CN108676720A - 一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂及乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂，提高乳酸菌与双歧杆菌冻干过程的成活率，还提供一种乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺，提高乳酸菌和双歧杆菌冻干后产品在常温下的稳定性。本发明制备的乳酸菌和双歧杆菌冻干产品在冻干过程中的存活率明显高于普通制备工艺，尤其在常温下具有极高的活性稳定性，所以该项技术的应用可以避免乳酸菌或双歧杆菌等微生态产品冷链运输、低温存储，减少能耗；同时冻干过程的存活率高，可以提升企业的生产效率和降低生产成本。

Description

一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂及乳酸菌与双歧杆菌冻 干粉的制备工艺
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂及乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺，适用于乳酸菌与双歧杆菌的生产。
背景技术
乳酸菌和双歧杆菌属于益生菌类微生物，广泛分布在人和畜禽肠道，是肠道重要的功能性菌群。它们能在肠道环境下分泌各种代谢物：如消化酶、维生素、氨基酸、有机酸、抗菌肽等生物活性成分。作为肠道的主要功能菌群，为肠道提供了一道生理屏障，可以起到排斥有害菌对肠道黏膜的侵害；其次其产生的短链脂肪酸维持了肠道一个稳定的pH值和低的氧化还原电位，形成一个不利于有害菌的生长环境；另外其分泌的多糖有利于改善肠道黏膜免疫，提高动物的健康水平。乳酸菌和双歧杆菌与生命活动息息相关，因此，乳酸菌和双歧杆菌产品广泛应用于医院、食品与饲料养殖等领域。
目前国内外乳酸菌与双歧杆菌产品达上百种，但是，绝大多数乳酸菌与双歧杆菌活菌制剂存在一个需要解决的非常关键的问题：乳酸菌与双歧杆菌对环境温度、氧气、湿度非常敏感，产品在常温下货架期寿命非常短，产品一般需要进行冷链运输和低温储存下销售，这影响了产品的应用方式和产品效果，另外还提高产品的能耗，因此乳酸菌与双歧杆菌制剂的常温稳定性的解决关系到微生态制剂更好和更广泛的应用、以及提高生产企业的生产效率。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂，提高乳酸菌与双歧杆菌冻干过程的成活率。
本发明的另外一个目的在于提供一种乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺，提高乳酸菌和双歧杆菌冻干后产品在常温下的稳定性。
一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂，保护剂组分及其含量如下： 10wt％～18wt％普鲁兰多糖、0.1mol/L～0.16mol/L Tris-Hcl缓冲液、 0.1wt％～0.5wt％硫酸亚铁铵，pH值为5.5-7.8。
一种乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺，包括如下步骤：
第一步，乳酸菌或双歧杆菌采用常规培养基培养，将培养液稀释 10倍检测，待OD600读值大于0.8后结束培养；
第二步，向培养液中加入终浓度0.1wt％～0.5wt％的硫酸亚铁铵溶解，37℃下搅拌30～60min；
第三步，向上述培养液中加入终浓度为0.1mol/L～0.16mol/L的 Tris-Hcl缓冲液、10wt％～18wt％的普鲁兰多糖，并调节pH值为5.5-7.8；
第四步，将培养液倒入冻干托盘，-35℃～-55℃预冻处理5～10h；
第五步，将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为零下-35℃～-55℃，每1h升温0.5～2℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为500pa，每1h降低10～30pa，最后降低至1pa 恒定结束。
第六步，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。
优选地，所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌中的一种。
优选地，所述双歧杆菌为动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌中的一种。
本发明的乳酸菌与双歧杆菌常温活性稳定冻干粉制备工艺有以下优点：采用本工艺制备的嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌产品冻干存活率达到95.8％～96.7％，冻干粉产品在37℃与相对湿度为65％的恒温条件下做产品加速试验，100天成活率达到72.6％～92.3％；本工艺制备的动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌产品冻干存活率达到80.3％～90.1％，冻干粉产品在37℃与相对湿度为65％的恒温条件下，100天成活率达到65.4％～69.6％；本工艺制备的屎肠球菌、粪肠球菌产品冻干存活率达到97.4％～98.1％，冻干粉产品在37℃与相对湿度为65％的恒温条件下，100天成活率达到 85.3％～89.2％。综上结果，采用本工艺制备的乳酸菌和双歧杆菌冻干产品在冻干过程中的存活率明显高于普通制备工艺，尤其在常温下具有极高的活性稳定性，所以该项技术的应用可以避免乳酸菌或双歧杆菌等微生态产品冷链运输、低温存储，减少能耗；同时冻干过程的存活率高，可以提升企业的生产效率和降低生产成本。
附图说明
图1是本发明乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
通过下列实施例将更具体的说明本发明，但是应理解所述实施例仅是为了说明本发明，而不是以任何方式限制本发明的范围，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围的内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求所界定的保护范围为准。
下列实施例中所采用的菌种均来源于中国工业微生物菌种保藏管理中心，嗜酸乳杆菌(CICC 6082)、鼠李糖乳杆菌(CICC 6135)、植物乳杆菌(CICC 20766)、动物双歧杆菌(CICC 6167)、青春双歧杆菌(CICC 6175)、两歧双歧杆菌(CICC 6168)、屎肠球菌(CICC20089)、粪肠球菌(CICC 20425)。
实施例1：嗜酸乳杆菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支嗜酸乳杆菌到MRS液体培养基中，37℃下恒温培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于0.8后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.2wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌30min；然后向上述各实验组加入终浓度为10wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.1mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节pH 值5.5；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-40℃预冻处理5h 以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-40℃，每1h升温0.5℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为500pa，每1h降低30pa，最后降低至1pa恒定结束；最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表一：
实施例2：鼠李糖乳杆菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支鼠李糖乳杆菌到MRS液体培养基中，37℃下恒温培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10 倍检测，待OD600读值大于1.0后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.1wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌40min；然后向上述各实验组加入终浓度为10wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.1mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节 pH值6.0；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-50℃预冻处理5h以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-50℃，每1h升温1℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为400pa，每1h降低20pa，最后降低至1pa恒定结束。最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表二：
实施例3：植物乳杆菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支植物乳杆菌到MRS液体培养基中，37℃下恒温培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于0.8后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.3wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌50min；然后向上述各实验组加入终浓度为12wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.13mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节pH 值6.5；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-45℃预冻处理5h 以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-45℃，每1h升温1.5℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为450pa，每1h降低15pa，最后降低至1pa恒定结束。最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表三：
实施例四：动物双歧杆菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支动物双歧杆菌到BS液体培养基中，37℃下恒温厌氧条件下培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于1.2后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.5wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌60min；然后向上述各实验组加入终浓度为15wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.13mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节pH值7.8；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-50℃预冻处理5h以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-50℃，每1h升温0.5℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为200pa，每1h降低10pa，最后降低至1pa恒定结束。最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表四：
实施例五：青春双歧杆菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支青春双歧杆菌到BS液体培养基中，37℃下恒温厌氧条件下培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于1.3后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.5wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌50min；然后向上述各实验组加入终浓度为18wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.16mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节pH值7.0；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-55℃预冻处理5h以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-55℃，每1h升温0.5℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为100pa，每1h降低10pa，最后降低至1pa恒定结束。最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表五：
实施例六：两歧双歧杆菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支两歧双歧杆菌到BS液体培养基中，37℃下恒温厌氧条件下培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于1.1后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.4wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌40min；然后向上述各实验组加入终浓度为18wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.16mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节pH值7.5；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-50℃预冻处理5h以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-50℃，每1h升温1℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为200pa，每1h降低10pa，最后降低至1pa恒定结束。最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表六：
实施例七：屎肠球菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支屎肠球菌到MRS液体培养基中，37℃下恒温摇瓶(120 rpm/min)条件下培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于1.5后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.25wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌60min；然后向上述各实验组加入终浓度为10wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.1mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节pH值5.5；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-35℃预冻处理5h以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-35℃，每1h升温2℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为500pa，每1h降低20pa，最后降低至1pa 恒定结束。最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于 10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表七：
实施例八：粪肠球菌在常温下高稳定性冻干粉制备
接种一支粪肠球菌到MRS液体培养基中，37℃下恒温摇瓶(120 rpm/min)条件下培养过夜，通过紫外分光光度计检测培养液细胞浓度，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于1.6后结束培养；实验各组分别加入终浓度为0.2wt％的抗氧化剂：硫酸亚铁铵、二硫苏糖醇、抗坏血酸、硼氢化钠，在37℃条件下搅拌30min；然后向上述各实验组加入终浓度为15wt％的普鲁兰多糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、脱脂奶粉以及终浓度为0.13mol/L的缓冲盐柠檬酸、碳酸钠、硼酸盐、磷酸钠，调节pH值7.8；充分溶解后将处理组各样品倒入托盘，放置-30℃预冻处理5h以上；将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为-30℃，每1h升温2℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为500pa，每1h降低25pa，最后降低至 1pa恒定结束。最后，将上述冻干粉真空包装，包装参数：铝箔袋(厚度大于15丝)，包装真空度小于30pa；环境进行除湿，相对湿度小于10％。对照组样品为不加入抗氧剂、冻干保护剂、缓冲盐等。详细分组处理和结果见表八：

Claims (4)

1.一种乳酸菌与双歧杆菌的冻干保护剂，其特征在于，保护剂组分及其含量如下：10wt％～18wt％普鲁兰多糖、0.1mol/L～0.16mol/L Tris-Hcl缓冲液、0.1wt％～0.5wt％硫酸亚铁铵，pH值为5.5-7.8。
2.一种乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，乳酸菌或双歧杆菌采用常规培养基培养，将培养液稀释10倍检测，待OD600读值大于0.8后结束培养；
第二步，向培养液中加入终浓度0.1wt％～0.5wt％的硫酸亚铁铵溶解，37℃下搅拌30～60min；
第三步，向上述培养液中加入终浓度为0.1mol/L～0.16mol/L的Tris-Hcl缓冲液、10wt％～18wt％的普鲁兰多糖，并调节pH值为5.5-7.8；
第四步，将培养液倒入冻干托盘，-35℃～-55℃预冻处理5～10h；
第五步，将上述样品迅速放入冻干机，冻干室温度起点设置为零下-35℃～-55℃，每1h升温0.5～2℃，升温至35℃恒定至样品冻干；冻干室的真空度起点为500pa，每1h降低10～30pa，最后降低至1pa恒定结束；即得乳酸菌与双歧杆菌冻干粉。
3.根据权利要求2所述的乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺，其特征在于，所述乳酸菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、粪肠球菌中的一种。
4.根据权利要求2所述的乳酸菌与双歧杆菌冻干粉的制备工艺，其特征在于，所述双歧杆菌为动物双歧杆菌、青春双歧杆菌、两歧双歧杆菌中的一种。
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