CN106754374A - 一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法 - Google Patents

一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106754374A
CN106754374A CN201611036699.2A CN201611036699A CN106754374A CN 106754374 A CN106754374 A CN 106754374A CN 201611036699 A CN201611036699 A CN 201611036699A CN 106754374 A CN106754374 A CN 106754374A
Authority
CN
China
Prior art keywords
protective agent
thalline
cryoprotector
freeze
intracellular
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201611036699.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106754374B (zh
Inventor
鲁吉珂
林松洋
刘鑫
康巧珍
郝利民
鲁来政
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute Of Quartermaster Engineering Technology Academy Of Systems Engineering Academy Of Military Sciences
Zhengzhou University
Original Assignee
Zhengzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhengzhou University filed Critical Zhengzhou University
Priority to CN201611036699.2A priority Critical patent/CN106754374B/zh
Publication of CN106754374A publication Critical patent/CN106754374A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106754374B publication Critical patent/CN106754374B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种冻干保护剂及其制备方法，使用方法，用于解决现有技术中不同种乳酸菌菌种冻干保护剂的制备问题。本发明提供的一种冻干保护剂及其制备方法，使用方法，冻干保护剂直接来源于经低温冷冻预处理后的相应乳酸菌细胞，经细胞破碎处理直接获得；原料易得，制备工艺简单，成本花费低，冷冻保护效果好，具有较强的工业化实施性。

Description

一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法
技术领域
本发明涉及微生物保存技术领域，具体地，涉及一种冻干保护剂及其制备方法，使用方法。
背景技术
乳酸菌是食品工业中一种重要的微生物，广泛应用于乳制品及肉制品发酵。为便于生产，高活力菌种常用冷冻干燥方法保存，其中冻干技术及相关冷冻保护剂开发非常关键。
但因目前国内真空冷冻干燥微生物的技术还不够完善，冻干产品的活菌数还不够高，冷冻干燥技术还处于发展阶段。乳酸菌若直接进行冷冻干燥，死亡率将达90％以上，因此选择合适的冻干保护剂至关重要。
冻干保护剂的保护作用与它们的化学结构有密切关系,其特征是具备三个以上的氢键或一些离子基团,它们能够取代水与细菌蛋白质结合,保证了蛋白质的稳定性,防止冻干时胞内胞外冰晶的形成。保护剂的持水性可使冻干过程中细胞的水分不至于急剧下降,而使细胞蛋白质结构免遭破坏,保护剂能将菌体包裹其中,减少菌体与氧接触,降低细胞代谢,选择保护剂的技术是制备冷冻干燥浓缩发酵剂的一项关键技术。
但由于不同种乳酸菌细胞的特异性、不同种保护剂的理化性质的特异性及二者相互作用的复杂性，单一保护剂单独使用并不能满足菌体抵抗外界恶劣条件的要求，而复配保护剂虽然保护效果较明显但是筛选工作量极大，且同种复配型保护剂针对不同种乳酸菌保护效果也会不同，这又从另一方面增加了寻找冷冻保护剂的复杂程度，传统的寻找外源性冷冻保护剂工作量大，方法繁琐，且成本花费高。
发明内容
解决上述问题所采用的技术方案是一种冻干保护剂及其制备方法，使用方法。
本发明提供的一种冷冻保护剂的制备方法，包括以下步骤：
将培养至对数期的菌体进行阶梯降温处理；
将菌体进行洗涤离心处理,收集菌体；
将菌体破碎；
离心收集上清液，并进行冻干处理，获得冷冻保护剂。
优选的，所述的梯度降温处理包括在31℃-0、0--45℃、-45--80℃，每个温度梯度下冷冻处理0.5-5h。
优选的，所述将菌体进行洗涤离心处理,收集菌体包括:
将菌体在转速为5000rpm，离心时间为10-20min，温度为0-6℃下进行离心；
用缓冲液洗涤，缓冲液为摩尔浓度0.05M的pH为6.63的Tris-HCl溶液，其中,菌体的质量和缓冲液的体积配比为1g：(30-50)ml。
优选的，所述将菌体破碎包括:
采用超声破碎,破碎条件为:功率为300-350w，超声5s，停止5s，共超声30min-60min。
优选的，所述离心收集上清液，并进行冻干处理，获得冷冻保护剂包括:
离心条件为6000-20000rpm，时间为10-20min，温度为4℃。
优选的，所述菌体为嗜热链球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种中的任一一种。
本发明的目的还在于提供一种冻干保护剂，是采用上述冷冻保护剂的制备方法制备的。
本发明的目的还在于提供一种冻干保护剂的使用方法，包括以下步骤：
用缓冲液将冻干保护剂稀释，至蛋白浓度为5-10μg/μl，获得冻干保护剂溶液；
将冻干保护剂溶液与菌体发酵液进行混合冻干，其中，冻干保护剂溶液与菌体发酵液的体积比为1:(4-10)。
优选的，所述的菌体发酵液为对数期的菌体发酵液。
本发明提供一种经预冻处理乳酸菌的细胞破碎物作为其自身和其它乳酸菌菌种冷冻保护剂的方法。虽然冷刺激对乳酸菌造成了损伤,但低温预处理却可以使乳酸菌细胞诱导产生一系列胁迫应答反应，尤其是参与到胞内各种代谢途径的各种蛋白酶类，如糖酵解及丙酮酸代谢途径、糖类代谢途径、肽聚糖及嘌呤合成代谢途径、转录水平、转录后修饰水平及胁迫相关蛋白酶类，能够部分甚至完全恢复细胞的正常生理结构功能，从而使细胞获得抗冻特性。由低温预处理下这些代谢途径产生的一些直接或间接参与恢复细胞的正常生理结构功能的一些物质，如糖和糖醇类、氨基酸类、肽和蛋白质类，同时可以直接用作冷冻保护剂，或被细胞吸收用以维持细胞正常渗透压，或在细胞外形成保护层，是一种很好的复配型保护剂，能够有效的增加冻干后的存活率。这类保护剂直接来源于经低温冷冻预处理后的相应乳酸菌细胞，经超声破碎处理直接获得；原料易得，制备工艺简单，成本花费低，冷冻保护效果好，具有较强的工业化实施性。
附图说明
图1为本发明的实施例1-22中制备冻干保护剂的工艺流程图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细描述。
本发明提供了该类冷冻保护剂的制备及使用方法，包括如下步骤：
(a)对培养至对数期的乳酸菌进行冷冻预处理；其中所述的乳酸菌包括选自下组的至少一种：乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种；培养条件为：温度31-37℃，时间12-36h。应当理解的是,上述菌种的培养方式可以采用现有的培养技术,目的是需要将菌种培养至对数期。
乳酸菌冷冻预处理的条件为：梯度降温处理为0-31℃、0--45℃、-45--80℃，每个温度梯度下冷冻处理0.5-5h。
(b)离心收集冷冻预处理后的乳酸菌菌体，并加入一定配比的缓冲液进行反复洗涤；收集菌体离心条件为5000rpm，时间为10-20min，温度为4℃；洗涤所用缓冲液为摩尔浓度0.05M的pH为6.63的Tris-HCl溶液，配比为1g菌体：(30-50)ml缓冲液，洗涤3次。
(c)对洗涤后的乳酸菌细胞进行超声破碎；细胞超声破碎条件为：功率300-350w，超声5s，停止5s，共超声30min-60min直至悬液澄清。
(d)离心收集超声破碎后的上清液，进行真空冷冻干燥；离心条件为6000-20000rpm，时间为10-20min，温度为4℃。
(e)冻干结束后收集产品，即为用于冷冻干燥该种乳酸菌自身的冻干保护剂，然后进行4℃保存。
(f)取(e)中产品，用(b)中Tris-HCl溶液稀释，使其稀释后测定的蛋白浓度指标为5-10μg/μl，取5ml稀释后的产品溶液，添加到20ml的预先已培养至对数期的乳酸菌发酵液中(保护剂与乳酸菌发酵液的体积配比范围为1:(4-10)，在此范围内均具有保护效果)，乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌培养基的配方均采用MRS培养基，培养温度31℃，初始pH7.4；
干酪乳杆菌、双歧杆菌、保加利亚乳杆菌培养基配方及培养条件参考文献；然后放入冷冻干燥机中冻干，用于测定产品的冻干保护效果。
同时设置两个对照组：
对照组1取5ml无菌水，添加到20ml发酵液中，作为不添加保护剂组；
对照组2取正常组细胞，不作任何处理(不经梯度降温冷冻处理)，按照上述步骤提取其胞内物质，验证其胞内物质有无冻干保护作用。
(g)添加保护剂组样品和不添加保护剂组样品(实验组和2个对照组)冻干后同时取出，在37℃水浴锅中进行温浴解冻，各取0.5ml样液，加入4.5ml生理盐水，依次进行梯度稀释，稀释倍数为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-8、10-9，取合适的稀释梯度进行涂平板，每个梯度三次重复，计活菌数，与对照组比较，考察保护剂的保护效果。
下面通过培养不同的乳酸菌种，制备相应的冷冻保护剂，然后将该冷冻保护剂应用于自身作为冷冻保护剂或用于其它种类的乳酸菌作为冷冻保护剂。
实施例1-实施例7为提取冷冻预处理后的乳酸乳球菌的胞内物质作为保护剂保护其自身及其它5种乳酸菌冻干过程的实验例。
实施例1
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为8℃、-16℃、-67℃、依次各处理5h；5000rpm、离心20min,4℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声60min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为6000rpm，时间为20min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表1所示。
表1乳酸乳球菌胞内物质(保护剂)对其自身冻干后的微生物量的影响
如表1所示，以6000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液，最终得到的冻干产品作为保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组的乳酸乳球菌存活率提高了1.3倍，而从对照组2可以看出不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对其自身不具有冻干保护作用。
实施例2：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为31℃、0℃、-45℃、依次各处理2h；5000rpm、离心10min,6℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:30；然后进行超声破碎，功率350w，超声5s，停止5s，共超声30min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为16000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表2所示。
表2乳酸乳球菌胞内物质(保护剂)对其自身冻干后的微生物量的影响
如表2所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液，最终得到的冻干产品作为保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组的对照1的乳酸乳球菌存活率提高了3.9倍，同样对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对其自身不具有冻干保护作用。
实施例3：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为乳酸片球菌的冷冻干燥保护剂。具体地，乳酸乳球菌31℃培养16h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为0℃、-45、-80℃、依次各处理0.5h；5000rpm、离心10min,0℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:30；然后进行超声破碎，功率350w，超声5s，停止5s，共超声30min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为16000rpm，时间为15min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
然后验证冷冻保护剂对乳酸片球菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中乳酸片球菌的的培养条件为31℃、培养24h。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表3所示。
表3乳酸乳球菌胞内物质(保护剂)对乳酸片球菌冻干后的微生物量的影响
如表3所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸乳球菌胞内成分的冻干产品作为乳酸片球菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸片球菌存活率提高了23.7倍，而对照组2均说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸片球菌冻干保护作用微弱。
实施例4：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为植物乳杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸乳球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例2步骤相同；然后验证冷冻保护剂对植物乳杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中植物乳杆菌的培养条件为31℃、培养36h。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表4所示。
表4乳酸乳球菌胞内物质(保护剂)对植物乳杆菌冻干后的微生物量的影响
如表3所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸乳球菌胞内成分的冻干产品作为植物乳杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的植物乳杆菌存活率提高了6.7倍，而对照组2均说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对植物乳杆菌冻干保护作用微弱。
实施例5：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为干酪乳杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸乳球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例2步骤相同；然后验证冷冻保护剂对干酪乳杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中干酪乳杆菌的培养基及培养条件参照金桩《干酪乳杆菌LC-03的培养条件优化研究》。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表5所示。
表5乳酸乳球菌胞内物质(保护剂)对干酪乳杆菌冻干后的微生物量的影响
如表5所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸乳球菌胞内成分的冻干产品作为干酪乳杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的干酪乳杆菌存活率提高了2.5倍，而对照组2均说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对干酪乳杆菌不具有冻干保护作用。
实施例6：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为双歧杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸乳球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例2步骤相同；然后验证冷冻保护剂对双歧杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中双歧杆菌的培养基及培养条件参照熊三玉《两歧双歧杆菌驯化及培养条件优化的研究》。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表6所示。
表6乳酸乳球菌胞内物质(保护剂)对双歧杆菌冻干后的微生物量的影响
如表6所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸乳球菌胞内成分的冻干产品作为双歧杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的双歧乳杆菌存活率提高了18.2倍，而对照组2均说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对双歧杆菌冻干保护作用微弱。
实施例7：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸乳球菌胞内物质作为保加利亚乳杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸乳球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例2步骤相同；然后验证冷冻保护剂对保加利亚乳杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中保加利亚乳杆菌菌的培养基及培养条件参照隋晓峰《保加利亚乳杆菌的高密度培养及大豆发酵饮料的研制》。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表7所示。
表7乳酸乳球菌胞内物质(保护剂)对保加利亚乳杆菌冻干后的微生物量的影响
如表7所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸乳球菌胞内成分的冻干产品作为保加利亚乳杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的保加利亚乳杆菌存活率提高了9.9倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对保加利亚乳杆菌冻干保护作用微弱。
实施例8-实施例13为提取冷冻预处理后的乳酸片球菌的胞内物质作为保护剂保护其自身及其它5种乳酸菌冻干过程的实验例。
实施例8
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为保护剂。具体地，乳酸片球菌31℃培养24h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-20℃、-80℃、依次各处理2h；5000rpm、离心10min,0℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:30；然后进行超声破碎，功率300w，超声5s，停止5s，共超声30min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为20000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对乳酸片球菌冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表8所示。
表8乳酸片球菌胞内物质(保护剂)对其自身冻干后的微生物量的影响
如表7所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸片球菌胞内成分的冻干产品作为其自身的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸片球菌存活率提高了1.9倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸片球菌冻干保护作用微弱。
实施例9：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为乳酸乳球菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸片球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例8步骤相同；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中乳酸乳球菌的的培养条件为31℃、培养16h。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表9所示。
表9乳酸片球菌胞内物质(保护剂)对乳酸乳球菌冻干后的微生物量的影响
如表9所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸片球菌胞内成分的冻干产品作为乳酸乳球菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸乳球菌存活率提高了6.1倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸乳球菌不具有冻干保护作用。
实施例10：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为植物乳杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸片球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例8步骤相同；然后验证冷冻保护剂对植物乳杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中植物乳杆菌的培养条件为31℃、培养36h、培养基为MRS培养基。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表10所示。
表10乳酸片球菌胞内物质(保护剂)对植物乳杆菌冻干后的微生物量的影响
如表9所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸片球菌胞内成分的冻干产品作为植物乳杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的植物乳杆菌存活率提高了6.1倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对植物乳杆菌不具有冻干保护作用。
实施例11：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为干酪乳杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸片球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例8步骤相同；然后验证冷冻保护剂对干酪乳杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中干酪乳杆菌的培养基及培养条件同实施例5，其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表11所示。
表11乳酸片球菌胞内物质(保护剂)对干酪乳杆菌冻干后的微生物量的影响
如表11所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸片球菌胞内成分的冻干产品作为干酪乳杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的干酪乳杆菌存活率提高了4.1倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对干酪乳杆菌不具有冻干保护作用。
实施例12：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为双歧杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸片球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例8步骤相同；然后验证冷冻保护剂对双歧杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中双歧杆菌的培养基及培养条件同实施例6，其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表12所示。
表12乳酸片球菌胞内物质(保护剂)对双歧杆菌冻干后的微生物量的影响
如表12所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸片球菌胞内成分的冻干产品作为双歧杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的双歧杆菌存活率提高了11.6倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对双歧杆菌不具有冻干保护作用。
实施例13：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备乳酸片球菌胞内物质作为保加利亚乳杆菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备乳酸片球菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例8步骤相同；然后验证冷冻保护剂对保加利亚乳杆菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中保加利亚乳杆菌的培养基及培养条件同实施例7，其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表13所示。
表13乳酸片球菌胞内物质(保护剂)对保加利亚乳杆菌冻干后的微生物量的影响
如表13所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的乳酸片球菌胞内成分的冻干产品作为保加利亚乳杆菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的保加利亚乳杆菌存活率提高了5.8倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对保加利亚乳杆菌不具有冻干保护作用。
实施例14-实施例16为提取冷冻预处理后的植物乳杆菌的胞内物质作为保护剂保护其自身及乳酸乳球菌、乳酸片球菌冻干过程的实验例
实施例14
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备植物乳杆菌胞内物质作为保护剂保护其自身冻干过程。具体地，植物乳杆菌31℃培养36h后，进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-20℃、-80℃、依次各处理2h；5000rpm、离心10min,0℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率310w，超声5s，停止5s，共超声50min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为16000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对植物乳杆菌冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表14所示。
表14植物乳杆菌胞内物质(保护剂)对其自身冻干后的微生物量的影响
如表14所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的植物乳杆菌胞内成分的冻干产品作为其自身的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的植物乳杆菌存活率提高了1.9倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对植物乳杆菌冻干保护作用微弱。
实施例15：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备植物乳杆菌胞内物质作为乳酸乳球菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备植物乳杆菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例14步骤相同；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中乳酸乳球菌的的培养条件为31℃、培养16h。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表15所示。
表15植物乳杆菌胞内物质(保护剂)对乳酸乳球菌冻干后的微生物量的影响
如表15所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的植物乳杆菌胞内成分的冻干产品作为乳酸乳球菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸乳球菌存活率提高了14.6倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸乳球菌不具有冻干保护作用。
实施例16：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备植物乳杆菌胞内物质作为乳酸片球菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备植物乳杆菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例14步骤相同；然后验证冷冻保护剂对乳酸片球菌冻干过程的保护作用，其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表16所示。
表16植物乳杆菌胞内物质(保护剂)对乳酸片球菌冻干后的微生物量的影响
如表16所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的植物乳杆菌胞内成分的冻干产品作为乳酸片球菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸片球菌存活率提高了11.7倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸片球菌冻干保护作用微弱。
实施例17-实施例18为提取冷冻预处理后的干酪乳杆菌的胞内物质作为保护剂保护其自身及乳酸乳球菌冻干过程的实验例
实施例17
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备干酪乳杆菌胞内物质作为保护剂保护其自身冻干过程。具体地，干酪乳杆菌培养方法同实施例5，然后进行冷冻预处理，梯度降温条件为6℃、-18℃、-78℃、依次各处理2h；5000rpm、离心20min,0℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:40；然后进行超声破碎，功率310w，超声5s，停止5s，共超声60min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为20000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对其自身冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表17所示。
表17干酪乳杆菌胞内物质(保护剂)对其自身冻干后的微生物量的影响
如表17所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的干酪乳杆菌胞内成分的冻干产品作为其自身的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的干酪乳杆菌存活率提高了2.5倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对干酪乳杆菌冻干保护作用微弱。
实施例18：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备干酪乳杆菌胞内物质作为乳酸乳球菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备干酪乳杆菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例17步骤相同；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中乳酸乳球菌的的培养条件为31℃、培养16h。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表18所示。
表18干酪乳杆菌胞内物质(保护剂)对乳酸乳球菌冻干后的微生物量的影响
如表18所示，以20000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的干酪乳杆菌胞内成分的冻干产品作为乳酸乳球菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸乳球菌存活率提高了3.5倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸乳球菌不具有冻干保护作用。
实施例19-实施例20为提取冷冻预处理后的双歧杆菌的胞内物质作为保护剂保护其自身及乳酸乳球菌冻干过程的实验例
实施例19
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备双歧杆菌胞内物质作为保护剂保护其自身冻干过程。具体地，双歧杆菌培养方法同实施例6，然后进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-20℃、-80℃、依次各处理2h；5000rpm、4℃、离心20min,0℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率310w，超声5s，停止5s，共超声60min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为16000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对其自身冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表19所示。
表19双歧杆菌胞内物质(保护剂)对其自身冻干后的微生物量的影响
如表19所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的双歧杆菌胞内成分的冻干产品作为其自身的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的双歧杆菌存活率提高了14.4倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对双歧杆菌冻干保护作用微弱。
实施例20：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备双歧杆菌胞内物质作为乳酸乳球菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备双歧杆菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例19步骤相同；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中乳酸乳球菌的的培养条件为31℃、培养16h。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表20所示。
表20双歧杆菌胞内物质(保护剂)对乳酸乳球菌冻干后的微生物量的影响
如表20所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的双歧杆菌胞内成分的冻干产品作为乳酸乳球菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸乳球菌存活率提高了8.7倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸乳球菌不具有冻干保护作用。
实施例21-实施例22为提取冷冻预处理后的保加利亚乳杆菌的胞内物质作为保护剂保护其自身及乳酸乳球菌冻干过程的实验例
实施例21
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备保加利亚乳杆菌胞内物质作为保护剂保护其自身冻干过程。具体地，保加利亚乳杆菌培养方法同实施例7，然后进行冷冻预处理，梯度降温条件为4℃、-20℃、-80℃、依次各处理2h；5000rpm、4℃、离心20min,0℃,收集菌体，菌体用技术方案步骤(b)中Tris-HCl缓冲液洗涤三次，菌体、缓冲液质量体积配比为1:50；然后进行超声破碎，功率310w，超声5s，停止5s，共超声60min；离心收集超声破碎后的上清液，离心条件为16000rpm，时间为10min，温度为4℃；对上清液进行真空冷冻干燥，冷阱温度-70℃，真空度1Pa，得到冷冻保护剂；然后验证冷冻保护剂对其自身冻干过程的保护作用，验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表19所示。
表21保加利亚乳杆菌胞内物质(保护剂)对其自身冻干后的微生物量的影响
如表21所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的保加利亚乳杆菌胞内成分的冻干产品作为其自身的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的保加利亚乳杆菌存活率提高了7.2倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对保加利亚乳杆菌不具有冻干保护作用。
实施例22：
如图1所示，按乳酸菌冻干保护剂制备流程制备保加利亚乳杆菌胞内物质作为乳酸乳球菌的冷冻干燥保护剂。具体地，制备保加利亚乳杆菌胞内成分的保护剂产品步骤同实施例21步骤相同；然后验证冷冻保护剂对乳酸乳球菌冻干过程的保护作用，步骤(f)中乳酸乳球菌的的培养条件为31℃、培养16h。其它验证方法类似步骤(f)(g)。
以上实验结果如表22所示。
表22保加利亚乳杆菌胞内物质(保护剂)对乳酸乳球菌冻干后的微生物量的影响
如表22所示，以16000rpm的离心速度收集超声破碎后的上清液最终得到的保加利亚乳杆菌胞内成分的冻干产品作为乳酸乳球菌的冻干保护剂，添加保护剂组相对不添加保护剂组对照1的乳酸乳球菌存活率提高了2.8倍，而对照组2说明不经梯度降温处理的正常细胞胞内提取物对乳酸乳球菌不具有冻干保护作用。
可以理解的是，以上实施方式仅仅是为了说明本发明的原理而采用的示例性实施方式，然而本发明并不局限于此。对于本领域内的普通技术人员而言，在不脱离本发明的精神和实质的情况下，可以做出各种变型和改进，这些变型和改进也视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将培养至对数期的菌体进行阶梯降温处理；
将菌体进行洗涤离心处理,收集菌体；
将菌体破碎；
离心收集上清液，并进行冻干处理，获得冷冻保护剂。
2.如权利要求1所述的冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，
所述的梯度降温处理包括在31℃-0、0--45℃、-45--80℃，每个温度梯度下冷冻处理0.5-5h。
3.如权利要求1所述的冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，
所述将菌体进行洗涤离心处理,收集菌体包括:
将菌体在转速为5000rpm，离心时间为10-20min，温度为0-6℃下进行离心；
用缓冲液洗涤，缓冲液为摩尔浓度0.05M的pH为6.63的Tris-HCl溶液，其中,菌体的质量和缓冲液的体积配比为1g：(30-50)ml。
4.如权利要求1所述的冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，
所述将菌体破碎包括:
采用超声破碎,破碎条件为:功率为300-350w，超声5s，停止5s，共超声30min-60min。
5.如权利要求1所述的冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，
所述离心收集上清液，并进行冻干处理，获得冷冻保护剂包括:
离心条件为6000-20000rpm，时间为10-20min，温度为4℃。
6.如权利要求1-5任一所述的冷冻保护剂的制备方法，其特征在于，所述菌体为嗜热链球菌、乳酸乳球菌、乳酸片球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、双歧杆菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种中的任一一种。
7.一种冻干保护剂，其特征在于，是采用如权利要求1-6任一所述的冷冻保护剂的制备方法制备的。
8.一种冻干保护剂的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
用缓冲液将冻干保护剂稀释，至蛋白浓度为5-10μg/μl，获得冻干保护剂溶液；
将冻干保护剂溶液与菌体发酵液进行混合冻干，其中，冻干保护剂溶液与菌体发酵液的体积比为1:(4-10)。
9.如权利要求8所述的冻干保护剂的使用方法，其特征在于，
所述的菌体发酵液为对数期的菌体发酵液。
CN201611036699.2A 2016-11-22 2016-11-22 一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法 Active CN106754374B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611036699.2A CN106754374B (zh) 2016-11-22 2016-11-22 一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611036699.2A CN106754374B (zh) 2016-11-22 2016-11-22 一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106754374A true CN106754374A (zh) 2017-05-31
CN106754374B CN106754374B (zh) 2019-11-12

Family

ID=58971302

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611036699.2A Active CN106754374B (zh) 2016-11-22 2016-11-22 一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106754374B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475116A (zh) * 2017-06-25 2017-12-15 郑州大学 一种乳酸菌耐盐保护剂及其制备和使用方法
CN108676720A (zh) * 2018-06-20 2018-10-19 江西省科学院微生物研究所 一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂及乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺
CN111154700A (zh) * 2020-02-20 2020-05-15 江苏微康生物科技有限公司 一种高产的德氏乳杆菌保加利亚亚种及其制备方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220260A (zh) * 2011-04-25 2011-10-19 北京市农林科学院 一种植物乳杆菌的冻干工艺
CN102978143A (zh) * 2012-12-21 2013-03-20 哈尔滨工业大学 乳杆菌冻干产品及其制备方法
CN103013832A (zh) * 2012-12-21 2013-04-03 哈尔滨工业大学 乳杆菌深冻产品及其制备方法
CN103966098A (zh) * 2014-04-18 2014-08-06 贵州茅台酒股份有限公司 一种冻干保藏糟醅中群体微生物的处理方法
CN106047709A (zh) * 2016-08-12 2016-10-26 江南大学 一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220260A (zh) * 2011-04-25 2011-10-19 北京市农林科学院 一种植物乳杆菌的冻干工艺
CN102978143A (zh) * 2012-12-21 2013-03-20 哈尔滨工业大学 乳杆菌冻干产品及其制备方法
CN103013832A (zh) * 2012-12-21 2013-04-03 哈尔滨工业大学 乳杆菌深冻产品及其制备方法
CN103966098A (zh) * 2014-04-18 2014-08-06 贵州茅台酒股份有限公司 一种冻干保藏糟醅中群体微生物的处理方法
CN106047709A (zh) * 2016-08-12 2016-10-26 江南大学 一种植物乳杆菌冻干粉及其制备方法

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107475116A (zh) * 2017-06-25 2017-12-15 郑州大学 一种乳酸菌耐盐保护剂及其制备和使用方法
CN108676720A (zh) * 2018-06-20 2018-10-19 江西省科学院微生物研究所 一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂及乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺
CN108676720B (zh) * 2018-06-20 2022-01-18 江西省科学院微生物研究所 一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂及乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺
CN111154700A (zh) * 2020-02-20 2020-05-15 江苏微康生物科技有限公司 一种高产的德氏乳杆菌保加利亚亚种及其制备方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN106754374B (zh) 2019-11-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Hutkins et al. pH homeostasis in lactic acid bacteria
CN105105146B (zh) 一种益生菌的活性保持方法及其在固态脂质食品中的应用
Lu et al. Optimization of a cryoprotective medium to increase the viability of freeze-dried Streptococcus thermophilus by response surface methodology
CN105420111A (zh) 一种提高植物乳杆菌冻干存活率的复合保护剂及其制备方法
CN110607255B (zh) 一种德氏乳杆菌及直投式德氏乳杆菌发酵剂的制备方法和应用
CN105483007A (zh) 植物乳杆菌固定化制剂
CN106754374B (zh) 一种冻干保护剂及其制备方法、使用方法
CN105176823B (zh) 微生物能力验证沙门氏菌样品的制备方法
Bosnea et al. Functionality of freeze-dried L. casei cells immobilized on wheat grains
CN108102987A (zh) 一种空间罗伊氏乳杆菌ss23-52及其干粉发酵剂的制备与在纯种益生菌酸奶中的应用
CN110387330B (zh) 利用复合保护剂提高植物乳杆菌存活率的冷冻干燥方法
CN102113556A (zh) 羊奶酸奶专用发酵剂的制备方法
CN109182129B (zh) 一种细菌保护剂及其应用
Chen et al. The effects of freeze drying and rehydration on survival of microorganisms in kefir
Ge et al. Research progress on improving the freeze-drying resistance of probiotics: a review
Tian et al. Effect of freeze-dried protectants on the survival rate and fermentation performance of fermented milk's directed vat set starters
CN108676721B (zh) 一种益生菌低温冷冻干燥用复合保护剂及其应用
CN100400649C (zh) 一种直投式双歧杆菌纯种冻干发酵剂的复合保护剂
Santos et al. Probiotic cell cultivation
CN104560717A (zh) 一种用于饲用屎肠球菌冻干制剂的保护剂及制备方法
CN101503667B (zh) 一种耐氧性双歧杆菌
CN105483008A (zh) 植物乳杆菌固定化制剂制备方法
CN109517764A (zh) 一种生物被膜态乳酸菌发酵菌剂及其制备方法
Pyar et al. Effect of cryoprotective agents on survival and stability of Lactobacillus acidophilus cultured in food‐grade medium
Urbański et al. Influence of whey on viability of Lactobacillus gasseri during freeze-drying process

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20220415

Address after: No. 100, Kexue Avenue, high tech Development Zone, Zhengzhou City, Henan Province

Patentee after: Zhengzhou University

Patentee after: Institute of Quartermaster engineering technology, Academy of systems engineering, Academy of Military Sciences

Address before: 450000 100 science Avenue, Zhengzhou high tech Zone, Henan

Patentee before: Zhengzhou University