CN116676230A

CN116676230A - 一株能够利用普鲁兰多糖的动物双歧杆菌及其应用

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Publication number: CN116676230A
Application number: CN202310665807.6A
Authority: CN
Inventors: 曾庆铭; 王婷; 彭佳慧; 王瑞明; 徐振上; 李丕武; 汪俊卿; 冀福全; 夏光明
Original assignee: Shandong Meimei Biotechnology Co ltd; Qilu University of Technology
Current assignee: Shandong Meimei Biotechnology Co ltd; Qilu University of Technology
Priority date: 2023-06-05
Filing date: 2023-06-05
Publication date: 2023-09-01
Anticipated expiration: 2043-06-05
Also published as: CN116676230B

Abstract

本发明提供了一株能够利用普鲁兰多糖的动物双歧杆菌及其应用，属于微生物应用技术领域，具体提供了一种动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株，已于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26757；所述动物双歧杆菌在制备治疗腹泻药物中的应用；并提供了一种组合物，包括所述动物双歧杆菌和普鲁兰多糖；以及所述组合物在制备治疗腹泻药物中的应用；本发明提供的动物双歧杆菌有治疗腹泻的作用效果，并且结合普鲁兰多糖共同治疗腹泻有非常理想的效果，治疗周期较短。

Description

一株能够利用普鲁兰多糖的动物双歧杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物医药应用技术领域，具体涉及一株能够利用普鲁兰多糖的动物双歧杆菌及其应用。

背景技术

普鲁兰多糖是一种由出芽短梗霉发酵所产生的类似葡聚糖、黄原胶的胞外水溶性粘质多糖，它是1938年由R.Bauer发现的一种特殊的微生物多糖。该多糖是由α-1，4糖苷键连接的麦芽三糖重复单位经α-1，6糖苷键聚合而成的直链状多糖，分子量2万～200万，聚合度100～5000。普鲁兰多糖的成膜性、阻气性、可塑性、粘性均较强，并且具有易溶于水、无毒无害、无色无味等优良特性。

动物双歧杆菌是人和许多哺乳动物肠道中的优势菌之一，该菌是人和动物肠道中重要的生理性细菌，参与免疫、营养、消化和保护等一系列的生理过程，发挥着重要的功能。当肠道内有高浓度水平的动物双歧杆菌时，外侵的病原大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、白假丝酵母菌或内源的腐生菌、条件致病菌就会受到抑制。通过口服微囊化双歧杆菌对慢性腹泻患者临床观察研究表明，在服药两周以后，患者大便次数、形状正常，临床症状消失，其总有效率为90.3％，复发率低，目前双歧杆菌制剂是作为治疗慢性腹泻的首选药物。

由于人体内没有能水解a-1，6糖苷键的消化酶，所以普鲁兰多糖是非消化吸收性碳水化合物不被肠吸收，因此普鲁兰多糖多用于低热量健康食品的生产，而开发出更多普鲁兰多糖的益生效果尤为重要。

动物双歧杆菌通常对于腹泻有效，但不会即刻见效。若患者服用时间过短，只服用一次或者一天，腹泻可能不会出现明显改善，一般双歧杆菌治疗腹泻周期为两周及其以上。动物双歧杆菌治疗腹泻的主要作用机制，在于双歧杆菌属于人体有益菌，进入肠道以后可以调节肠道菌群之间的平衡，有利于机体增加有益菌。而益生菌还有其它较多复杂的机制，目前临床还并不明确，如果患者服用益生菌治疗腹泻，有可能还需要多种有益菌补充并达到一定的时间。动物双歧杆菌治疗腹泻的好处在于其属于益生菌，对人体没有不良反应。但是长期服用益生菌可能有一定的副作用和依赖性。

现有技术中，一般使用双歧杆菌菌悬液或者通过丁酸梭菌与婴儿双歧杆菌联用来治疗腹泻，可以一定程度上缓解腹泻症状。食用四联双歧杆菌活菌片可以有效治疗腹泻，四联双歧杆菌活菌片成分为：婴儿双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、粪肠球菌以及不属于肠道菌群的蜡样芽孢杆菌，通过蜡样芽孢杆菌消耗氧气，为双歧杆菌营造厌氧环境。但是由于添加了多种菌群，服用四联双歧杆菌活菌片后很多人会出现肠道应激状态、诱发细菌感染、过敏等副作用。

现有技术文献“动物双歧杆菌乳亚种XLTG11对克林霉素诱导的抗生素相关性腹泻的改善作用”中公开了，经动物双歧杆菌乳亚种XLTG11治疗后小鼠肠道炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量较模型组有所下降，抗炎因子IL-10的含量有所升高，但都不如阳性对照组的治疗效果。

现有技术中存在的技术问题是利用双歧杆菌用于治疗腹泻，治疗周期长，治疗效果有限，有的需要结合其他益生菌共同使用，并且现有技术中还未有双歧杆菌以普鲁兰多糖为唯一碳源生长的报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一株能够利用普鲁兰多糖的动物双歧杆菌及其应用。

本发明的技术方案如下：

一种动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株，已于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26757。

上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株在制备治疗腹泻药物中的应用。

根据本发明优选的，上述应用中，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。

进一步优选的，上述应用中，所述的辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

根据本发明优选的，上述应用中，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。

一种组合物，包括上述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株和普鲁兰多糖。

上述组合物在制备治疗腹泻药物中的应用。

根据本发明优选的，上述组合物在制备治疗腹泻药物中的应用，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。

进一步优选的，上述组合物在制备治疗腹泻药物中的应用，所述的辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

根据本发明优选的，上述组合物在制备治疗腹泻药物中的应用，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一株动物双歧杆菌能以普鲁兰多糖为唯一碳源生长，并且生长良好。

2、本发明提供的动物双歧杆菌有治疗腹泻的作用效果，并且结合普鲁兰多糖共同治疗腹泻有非常理想的效果，治疗周期较短，治疗7天腹泻症状便会消失，更具有时效性。

3、本发明研究发现腹泻小鼠经本发明提供的动物双歧杆菌与普鲁兰多糖结合治疗，其炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量显著低于模型组，抗炎因子IL-10水平也大大提高，并且治疗腹泻的效果优于阳性对照组，其在治疗腹泻方面有着广阔前景。

4、本发明提供的技术方案，治疗周期较短、使用安全性高、治疗效果显著，利用推广利用。

附图说明

图1为动物双歧杆菌CGMCC No.26757在不同碳源培养基中的生长曲线图。

图2为两株双歧杆菌在普鲁兰多糖为唯一碳源的BS培养基中的生长曲线图。

图3为各组小鼠炎症因子含量图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步阐述，但本发明的保护范围不限于此。

实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。

主要材料的具体来源

动物双歧杆菌从山东济南、婴儿粪便中分离获得。

青春双歧杆菌从山东济南、婴儿粪便中分离获得。

普鲁兰多糖购自生工生物工程(上海)股份有限公司。

实施例1

一种动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株的筛选，包括如下步骤：

(1)配制筛选培养基，双歧杆菌BS培养基，培养基配方每升组分包括：大豆蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母浸粉10g，L-半胱氨酸盐酸盐5g，氯化钙0.008g，七水硫酸镁0.0192g，磷酸二氢钾0.04g，碳酸氢钠0.4g，磷酸氢二钾0.04g，氯化钠0.08g，余量水；作为基础培养基，设置三种条件：a.不添加任何碳源的BS培养基，即基础培养基，记为阴性对照培养基；b.添加质量分数1％普鲁兰多糖为唯一碳源的BS培养基，记为实验培养基；c.添加质量分数1％葡萄糖为唯一碳源的BS培养基记为阳性对照培养基。

(2)从土壤中筛选得到动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株。

(3)所筛选得到的动物双歧杆菌Bifidobacterium animalis菌株，已于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26757。

(4)所述动物双歧杆菌CGMCC No.26757具有双歧杆菌的典型特征，动物双歧杆菌是革兰氏阳性多形态杆菌，呈Y字形、V字形、弯曲状、刮勺状，其典型的形态特征是有分叉的杆菌；菌落光滑，凸圆，边缘完整，呈乳白色，闪光并有柔软质地；不形成芽孢，无运动性，完全厌氧。

(5)所述动物双歧杆菌CGMCC No.26757的最适生长温度为37℃，最适pH值为7.0。

所述动物双歧杆菌CGMCC No.26757分别在步骤(1)的三种条件培养基中，37℃厌氧培养48小时，生长曲线如图1所示。所述动物双歧杆菌CGMCC No.26757在以普鲁兰多糖为唯一碳源的BS培养基中，37℃厌氧培养24小时后，菌体的密度达到OD₆₀₀ 5.70，培养基的pH值变为3.8，见图1。

(6)将本发明的动物双歧杆菌CGMCC No.26757 16SrDNA与相关双歧杆菌菌株的16SrDNA比较，具有99.79％的相似性，但不完全相同，说明本发明的菌株具有原创性。

实验例1

利用青春双歧杆菌和动物双歧杆菌CGMCC No.26757分别以普鲁兰多糖为唯一碳源的BS培养基中培养，所用培养基为实施例1中的实验培养基，培养条件同实施例1中动物双歧杆菌CGMCC No.26757的培养条件，生长曲线如图2所示。

培养期间，动物双岐杆菌CGMCC No.26757的OD₆₀₀最高达6.08，而青春双岐杆菌的OD₆₀₀最高仅为1.03，且在各个时间段，动物双岐杆菌CGMCC No.26757生长状况均优于青春双岐杆菌。说明动物双岐杆菌CGMCC No.26757与其他菌株相比能够很好地利用普鲁兰多糖，且具有特异性。

实施例2

建立由盐酸克林霉素诱发的小鼠抗生素相关性腹泻(AAD)模型。

小鼠选择雄性C57BL/KsJ-db/db(4周龄，n＝48)，适应性饲养1周，期间饲养温度为22±2℃，湿度为55％±5％，自由采食与饮水，12h光-暗循环。正常组在整个实验阶段内正常饮食，每天灌胃无菌生理盐水0.2mL；腹泻组每天灌胃0.2mL(200mg/kg·BW)盐酸克林霉素1次。连续饲养14天建立AAD小鼠模型。

选取建模成功小鼠42只，随机分为7组，每组6只，分为模型组、阳性对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4、实验组5。另外选取健康小鼠6只作为正常组。各给药组于造模完成后分别灌胃给药7天，模型组和正常组灌胃给予等量生理盐水，具体如下：

正常组(NC)：0.2mL/d生理盐水；

模型组(Mod)：0.2mL/d生理盐水；

阳性对照组(Met)：0.2mL/d，200mg/mL枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊；

实验组1(P)：0.2mL/d，200mg/mL普鲁兰多糖；

实验组2(BA)：0.2mL/d，10⁹CFU/mL动物双歧杆菌CGMCC No.26757细胞悬液；

实验组3(BAd)：0.2mL/d，10⁹CFU/mL青春双歧杆菌细胞悬液；

实验组4(P+BA)：0.1mL/d，200mg/mL普鲁兰多糖+0.1mL/d，10⁹CFU/mL动物双歧杆菌CGMCC No.26757细胞悬液；

实验组5(P+BAd)：0.1mL/d，200mg/mL普鲁兰多糖+0.1mL/d，10⁹CFU/mL青春双歧杆菌细胞悬液。

从小鼠造模成功开始，实验开始日及实验结束日称量体重，观察各组小鼠腹泻情况。小鼠体重变化如表1所示。

表1不同分组对小鼠体重的影响

由表1可知，与模型组相比，其余组小鼠的体重均增加、均大于模型组。阳性对照组、实验组2和实验组4的小鼠体重增加都很明显，其中阳性对照组小鼠的平均体重为26.08g；实验组2小鼠的平均体重为27.39g；实验组4小鼠的平均体重为28.76g。实验组4的小鼠体重增长最多，大于阳性对照组以及实验组1和实验组2小鼠的体重，由此说明普鲁兰多糖和动物双歧杆菌CGMCC No.26757细胞悬液的混合饲养对小鼠腹泻的治疗效果最好，优于枯草杆菌二联活菌肠溶胶囊的药物治疗和单独使用普鲁兰多糖、动物双歧杆菌CGMCCNo.26757的治疗。并且实验组2的小鼠平均体重比实验组3的小鼠重2.35g；同样实验组4的小鼠也比实验组5的小鼠平均重3.03g。因此，本发明提供的动物双歧杆菌CGMCC No.26757在治疗腹泻上效果明显优于青春双歧杆菌，并且对比现有技术，本实验实验组4的治疗效果最佳。

实验的前2天和最后2天观察小鼠的粪便稠度，做出评价。小鼠粪便稠度等级如表2所示，根据粪便形态，将其分为5个等级：

5级：含水量极低，干燥、易碎，呈块状。

4级：粪便表面有清晰可见的纹路和干裂，容易拾起，基本不在地面有残留。

3级：粪便潮湿，呈圆柱状，从地面捡起时会有残留。

2级：粪便湿度较大，但不是完全呈液态。不易拾起，有些时候还会在宠物肛周粘连。

1级：完全的液态粪便。

表2小鼠粪便稠度等级

如表2所示，由生理盐水灌胃的模型组小鼠的粪便稠度等级最低，粪便湿度较大，仍存在一定的腹泻状况。其余组的小鼠粪便潮湿、易于拾起、甚至粪便表面有清晰可见的纹路，腹泻症状几乎完全消失。实验组2和实验组4治疗效果最佳，由此说明动物双歧杆菌CGMCCNo.26757细胞悬液的治疗效果比青春双歧杆菌好。且本发明所使用的动物双歧杆菌CGMCCNo.26757治疗腹泻效果优于药物对照组。

结肠组织细胞因子的测定：按照制造商的说明使用ELISA试剂盒分别检测小鼠结肠组织细胞因子TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-10的含量，结果如图3所示。

如图3所示，除模型组外，其余组小鼠观察到促炎细胞因子TNF-ɑ，IL-6，IL-1β显著下降，免疫调节细胞因子IL-10的浓度与模型组小鼠的含量相比显著上升。由图3中的A、图3中的B、图3中的C可知，实验组1和实验组3一定程度上能抑制促炎因子TNF-ɑ、IL-6、IL-1β的水平，但其效果低于实验组2，说明普鲁兰多糖具有抑炎潜力，动物双歧杆菌的抑炎功能优于青春双歧杆菌。其中实验组4的促炎因子水平最低，且低于实验组5，同样说明本研究的动物双歧杆菌治疗腹泻的能力强于青春双歧杆菌，并且普鲁兰多糖与动物双歧杆菌结合治疗效果更佳。由图3中的D可知，4个实验组的抗炎能力与上述实验有着相同的规律。实验组4中抗炎因子IL-10的浓度远远高于模型组，与正常对照组和阳性对照组相当。以上结果说明，本发明提供的动物双歧杆菌CGMCC No.26757有治疗腹泻的作用效果，普鲁兰多糖和动物双歧杆菌CGMCC No.26757细胞悬液对肠道有保护作用，也说明了腹泻症状的消失，对腹泻有显著的治疗作用，其在治疗腹泻方面有着广阔前景。青春双歧杆菌有一定的抑炎效果，能够用于治疗腹泻，但是其效果远远不如本发明提供的动物双歧杆菌CGMCC No.26757。此外对比现有技术，在本发明中普鲁兰多糖与动物双歧杆菌CGMCC No.26757结合治疗效果更佳，二者起到了一定的协同作用。

本发明提供了一株动物双歧杆菌CGMCC No.26757能以普鲁兰多糖为唯一碳源生长，并且生长良好；本发明提供的动物双歧杆菌CGMCC No.26757有治疗腹泻的作用效果，结合普鲁兰多糖共同治疗腹泻有非常理想的效果，并且治疗周期较短，治疗7天腹泻症状便会消失，更具有时效性；本发明研究发现腹泻小鼠经普鲁兰多糖与动物双歧杆菌CGMCCNo.26757结合治疗，其炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量显著低于模型组，抗炎因子IL-10水平也大大提高，并且治疗腹泻效果优于阳性对照组，其在治疗腹泻方面有着广阔前景。

Claims

1.一种动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株，已于2023年3月6日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.26757。

2.权利要求1所述动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)菌株在制备治疗腹泻药物中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。

6.一种组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)菌株和普鲁兰多糖。

7.权利要求6所述的组合物在制备治疗腹泻药物中的应用。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物含有一种或多种药学上可接受的载体或辅剂。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的辅剂为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸促进剂、表面活性剂或润滑剂中的至少一种。

10.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊、丸剂、片剂、口服液、颗粒剂、酊剂或注射剂。