CN114540242A - 一种能够预防和/或治疗腹泻的动物双歧杆菌及其应用 - Google Patents

一种能够预防和/或治疗腹泻的动物双歧杆菌及其应用 Download PDF

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CN114540242A CN202210256696.9A CN202210256696A CN114540242A CN 114540242 A CN114540242 A CN 114540242A CN 202210256696 A CN202210256696 A CN 202210256696A CN 114540242 A CN114540242 A CN 114540242A
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Abstract

本发明公开一种能够预防和/或治疗腹泻的动物双歧杆菌及其应用，所述动物双歧杆菌经鉴定为动物双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)，菌株名为TY03，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月26日，保藏编号为CCTCC No:M2020633。所述菌株具有缓解腹泻，尤其是由产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的腹泻的作用，具体体现在：(1)显著降低腹泻患者的粪便含水量；(2)显著缓解腹泻患者空肠的病理损伤；(3)显著降低腹泻患者血清促炎因子水平；(4)显著提高腹泻患者血清抑炎因子水平；(5)显著提高腹泻患者粪便中短链脂肪酸的含量；(6)显著提高腹泻患者肠道菌群多样性，因此，TY03在制备预防和/或治疗由ETEC引起的腹泻的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景。

Description

一种能够预防和/或治疗腹泻的动物双歧杆菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种能够预防和/或治疗腹泻的动物双歧杆菌及其应用。
背景技术
腹泻是最常见的消化系统疾病之一，细菌腹泻是占据主要地位，其中最常见的细菌性痢疾病原体包括大肠杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌和金黄色葡萄球菌。产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)是旅行者腹泻以及发展中国家儿童特有的腹泻和发育迟缓的主要原因。 ETEC产生热不稳定(LT)和热稳定(ST)肠毒素，与抗霍乱毒素的结构和功能相似，刺激细胞中cAMP的合成，并通过在小肠中定殖而引起人和其他动物的腹泻。对于治疗腹泻，使用抗生素是一种有效的手段。在确定以ETEC为最常见病因的旅行者腹泻的治疗中，红霉素、诺氟沙星、环丙沙星和氧氟沙星等抗生素均十分有效。然而，由于儿童腹泻不仅是由ETEC引起，还有可能由其他细菌和病毒因子引起，并且，临床表现不足以区分它们，因此，很难研究抗生素对ETEC病患儿童的作用，同时，抗生素也并不是一种治疗儿童腹泻的常规方法。另外，服用抗生素还存在副作用大、成本高、ETEC易出现耐药性等问题。上述缺陷均使得这些抗生素的使用受到限制，而替代方法的有效性还在研究中。
益生菌是通过定殖在人体内，改变宿主肠道菌群组成，进而代谢产生如短链脂肪酸等有益代谢物，以对宿主产生有益影响的一类菌。与普通的药物相比，益生菌具有安全性高、无副作用、不会出现耐药性和成本低等优势。并且，研究表明，少数益生菌确实可对一些特殊的疾病起到预防和/或治疗作用，例如，公开号为CN108220206A的专利申请文本中，长双歧杆菌YS108R就可很好的预防和/或治疗结肠炎；公开号为CN112694992A的专利申请文本中，两歧双歧杆菌CCFM1150也可好的预防和/或治疗腹泻。因此，急需找到其他可缓解由ETEC引起的腹泻的益生菌。
发明内容
发明目的：针对现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种能够预防和/或治疗腹泻的动物双歧杆菌及其应用。
技术方案：为了达到上述发明目的，本发明所采用的技术方案如下：
一种动物双歧杆菌，经鉴定为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)，菌株名为 TY03，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月26日，保藏编号为CCTCC No:M2020633。
所述动物双歧杆菌TY03是从来源于江苏省镇江地区的健康女性幼童粪便中分离得到的，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在NCB中进行核酸序列比对，结果显示菌株为动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis）TY03。
本发明还提供了所述的动物双歧杆菌在制备预防和/或治疗腹泻药物或食品中的应用。或者所述动物双歧杆菌在制备胃肠道保健食品中的应用。
优选的，所述药物或食品中，所述动物双歧杆菌的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×109CFU/g。
优选的，所述腹泻为ETEC引起的腹泻。
优选的，所述食品为保健食品；或者所述食品包括乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。
进一步优选的，所述食品包括使用含有上述动物双歧杆菌的发酵剂生产得到的乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。
所述发酵剂的制备方法为：将上述动物双歧杆菌TY03按照占培养基总质量2～4％的接种量接种到培养基中，于37℃下培养24～48h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用生理盐水重悬，得到发酵剂。
更优选的，所述培养基为MRS培养基。
本发明还提供了一种组合物，其包含所述的动物双歧杆菌。
优选的，所述组合物包含所述的动物双歧杆菌、药物载体和/或药用辅料。
优选的，所述组合物包含所述的动物双歧杆菌和食用辅料。
本发明最后还提供了所述的组合物在制备预防和/或治疗腹泻药物或食品中的应用。
优选的，所述药物或食品中，所述动物双歧杆菌的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×109CFU/g。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下优势：
1、本发明筛选出了一株动物双歧杆菌TY03，此动物双歧杆菌TY03具有缓解由ETEC引起的腹泻的作用，具体体现在：
(1)显著降低腹泻患者的粪便含水量；
(2)显著缓解腹泻患者空肠的病理损伤；
(3)显著降低腹泻患者血清中促炎因子水平；
(4)显著提高腹泻患者血清中抑炎因子水平；
(5)显著提高腹泻患者粪便中短链脂肪酸的含量；
(6)显著提高腹泻患者肠道菌群多样性，
因此，动物双歧杆菌TY03在制备预防和/或治疗由ETEC引起的腹泻的产品(如食品或药品等)中，具有巨大的应用前景。
2、动物双歧杆菌是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，因此，本发明筛选得到的动物双歧杆菌TY03不会给腹泻患者带来任何潜在的安全隐患。
3、动物双歧杆菌的培育过程仅需培养基以及一些培养条件的控制，成本相对低廉，不会给腹泻患者带来太大的经济负担。
附图说明
图1为腹泻小鼠食用动物双歧杆菌TY03前后的粪便含水量的变化情况。
图2为腹泻小鼠食用动物双歧杆菌TY03前后的空肠病理损伤情况。
图3为腹泻小鼠食用动物双歧杆菌TY03前后的血清中TNFα和IL-10含量。
图4为腹泻小鼠食用动物双歧杆菌TY03前后的小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的含量。
图5为腹泻小鼠食用动物双歧杆菌TY03前后的肠道菌群的α多样性。
图6为腹泻小鼠食用动物双歧杆菌TY03前后的肠道菌群的β多样性。
具体实施方式
通过以下实施例进一步对本发明进行进一步阐述。这些实施例完全是例证性的，他们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。下面结合附图及实施例对发明作进一步描述：
下述实施例中涉及的BALB/c小鼠购自浙江维通利华公司；下述实施例中涉及的链霉素购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的ETEC O78：K80购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；下述实施例中涉及的环丙沙星购自生工生物工程(上海)股份有限公司；下述实施例中涉及的检测TNFα(货号：(ab208348))和IL-10 (货号：ab255729)的ELISA试剂盒购自Abcam公司。
下述实施例中涉及的培养基如下：
MRS固体培养基：蛋白胨10.5g/L、牛肉膏10.5g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2.5g/L、酵母粉 5.5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.5g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO40.05g/L、吐温80 1mL/L、琼脂15g/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
MRS液体培养基：蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、葡萄糖20g/L、乙酸钠2g/L、酵母粉5g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、K2PO4·3H2O 2.4g/L、MgSO4·7H2O 0.2g/L、MnSO4 0.05g/L、吐温80 1mL/L、半胱氨酸氨酸盐0.5g/L。
实施例1：动物双歧杆菌TY03的筛选及菌种鉴定
1、筛选
以来源于江苏省镇江地区的健康人体粪便样本，取0.5g保存于30％(v/v)甘油中的样本在无菌环境下加入装有4.5m L生理盐水(含有0.5g/L半胱氨酸)的10m L离心管中，得到 10-1稀释液，重复上述稀释步骤，依次得到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释液；分别吸取100μL不同梯度的梯度稀释液涂布于MRS固体培养基(含有0.5g/L半胱氨酸)上，37℃培养72h，得到稀释涂布平板；挑取稀释涂布平板上的典型菌落分别在MRS固体培养基(含有0.5g/L半胱氨酸)上划线，37℃培养48h，得到纯化菌落；挑取纯化菌落接种至MRS液体培养基(含有0.5g/L半胱氨酸)中，37℃培养48h，得到菌株TY03。
2、鉴定
提取TY03的基因组，将TY03的16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，将测序分析得到的TY03的16S rDNA序列(TY03的16SrDNA序列如SEQ IDNO.1所示)在GenBank中进行比对，结果显示此菌株均为动物双歧杆菌，命名为动物双歧杆菌TY03。
动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)TY03，分类学命名为Bifidobacterium animalis，已于2020年10月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏编号为CCTCC No:M2020633，保藏地址为中国武汉武汉大学。
实施例2～6中，动物双歧杆菌菌液的制备方法如下：
蘸取动物双歧杆菌菌液在MRS固体培养基上划线，37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6000g离心15min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有132g/L脱脂乳、19g/L海藻糖和19g/L蔗糖的保护剂溶液将乳酸菌菌体重悬至细胞浓度为5×109CFU/m L，得到动物双歧杆菌菌液。
实施例2：动物双歧杆菌TY03对腹泻小鼠粪便含水量的影响
具体步骤如下：
取3～4周龄的雌性无病原体(SPF)BALB/c小鼠40只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组10只，4组分别为：对照组、模型组、灌胃环丙沙星的药物组和灌胃动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)TY03菌液的TY03组。
实验共3周：动物适应性饲养1周后开始实验。从造模前7天开始，一直持续到实验结束(不包括抗生素处理的那3天)，对照组和模型组小鼠每只每天灌胃0 .2m L含有132g/L脱脂乳、19g/L海藻糖和19g/L蔗糖的保护剂溶液，药物组每只每天灌胃0.2mL浓度为1g/L的环丙沙星水溶液(无菌)，TY03组每只每天灌胃0.2mL动物双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)TY03菌液；第2周到第3周为造模期，造模第1～3天，在小鼠饮用水中加入5g/L的链霉素，以消除BALB/c小鼠肠道正常菌群，造模第4～7天，用不含抗生素的无菌水代替含有链霉素的水作为小鼠饮用水，并且对小鼠禁食12h，12h后给每组小鼠每只灌胃0.2mL浓度为1.2×1011CFU/mL的ETEC O78：K80悬液(通过将ETEC O78：K80菌体溶于浓度为8.5g/L的生理盐水而得)，连续灌胃4天，1天2次，每次间隔2h。
实验结束后，收集小鼠粪便，通过冻干机测定小鼠粪便的含水量，测定结果见图1。由图1可知，对照组和TY03组小鼠的粪便含水量显著低于模型组小鼠(分别为61.5％和70.2％)，药物组小鼠的粪便含水量为62.3％，与模型组无显著性差异。可见，动物双歧杆菌TY03可有效缓解腹泻小鼠粪便含水量升高的症状，且效果优于环丙沙星。
实施例3：动物双歧杆菌TY03对腹泻小鼠空肠病理损伤情况的影响
具体步骤如下：
取3～4周龄的雌性无病原体(SPF)BALB/c小鼠40只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组10只，4组分别为：对照组、模型组、灌胃环丙沙星的药物组和灌胃动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)TY03菌液的TY03组。
实验共3周：动物适应性饲养1周后开始实验。从造模前7天开始，一直持续到实验结束(不包括抗生素处理的那3天)，对照组和模型组小鼠每只每天灌胃0 .2m L含有132g/L脱脂乳、19g/L海藻糖和19g/L蔗糖的保护剂溶液，药物组每只每天灌胃0.2m L浓度为1g/L的环丙沙星水溶液(无菌)，TY03组每只每天灌胃0.2m L动物双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)TY03菌液；第2周到第3周为造模期，造模第1～3天，在小鼠饮用水中加入5g/L的链霉素，以消除BALB/c小鼠肠道正常菌群，造模第4～7天，用不含抗生素的无菌水代替含有链霉素的水作为小鼠饮用水，并且对小鼠禁食12h，12h后给每组小鼠每只灌胃0.2mL浓度为1.2×1011CFU/mL的ETEC O78：K80悬液(通过将ETEC O78：K80菌体溶于浓度为8.5g/L的生理盐水而得)，连续灌胃4天，1天2次，每次间隔2h。
实验结束后，处死小鼠，取小鼠空肠，于4％(v/v)多聚甲醛中浸泡24h，得到固定好的空肠组织；将固定好的空肠组织依次进行脱水、透明、浸蜡后，用莱卡石蜡包埋机将组织包埋于蜡块中，得到包埋好空肠组织的蜡块；其中，脱水、透明、浸蜡的具体步骤如下：
(1) 脱水：将固定好的组织先依次经70％、80％和90％(v/v)梯度乙醇溶液进行脱水，每个梯度各30min，然后放入95％和100％(v/v)酒精溶液各2次，每次20min；
(2)透明：将组织先放入酒精和二甲苯等体积比混合液中15min，然后放入二甲苯I和二甲苯II各15min；
(3) 浸蜡：将组织样放入62℃的石蜡I和石蜡II液体中各30min。将包埋好空肠组织的蜡块用莱卡手动轮转切片机进行切片，切片厚度为4μm，得到空肠组织切片；将空肠组织切片经展片和捞片、烤片、苏木精染色、分化、漂洗、伊红复染、脱水、透明、封片，得到H&E空肠切片；其中，展片和捞片、烤片、苏木精染色、分化、漂洗、伊红复染、脱水、透明、封片的具体操作如下：
(1)展片和捞片：将切片放于42℃恒温水浴中进行展片后用载玻片小心地捞出；
(2)烤片：将切片放于60℃烘箱中过夜烤片；
(3) 苏木精染色：将切片先进行水化(即先将切片置于二甲苯I和二甲苯II各5min，然后依次放入100％、95％、90％、80％和70％(v/v)梯度酒精溶液中各5min，最后放入蒸馏水中3min)，然后进行染色20s，最后进行水洗30min；
(4)分化：将切片放入1％(v/v)盐酸乙醇溶液中7s，进行褪色；
(5) 漂洗：用自来水冲洗切片20min；
(6)复染：将切片浸入伊红染色液，立即取出；
(7) 脱水：将切片先依次放入95％(v/v)乙醇溶液I、95％(v/v)乙醇溶液II、70％(v/v)乙醇溶液，放入后立即取出，然后浸入80％(v/v)乙醇溶液50s，最后浸入100％(v/v)乙醇2min；
(8)透明：将切片先浸入乙醇和二甲苯等体积比混合液1min，然后浸入二甲苯I和二甲苯 II各2min；
(9)封片：将切片用中性树胶封片。对小鼠空肠的绒毛长度和隐窝深度进行观察，观察结果见图2。
由图2可知，模型组小鼠较对照组小鼠而言，空肠绒毛明显缩短，药物组，但动物双歧杆菌TY03组小鼠的空肠结构与对照组相似，绒毛长度没有明显缩短。可见，动物双歧杆菌TY03对空肠组织有明显的保护作用，且效果优于环丙沙。
实施例4：动物双歧杆菌TY03对腹泻小鼠血清中炎症因子水平的影响
具体步骤如下：
取3～4周龄的雌性无病原体(SPF)BALB/c小鼠40只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组10只，4组分别为：对照组、模型组、灌胃环丙沙星的药物组和灌胃动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)TY03菌液的TY03组。
实验共3周：动物适应性饲养1周后开始实验。从造模前7天开始，一直持续到实验结束(不包括抗生素处理的那3天)，对照组和模型组小鼠每只每天灌胃0 .2m L含有132g/L脱脂乳、19g/L海藻糖和19g/L蔗糖的保护剂溶液，药物组每只每天灌胃0.2m L浓度为1g/L的环丙沙星水溶液(无菌)，TY03组每只每天灌胃0.2m L动物双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)TY03菌液；第2周到第3周为造模期，造模第1～3天，在小鼠饮用水中加入5g/L的链霉素，以消除BALB/c小鼠肠道正常菌群，造模第4～7天，用不含抗生素的无菌水代替含有链霉素的水作为小鼠饮用水，并且对小鼠禁食12h，12h后给每组小鼠每只灌胃0.2mL浓度为1.2×1011CFU/mL的ETEC O78：K80悬液(通过将ETEC O78：K80菌体溶于浓度为8.5g/L的生理盐水而得)，连续灌胃4天，1天2次，每次间隔2h。
实验结束后，取血并处死小鼠，取小鼠血清，通过ELISA试剂盒测定每组小鼠血清中TNFα和IL-10的含量，检测结果见图3。
如图3所示，模型组小鼠血清中TNFα的浓度为192.4pg/m L，与对照组(78.5pg/mL) 相比具有显著性变化；相比于模型组小鼠，动物双歧杆菌TY03组小鼠血清中TNFα水平显著降低，为98.6pg/m L，药物组则无显著性变化。同时，对照组和动物双歧杆菌TY03组小鼠血清中IL-10的含量分别为104.8pg/m L和 132.5pg/m L，均较模型组小鼠(54.1pg/L)显著增加；药物组组小鼠则与模型组相比无显著性变化。可见，动物双歧杆菌TY03可显著降低腹泻小鼠血清中的促炎因子水平以及显著增加腹泻小鼠血清中的抗炎因子水平，优于环丙沙星效果。
实施例5：动物双歧杆菌TY03对腹泻小鼠粪便中短链脂肪酸含量的影响
具体步骤如下：
取3～4周龄的雌性无病原体(SPF)BALB/c小鼠40只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组10只，4组分别为：对照组、模型组、灌胃环丙沙星的药物组和灌胃动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)TY03菌液的TY03组。
实验共3周：动物适应性饲养1周后开始实验。从造模前7天开始，一直持续到实验结束(不包括抗生素处理的那3天)，对照组和模型组小鼠每只每天灌胃0 .2m L含有132g/L脱脂乳、19g/L海藻糖和19g/L蔗糖的保护剂溶液，药物组每只每天灌胃0.2m L浓度为1g/L的环丙沙星水溶液(无菌)，TY03组每只每天灌胃0.2m L动物双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)TY03菌液；第2周到第3周为造模期，造模第1～3天，在小鼠饮用水中加入5g/L的链霉素，以消除BALB/c小鼠肠道正常菌群，造模第4～7天，用不含抗生素的无菌水代替含有链霉素的水作为小鼠饮用水，并且对小鼠禁食12h，12h后给每组小鼠每只灌胃0.2mL浓度为1.2×1011CFU/mL的ETEC O78：K80悬液(通过将ETEC O78：K80菌体溶于浓度为8.5g/L的生理盐水而得)，连续灌胃4天，1天2次，每次间隔2h。
实验结束后，收集小鼠粪便置于液氮中，后转移至80℃冰箱，在进行短链脂肪酸含量的检测前取出，进行真空冷冻干燥，准确称取0.05g冻干后的粪便样品溶解于0.5mL饱和氯化钠溶液中，浸泡30min，组织匀浆机匀浆，加入0.02m L浓度为10％的硫酸，震荡30s，在通风橱内向粪便溶液中准确加入0.8m L乙醚溶液，震荡30s后离心15min(8000g、4℃)，移取上清液至含有0.25g无水硫酸钠的离心管中，震荡均匀，离心15min(8000g、4℃)，取上清至气质容量瓶中，通过GCMS检测短链脂肪酸含量，检测结果见图4。
如图4所示，模型组小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸含量(分别为120.6g/mol，10 .2g/mol，3.4g/mol，2.3g/mol)较对照组小鼠(分别为200.8g/mol，20.3g/mol，4.5g/mol，2.8g/mol)下降，其中，乙酸、丙酸、丁酸含量下降最为显著；动物双歧杆菌TY03组小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸的含量(160.2g/mol，14 .4g/mol，3.9g/mol)与模型组相比显著上调；药物组组小鼠粪便中乙酸、丙酸、丁酸和戊酸的含量则与模型组无显著差异。可见，动物双歧杆菌TY03可显著提高腹泻小鼠粪便中短链脂肪酸的含量，环丙沙星则无此效果。
实施例6：动物双歧杆菌TY03对腹泻小鼠肠道菌群多样性的影响
具体步骤如下：
取3～4周龄的雌性无病原体(SPF)BALB/c小鼠40只，于饲养室温为22～24℃，湿度为40～60％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下饲养1周后，随机分为4组，每组10只，4组分别为：对照组、模型组、灌胃环丙沙星的药物组和灌胃动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)TY03菌液的TY03组。
实验共3周：动物适应性饲养1周后开始实验。从造模前7天开始，一直持续到实验结束(不包括抗生素处理的那3天)，对照组和模型组小鼠每只每天灌胃0 .2m L含有132g/L脱脂乳、19g/L海藻糖和19g/L蔗糖的保护剂溶液，药物组每只每天灌胃0.2m L浓度为1g/L的环丙沙星水溶液(无菌)，TY03组每只每天灌胃0.2m L动物双歧杆菌 (Bifidobacteriumanimalis)TY03菌液；第2周到第3周为造模期，造模第1～3天，在小鼠饮用水中加入5g/L的链霉素，以消除BALB/c小鼠肠道正常菌群，造模第4～7天，用不含抗生素的无菌水代替含有链霉素的水作为小鼠饮用水，并且对小鼠禁食12h，12h后给每组小鼠每只灌胃0.2mL浓度为1.2×1011CFU/mL的ETEC O78：K80悬液(通过将ETEC O78：K80菌体溶于浓度为8.5g/L的生理盐水而得)，连续灌胃4天，1天2次，每次间隔2h。
实验结束后，收集小鼠粪便，通过Fast DNA Spin Kit(美国MP生物医药公司)提取粪便中的基因组DNA，对提取得到的基因组DNA的V3-V4区进行特异性PCR扩增，16SrDNA测序，分析粪便菌群α多样性(Chao 1、Shannon和Simpson)和β多样性的变化，分析结果见图5。由图5可知，就Chao 1指数而言，对照组、药物组与模型组相比均不存在显著性差异(p>0.05)，但动物双歧杆菌TY03能显著提高小鼠肠道群落的多样性；就Shannon指数和Simpson指数而言，模型组能显著降低样本中微生物的多样性，动物双歧杆菌TY03能显著提高小鼠粪便样本肠道菌群的多样性，而药物组不存在显著性差异(p>0.05)。
由图6可知，模型组小鼠的肠道菌群与对照组小鼠显著不同；经过动物双歧杆菌TY03组的干预后，小鼠肠道菌群向对照组发生了移动，其他组别则与造模组的肠道菌群分布没有较大差异。可见，动物双歧杆菌TY03可有效提高腹泻小鼠肠道菌群多样性，且效果远优于药物组。
实施例7：动物双歧杆菌TY03的应用
具体步骤如下：
动物双歧杆菌TY03可用于制备片剂，片剂的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的动物双歧杆菌TY03的单菌落接入MRS液体培养基中于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照1.5％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照1.5％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6200g离心13min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有120g/L脱脂乳、25g/L海藻糖和25g/L蔗糖的保护剂溶液将动物双歧杆菌TY03菌体重悬至细胞浓度为1×1010CFU/m L，得到动物双歧杆菌TY03菌液；将动物双歧杆菌TY03菌液冷冻干燥，得到动物双歧杆菌TY03菌粉；在动物双歧杆菌TY03中加入2％的硬脂酸作润滑剂、3％的CMC-Na作粘合剂后进行压片，得到片剂。
取1g上述片剂每天灌胃腹泻小鼠，连续五周，可有效缓解小鼠腹泻的症状，在预防和/ 或治疗腹泻上有极好的效果。
实施例8：动物双歧杆菌TY03的应用
具体步骤如下：
动物双歧杆菌TY03可用于制备菌粉，菌粉的具体制备过程如下：
挑取实施例1获得的动物双歧杆菌TY03的单菌落接入MRS液体培养基中于37℃培养24h，得到活化液；将活化液按照4％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中于37℃培养24h，得到一级种子液；将一级种子液按照2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到二级种子液；将二级种子液按照2％(v/v)的接种量接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，得到菌液；将菌液6200g离心13min，收集沉淀；将沉淀用pH为7.4的PBS缓冲液洗涤两次后，6000g再次离心10min，得到菌体；用含有120g/L脱脂乳、25g/L海藻糖和25g/L蔗糖的保护剂溶液将动物双歧杆菌TY03菌体重悬至细胞浓度为1×1010CFU/m L，得到动物双歧杆菌TY03菌液；将动物双歧杆菌TY03菌液冷冻干燥，得到动物双歧杆菌TY03菌粉。
取1g上述菌粉每天灌胃腹泻小鼠，连续一周，可有效缓解小鼠腹泻的症状，在预防和/或治疗腹泻上有极好的效果。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 镇江天益菌工生物有限公司
<120> 一种能够预防和/或治疗腹泻的动物双歧杆菌及其应用
<141> 2022-03-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1039
<212> DNA
<213> 动物双歧杆菌TY03(Bifidobacterium animalis)
<400> 1
gcccgtggcg ggtgctatac atgcaagtcg aacgaactct ggtattgatt ggtgcttgca 60
tcatgattta catttgagtg agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa acctgcccag 120
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cgcgaagacc ttaccagtct tgacatacta tgcaaatcta gagattagac gttccctttc 1020
ggggacatgg atacagtgt 1039

Claims (10)

1.一种动物双歧杆菌，其特征在于，经鉴定为动物双歧杆菌(Bifidobacteriumanimalis)，菌株名为TY03，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2020年10月26日，保藏编号为CCTCC No:M2020633。
2.权利要求1所述的动物双歧杆菌在制备预防和/或治疗腹泻药物或食品中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物或食品中，所述动物双歧杆菌的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×109CFU/g。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物或食品中，所述腹泻为ETEC引起的腹泻。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述食品为保健食品；或者所述食品包括乳制品、豆制品、肉制品或果蔬制品。
6.一种组合物，包含权利要求1所述的动物双歧杆菌。
7.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的动物双歧杆菌、药物载体和/或药用辅料。
8.根据权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述组合物包含权利要求1所述的动物双歧杆菌和食用辅料。
9.权利要求6所述的组合物在制备预防和/或治疗腹泻药物或食品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物或食品中，所述动物双歧杆菌的活菌数为不低于1×109CFU/mL或1×109CFU/g。
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