐盐保护剂溶液与菌体发酵液的体积比为1:（15~25）。
优选的，所述的菌体发酵液为高盐浓度条件下生长的菌体发酵液。
本发明提供一种经梯度降温处理或经过梯度高盐培养处理后的乳酸菌细胞破碎物作为其自身和其它乳酸菌菌种耐盐保护剂的方法。虽然冷刺激和盐胁迫对乳酸菌造成了损伤,但梯度降温预处理和梯度高盐预处理可使乳酸菌细胞诱导产生一系列胁迫应答反应，激活参与到胞内各种代谢途径的各种蛋白酶类，如糖酵解及丙酮酸代谢途径、糖类代谢途径、肽聚糖及嘌呤合成代谢途径、转录水平、转录后修饰水平及胁迫相关蛋白酶类，能够部分甚至完全恢复细胞的正常生理结构功能，从而使微生物获得耐盐特性。这类保护剂直接来源于经低温梯度或高盐梯度预处理后的相应乳酸菌细胞，经超声破碎处理直接获得；原料易得，制备工艺简单，成本低，耐盐保护效果好，具有较强的工业化实施性。
附图说明
图1为本发明的实施例1-18中制备乳酸菌耐盐保护剂的工艺流程图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
本发明提供了该类耐盐保护剂的制备及使用方法，包括如下步骤：
（a）对培养至对数期的乳酸菌分别进行梯度降温或梯度高盐培养预处理；其中所述的乳酸菌包括选自下组的至少一种：乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌；培养条件为：温度31℃，时间12~36h。应当理解的是，上述菌种的培养方式可以采用现有的培养技术，目的是需要将菌种培养至对数期。
乳酸菌梯度冷冻预处理的条件为：梯度降温处理为0~31℃、0~-45℃、-45~-80℃，每个温度梯度下冷冻处理0.5~5h。
乳酸菌梯度高盐培养处理条件为：2%NaCl、 3%NaCl、4%NaCl每个盐浓度下依次培养2~6h、18~24h、60~70h。
（b）离心分别收集冷冻预处理或梯度高盐培养后的乳酸菌菌体，并加入一定配比的缓冲液进行反复洗涤；收集菌体离心条件为6000rpm，时间为10~20min，温度为4℃；洗涤所用缓冲液为0.075M的PBS缓冲溶液，配比为1g菌体：（30~50）ml缓冲液，洗涤3次。
（c）对洗涤后的乳酸菌细胞进行超声破碎；细胞超声破碎条件为：功率300~350w，超声5s，停止5s，共超声30min~60min直至悬液澄清。
（d）离心收集超声破碎后的上清液，进行膜过滤除菌；离心条件为10000~15000rpm，时间为10~20min，温度为4℃；膜过滤孔径为0.22μm。
（e）在对乳酸菌接种时，同时取5ml（d）中用一种预处理方法得到的产品溶液，添加到该100ml的乳酸菌发酵液中（保护剂与乳酸菌发酵液的体积配比为1:100以上均可，在此范围内均具有保护效果），乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌培养基的配方均采用含有4%NaCl的MRS培养基，培养温度31℃，初始pH7.4。
同时设置三个对照组：
对照组1 取5ml的0.075M的PBS缓冲液，接种时添加到发酵液中，作为不添加保护剂组；
对照组2 取正常组细胞，不作任何处理（不经梯度降温冷冻处理或不经梯度高盐培养处理），按照上述步骤提取其胞内物质，验证其胞内物质有无耐盐保护作用；
对照组3 取无菌的5%的海藻糖溶液，接种时添加到发酵液中。
（f）从实验组和对照组样品中各取0.5ml样液，取样时间均为加入保护剂培养24h后，取样后加入4.5ml生理盐水，依次进行梯度稀释，稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8，取合适的稀释梯度进行涂平板，每个梯度三次重复，计活菌数，与对照组比较，考察保护剂的保护效果。
下面通过培养不同的乳酸菌种，制备相应的耐盐保护剂，然后将该耐盐保护剂应用于自身或用于其它种类的乳酸菌作为耐盐保护剂。
表1不同实施例中保护剂对乳酸菌高盐条件下生长情况的影响（lg CFU）
实施例1~实施例3为提取冷冻预处理后乳酸乳球菌的胞内物质作为耐盐保护剂，保护其自身及其它2种乳酸菌在高盐条件下生长的实验例。
实施例1
如表1所示，按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为8℃、-16℃、-67℃、依次各处理5h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声60min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为10000rpm，时间为20min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸乳球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU(Colony-Forming Units)值在8.77左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为7.68；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.69，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的乳酸乳球菌细胞破碎物对乳酸乳球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例2
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-18℃、-76℃、依次各处理2.5h；6000rpm、4℃离心10min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:40；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声30min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12500rpm，时间为15min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸片球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在8.95左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为6.98；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.95，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的乳酸乳球菌细胞破碎物对乳酸片球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例3
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为2℃、-25℃、-62℃、依次各处理1.5h；6000rpm、4℃离心15min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:30；然后进行超声破碎，功率350w，超声5s，停止5s，共超声40min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为15000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对植物乳杆菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在8.74左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为7.51；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.78，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的乳酸乳球菌细胞破碎物对植物乳杆菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例4~实施例6为提取冷冻预处理后乳酸片球菌的胞内物质作为耐盐保护剂，保护其自身及其它2种乳酸菌在高盐条件下生长的实验例。
实施例4
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸片球菌31℃培养24h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为31℃、0℃、-40℃、依次各处理5h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率320w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸乳球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在8.63左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为7.54；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.34，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的乳酸片球菌细胞破碎物对乳酸乳球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例5
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸片球菌31℃培养24h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为5℃、-45℃、-80℃、依次各处理0.5h；6000rpm、4℃离心10min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率350w，超声5s，停止5s，共超声40min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为15000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸片球菌其自身在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在9.05左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为7.18；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.93，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的乳酸片球菌细胞破碎物对乳酸片球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例6
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸片球菌31℃培养24h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为5℃、-20℃、-72℃、依次各处理1.5h；6000rpm、4℃离心15min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:30；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为10000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对植物乳杆菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在8.53左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为7.42；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.58，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的乳酸片球菌细胞破碎物对植物乳杆菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例7~实施例9为提取冷冻预处理后的植物乳杆菌的胞内物质作为耐盐保护剂，保护其自身及其它2种乳酸菌在高盐条件下生长的实验例。
实施例7
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备植物乳杆菌菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，植物乳杆菌31℃培养36h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-18℃、-76℃、依次各处理2h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:40；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为15min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸乳球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在9.04左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为8.66；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.84，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的植物乳杆菌细胞破碎物对乳酸乳球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例8
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备植物乳杆菌菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，植物乳杆菌31℃培养36h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-18℃、-76℃，依次各处理3h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率320w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸片球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在8.94左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为7.71；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为8.08，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的植物乳杆菌细胞破碎物对乳酸片球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例9
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备植物乳杆菌菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，植物乳杆菌31℃培养36h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-18℃、-76℃，依次各处理3h；6000rpm、离心20min,4℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率320w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对植物乳杆菌其自身在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入冷冻预处理细胞破碎物的实验组在盐胁迫条件下培养满24h时，lg CFU值在8.93左右；而加入未进行胁迫预处理细胞破碎物的正常组仅为8.74；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.54，也低于实验组。因此，可以判定冷冻预处理后的植物乳杆菌细胞破碎物对植物乳杆菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例10~实施例12为提取梯度高盐培养预处理后的乳酸乳球菌的胞内物质作为耐盐保护剂，保护其自身及其它2种乳酸菌在高盐条件下生长的实验例。
实施例10
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养2h、24h、64h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率320w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为10000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸乳球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.66；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在7.68左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组的lg CFU值为7.69，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的乳酸乳球菌细胞破碎物对乳酸乳球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例11
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养4h、20h、66h；6000rpm、4℃离心10min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:40；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声40min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为15min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸片球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.86；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在6.98左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组的lg CFU值为7.95，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的乳酸乳球菌细胞破碎物对乳酸片球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例12
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养6h、24h、60h；6000rpm、4℃离心10min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:30；然后进行超声破碎，功率350w，超声5s，停止5s，共超声30min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为15000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对植物乳杆菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.68；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在7.51左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组的lg CFU值为7.78，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的乳酸乳球菌细胞破碎物对植物乳杆菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例13~实施例15为提取梯度高盐培养预处理后的乳酸片球菌的胞内物质作为耐盐保护剂保护其自身及其它2种乳酸菌在高盐条件下生长的实验例。
实施例13
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸片球菌31℃培养24h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养4h、16h、70h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声60min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为20min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸乳球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.44；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在8.54左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组的lg CFU值为7.34，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的乳酸片球菌细胞破碎物对乳酸乳球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例14
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸片球菌31℃培养24h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养4h、20h、66h；6000rpm、4℃离心10min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:40；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸片球菌自身在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时液体培养基中lg CFU值为9.77；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在7.08左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组的lg CFU值为8.05，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的乳酸片球菌细胞破碎物对乳酸片球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例15
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，乳酸片球菌31℃培养24h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养3h、18h、69h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率320w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对植物乳杆菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.88；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在7.71左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组的lg CFU值为7.96，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的乳酸片球菌细胞破碎物对植物乳杆菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例16~实施例18为提取梯度高盐培养预处理后的植物乳杆菌的胞内物质作为耐盐保护剂保护其自身及其它2种乳酸菌在高盐条件下生长的实验例。
实施例16
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备植物乳杆菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，植物乳杆菌31℃培养36h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养4h、20h、66h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率350w，超声5s，停止5s，共超声60min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为10000rpm，时间为20min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸乳球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.61；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在8.75左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.52，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的植物乳杆菌细胞破碎物对乳酸乳球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例17
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备植物乳杆菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，植物乳杆菌31℃培养36h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养2h、24h、64h；6000rpm、4℃离心20min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率320w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对乳酸片球菌在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.63；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在6.62左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.74，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的植物乳杆菌细胞破碎物对乳酸片球菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
实施例18
按乳酸菌耐盐保护剂制备流程制备植物乳杆菌胞内物质作为耐盐保护剂。具体地，植物乳杆菌31℃培养36h后，梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、 3%NaCl、 4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养4h、20h、66h；6000rpm、4℃离心10min，收集菌体，菌体用技术方案步骤（b）中PBS缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率350w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为12000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液用0.22μm的微孔过滤膜除菌，收集产品溶液，得到耐盐保护剂；然后验证保护剂对植物乳杆菌自身在高盐条件下生长的保护作用，验证方法类似步骤（e）（f）。
加入梯度高盐胁迫预处理后的细胞破碎物的实验组在培养满24h时，液体培养基中lg CFU值为9.41；而加入未进行任何胁迫预处理的细胞破碎物的正常组在7.33左右；且加入5%海藻糖的阳性对照组lg CFU值为7.58，也低于实验组。因此，可以判定梯度高盐预处理后的植物乳杆菌细胞破碎物对植物乳杆菌在盐胁迫条件下的生长有保护作用。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种乳酸菌耐盐保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将培养至对数期的菌体进行梯度降温或梯度高盐培养处理；
将菌体进行洗涤离心处理，收集菌体；
将菌体破碎；
离心收集上清液，并进行膜过滤除菌，获得耐盐保护剂。
2.如权利要求1所述的耐盐保护剂的制备方法，其特征在于，所述的梯度降温处理包括在31℃~0、0~-45℃、-45~-80℃，每个温度梯度下处理0.5~5h。
3.如权利要求1所述的耐盐保护剂的制备方法，其特征在于，所述的梯度高盐培养处理包括在2%NaCl、3%NaCl、4%NaCl每个盐浓度梯度下依次培养2~6h、18~24h、60~70h。
4.如权利要求1所述的耐盐保护剂的制备方法，其特征在于，所述将菌体进行洗涤离心处理，收集菌体包括：
将菌体在转速为6000rpm，温度为0~6℃下进行离心10~20min；
菌体用缓冲液洗涤，缓冲液为摩尔浓度0.075M的PBS缓冲溶液，其中, 菌体的质量和缓冲液的体积配比为1g：（30~50）ml；洗涤两次，弃上清，收集菌体。
5.如权利要求1所述的耐盐保护剂的制备方法，其特征在于，所述将菌体破碎包括：
菌体重悬于60ml的0.075M PBS缓冲液中，采用超声破碎，破碎条件为：功率为300~350w，超声5s，停止5s，共超声30~60min。
6.如权利要求1所述的耐盐保护剂的制备方法，其特征在于，所述离心收集上清液，并进行膜过滤除菌处理，获得耐盐保护剂包括：
离心条件为10000~15000rpm，温度为4℃，时间为10~20min；膜过滤孔径为0.22μm。
7.如权利要求1~6任一所述的耐盐保护剂的制备方法，其特征在于，所述菌体为乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌中的任一一种。
8.一种耐盐保护剂，其特征在于，是采用如权利要求1~7任一所述的耐盐保护剂的制备方法制备的。
9.一种耐盐保护剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
发酵起始时，接种入乳酸菌后，同时将耐盐保护剂溶液添加到菌体发酵液中，其中，耐盐保护剂溶液与菌体发酵液的体积比为1:（15~25）。
10.如权利要求9所述的耐盐保护剂的使用方法，其特征在于，所述的菌体发酵液为生长在高盐浓度条件下的菌体发酵液。
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