CN115197870B - 一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法及应用 - Google Patents

一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法及应用，制备方法包括以下步骤：将乳酸菌接种于培养基中进行培养，得到种子液；将种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在发酵稳定初期终止发酵，得到发酵液；将发酵液离心得到菌体；将菌体和缓冲液混合得到菌悬液，然后对菌悬液进行冷应激处理，得到冷应激处理后的菌悬液；将冷应激处理后的菌悬液稀释后培养，得到菌体；重复以上步骤，得到具有高抗氧化应激性能的乳酸菌。采用本发明提供的制备方法提高了乳酸菌的抗氧化应激性能，通过在制备过程中进行多因素亚致死胁迫处理，筛选综合抗逆性良好的菌体。

Description

一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法及应用
技术领域
本发明属于乳酸菌技术领域，具体涉及一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法及应用。
背景技术
自由基和活性氧导致的氧化应激和损伤与机体大部分疾病都有或多或少的关系。虽然在机体内有一套有效的内源性抗氧化系统，但其抗氧化调节能力有限，特别是氧化应激比较严重时，必须依靠补充外源性的抗氧化剂。
乳酸菌与人们生活紧密相关，具有抗氧化功能的乳酸菌可作为天然抗氧化剂，在体内摄入此类乳酸菌对机体或细胞的氧化应激具有显著的调节作用。许多乳酸菌都具有抗氧化的功能，然而大部分菌株抗逆性差，在不利的环境下，会降低其活性、活力等，不能确保其使用效果。
乳酸菌从生产加工过程到摄入机体消化道中会遇到各种各样的环境应力，如热胁迫、冷胁迫、酸胁迫、胆盐胁迫、氧胁迫、渗透压胁迫等。乳酸菌具有一定的耐受能力，为了应对各种胁迫，乳酸菌会产生一定的应激反应。当不利环境引起菌体内部失衡时，菌体为了保持细胞的稳定性，会调动各种机制来应对环境胁迫。
有研究表明，细菌的一种应激反应可以提高对另外一种或几种不利环境的耐受能力。这种现象打破了之前普遍认为的经受过一种胁迫处理损害的细胞对其他的胁迫更为敏感的认知。目前对乳酸菌的胁迫筛选，一般是正常生长到一定阶段，然后对细胞进行不同的单因素胁迫处理，然后测定筛选后的细胞在其他胁迫条件下的耐受力，最终获得综合抗逆性良好的菌株。此方法较为复杂，且不一定能获得目标菌体，也不能确保后续大生产放大的适配性。
因此，如何提供一种乳酸菌的制备方法，使其不仅可以简化综合抗逆性菌株的筛选方法，而且可以确保后期放大生产的可行性，成为目前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法及应用。采用本发明提供的制备方法提高了乳酸菌的抗氧化应激性能，通过在制备过程中进行多因素亚致死胁迫处理，筛选综合抗逆性良好的菌体，简化了现有技术中筛选综合抗逆性良好的乳酸菌菌株的方法，解决了乳酸菌应用范围小和使用功效不稳定的问题。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将经过活化的乳酸菌菌种于培养基中进行培养，得到种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在发酵稳定初期终止发酵，得到发酵液；
(3)将步骤(2)得到的发酵液离心，得到菌体；将菌体和缓冲液混合，得到菌悬液，然后对菌悬液进行冷应激处理，得到冷应激处理后的菌悬液；
其中，所述缓冲液中包括过氧化氢；
(4)将步骤(3)得到的冷应激处理后的菌悬液进行梯度稀释，将梯度稀释后得到的稀释菌液涂布在平板上进行培养，筛选典型菌落，得到菌体；
(5)将步骤(4)得到的菌体重复步骤(1)-(4)的操作，得到具有高抗氧化应激性能的乳酸菌。
在本发明中，所述乳酸菌包括植物乳杆菌和/或乳酸片球菌。
在本发明中，步骤(1)中，所述活化包括以下步骤：将-80℃保藏的菌种在 MRS平板上划线，37±1℃培养48-72h，挑选典型菌落，得到经过活化的乳酸菌菌种。
所述MRS平板的制备方法包括以下步骤：向MRS液体培养基添加琼脂，琼脂添加量为13-18g/L，灭菌后倒平板备用。MRS液体培养基的成分如下所述。
在本发明中，步骤(1)中，所述培养包括包括一级种子培养和二级种子培养，具体包括以下步骤：
(a)一级种子培养：将经过活化的乳酸菌菌种接种于装有MRS液体培养基的试管中，37±1℃培养10-20h(例如可以是10h、12h、14h、16h、18h、 20h等)，得到所述一级种子液。
(b)二级种子培养：将步骤(a)得到的一级种子液接种于装有MRS液体培养基的三角瓶中，37±1℃培养8-14h，得到二级种子液；所述接种的接种量为 2-6％(例如可以是2％、3％、4％、5％、6％等)。
在本发明中，步骤(1)中，所述培养基包括MRS液体培养基，所述培养的温度为37±1℃，所述培养的时间为8-14h(例如可以是8h、9h、10h、11h、 12h、13h、14h等)；
所述MRS液体培养基按质量浓度计包括以下组分：蛋白胨5-10g/L(例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等)、酵母浸粉5-10g/L(例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等)、牛肉膏5-10g/L(例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L等)、葡萄糖15-20g/L(例如可以是15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L等)、柠檬酸三铵2-5 g/L(例如可以是2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等)、乙酸钠2-3g/L(例如可以是 2g/L、2.2g/L、2.4g/L、2.6g/L、2.8g/L、3g/L等)、磷酸氢二钾2-5g/L(例如可以是2g/L、3g/L、4g/L、5g/L等)、硫酸镁0.2-0.5g/L(例如可以是0.2g/L、 0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L)、硫酸锰0.05-0.2g/L(例如可以是0.05g/L、0.07g/L、 0.09g/L、0.11g/L、0.13g/L、0.15g/L、0.17g/L、0.19g/L、0.2g/L等)和吐温-80 0.8-1.2g/L(例如可以是0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.1g/L、1.2g/L等)；所述MRS液体培养基的溶剂为水，所述MRS液体培养基的pH为6.4±0.2。
在本发明中，步骤(2)中，所述接种的接种量为2-6％(例如可以是2％、 3％、4％、5％、6％等)。
在本发明中，步骤(2)中，所述发酵培养基按质量浓度计包括以下组分：酪蛋白胨10-15g/L(例如可以是10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、15g/L 等)、酵母浸粉10-15g/L(例如可以是10g/L、11g/L、12g/L、13g/L、14g/L、 15g/L等)、葡萄糖5-10g/L(例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、 10g/L等)、麦芽糖14-18g/L(例如可以是14g/L、16g/L、16g/L、17g/L、18 g/L等)、柠檬酸三铵4-8g/L(例如可以是4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L 等)、乙酸钠4-6g/L(例如可以是4g/L、4.5g/L、5g/L、5.5g/L、6g/L等)、磷酸氢二钾5-8g/L(例如可以是5g/L、6g/L、7g/L、8g/L等)、硫酸镁0.2-0.6 g/L(例如可以是0.2g/L、0.3g/L、0.4g/L、0.5g/L、0.6g/L等)、硫酸锰0.1-0.3 g/L(例如可以是0.1g/L、0.15g/L、0.2g/L、0.25g/L、0.3g/L等)、吐温-80 0.8-1.2 g/L(例如可以是0.8g/L、0.9g/L、1g/L、1.1g/L、1.2g/L等)、猪胆盐0.01-0.02 g/L(例如可以是0.01g/L、0.013g/L、0.016g/L、0.019g/L、0.02g/L等)和氯化钠60-80g/L(例如可以是60g/L、63g/L、66g/L、69g/L、72g/L、75g/L、 78g/L、80g/L等)；所述发酵培养基的溶剂为水，pH自然。
在本发明中，步骤(2)中，所述发酵培养的条件为：接种前控制发酵培养基pH为4.5-5.5(例如可以是4.5、4.7、4.9、5.1、5.3、5.5等)，发酵过程中控制发酵培养基的pH为3.5-4.5(例如可以是3.5、3.7、3.9、4.1、4.3、4.5等)，发酵温度40-45℃(例如可以是40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃等)，发酵过程中搅拌速度为40-80r/min(例如可以是40r/min、50r/min、60r/min、 70r/min、80r/min等)，发酵至稳定初期降温至20℃以下。
通过提高发酵温度和发酵液渗透压、添加猪胆盐、降低发酵控制pH，获得耐热、耐酸、耐胆盐、耐渗透压的菌株。
在本发明中，步骤(3)中，所述离心的转速可以为6500rpm，时间可以为 15min。
在本发明中，步骤(3)中，所述缓冲液按质量浓度计包括以下组分：磷酸氢二钾6-10g/L(例如可以是6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L)、磷酸二氢钠6-10g/L(例如可以是6g/L、7g/L、8g/L、9g/L、10g/L)、氯化钠60-100g/L (例如可以是60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L)和过氧化氢20-40mg/L (例如可以是20mg/L、25mg/L、30mg/L、35mg/L、40mg/L)；所述菌体和缓冲液的质量比为1:(1-2)；其中，“1-2”可以是1、1.2、1.4、1.6、1.8、2等。
在本发明中，所述该缓冲液为含过氧化氢的高渗透压盐溶液，缓冲液是添加了过氧化氢的高盐体系且未添加保护剂。
在本发明中，步骤(3)中，所述冷应激处理包括以下步骤：将菌悬液在2-6℃预处理40-80min(例如可以是40min、50min、60min、70min、80min等)，然后在-85～-75℃冷冻2-4h(例如可以是2h、2.3h、2.6h、2.9h、3h、3.5h、4 h等)，之后在37±1℃放置直至菌悬液融化，如此往复3～6次(例如可以是3 次、4次、5次、6次等)。
反复冻融后能存活下来的是既抗冻、抗氧化应激又耐渗透压的菌体。
本发明通过在发酵过程中进行多因素亚致死胁迫处理，筛选综合抗逆性良好的菌体，简化了现有技术中筛选综合抗逆性良好的乳酸菌菌株的方法，解决了乳酸菌应用范围小和使用功效不稳定的问题。这些胁迫条件包括热胁迫、冷胁迫、酸胁迫、氧胁迫、胆盐胁迫、渗透压胁迫以及过氧化氢胁迫。
在本发明中，步骤(4)中，所述平板包括MRS平板，所述培养为有氧培养，所述有氧培养的温度为37±1℃，所述有氧培养的时间为48-72h。
最终在MRS平板上筛选得到耐热、耐酸、耐高渗透压、耐胆盐、抗冻、抗氧化应激性能好的菌体。
在本发明中，步骤(5)中，步骤(1)-(4)的重复次数为30-50次(例如可以是30次、35次、40次、45次、50次等)。
第二方面，本发明提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌菌粉，所述具有高抗氧化应激性能的乳酸菌菌粉是由包括以下步骤的制备方法制得的：将采用第一方面所述的制备方法制备得到的具有高抗氧化应激性能的乳酸菌继续培养，再依次经过离心、乳化和冻干得到具有高抗氧化应激性能的乳酸菌菌粉。
在本发明中，所述乳化包括以下步骤：将离心得到的菌体和保护剂按照质量比为1:(0.5-1.5)(其中，“0.5-1.5”可以是0.5、0.7、0.9、1.1、1.3、1.5等) 的比例混合，得到乳化液；所述保护剂按质量百分含量计包括海藻糖10-20％(例如可以是10％、12％、14％、16％、18％、20％等)、蔗糖2-5％(例如可以是2％、 3％、4％、5％等)、脱脂乳2-5％(例如可以是2％、3％、4％、5％等)、甘油 2-4％(例如可以是2％、3％、4％等)、谷氨酸钠2-4％(例如可以是2％、3％、 4％等)和抗环血酸0.5-1％(例如可以是0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、1％等)，所述保护剂的溶剂为水。
其中，所述继续培养包括二级种子扩增培养和发酵培养；所述二级种子扩增培养采用的培养基为MRS液体培养基，MRS液体培养基的组成同前所述。发酵培养的培养基的组分同前所述。
发酵培养的条件为：接种前控制发酵培养基的pH为6.6±0.2，发酵过程控制pH4.5-5.5(例如可以是4.5、4.7、4.9、5.1、5.3、5.5等)，发酵温度38±1℃，搅拌速度70-90r/min(例如可以是70r/min、80r/min、90r/min等)，发酵至稳定初期降温至20℃以下停止发酵。
其中，所述离心的转速可以为6500rpm，时间可以为15min。
本发明提供的具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法，通过在发酵过程中酸胁迫、热胁迫、胆盐胁迫及高渗透压胁迫处理技术，收集的菌体再经过渗透压胁迫、过氧化氢胁迫及低温冻融胁迫处理，然后经平板培养筛选典型菌落，以提高乳酸菌的综合抗逆性，从而提高了乳酸菌的抗氧化应激性能。
首先，通过提高发酵温度和发酵液渗透压、添加猪胆盐、降低发酵控制pH，获得耐热、耐酸、耐胆盐、耐渗透压的菌株。其次通过菌体与缓冲液混匀，菌悬液冷应激处理，缓冲液是添加了过氧化氢的高盐体系且未添加保护剂，反复冻融后能存活下来的是既抗冻、抗氧化应激又耐渗透压的菌体。最终在MRS平板上筛选得到耐热、耐酸、耐高渗透压、耐胆盐、抗冻、抗氧化应激性能好的菌体。
本发明通过热培养、酸培养、胆盐培养、高渗透压培养，冷应激、氧化应激、高渗透压应激筛选，提高了乳酸菌菌体的综合抗逆性，进而提高了乳酸菌的抗氧化应激性能，为其作为天然抗氧化剂并广泛应用于食品加工，提高相应产品的抗氧化能力，提供了可行性。
第三方面，本发明根据第一方面所述的制备方法制备得到的具有高抗氧化应激性能的乳酸菌或根据第二方面所述的具有高抗氧化应激性能的乳酸菌菌粉在制备具有高抗氧化益生菌产品中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
采用本发明提供的制备方法提高了乳酸菌的抗氧化应激性能，通过在制备过程中进行多因素亚致死胁迫处理，筛选综合抗逆性良好的菌体，简化了现有技术中筛选综合抗逆性良好的乳酸菌菌株的方法，解决了乳酸菌应用范围小和使用功效不稳定的问题。
附图说明
图1为实施例1、实施例4和对比例2提供的植物乳杆菌的菌粉在pH 2.0 条件下培养4h后的情况图。
图2为实施例1、实施例4和对比例2提供的植物乳杆菌的菌粉在0.15％胆盐浓度条件下培养4h后的情况图。
图3为实施例1、实施例4和对比例2提供的植物乳杆菌的菌粉在1.0mM 过氧化氢浓度条件下培养6h后的情况图。
图4为实施例1、实施例4和对比例2提供的植物乳杆菌的菌粉在不同NaCl 盐浓度的MRS培养基中的生长情况图。
图5为实施例13、实施例14和对比例4提供的乳酸片球菌的菌粉在pH 2.0 条件下培养4h后的情况图。
图6为实施例13、实施例14和对比例4提供的乳酸片球菌的菌粉在0.15％胆盐浓度条件下培养4h后的情况图。
图7为实施例13、实施例14和对比例4提供的乳酸片球菌的菌粉在1.0mM 过氧化氢浓度条件下培养6h后的情况图。
图8为实施例13、实施例14和对比例4提供的乳酸片球菌的菌粉在不同 NaCl盐浓度的MRS培养基中的生长情况图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
下述实施例中，所有菌株均由微康益生菌(苏州)股份有限公司提供，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
植物乳杆菌Lp90保藏编号为CGMCC No.10453，保藏日期为2015年01 月27日；拉丁文名称Lactobacillus plantarum，保藏该生物样本的单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
乳酸片球菌PA53保藏号为CGMCC No.18798，保藏日期为2019年11月 04日；拉丁文名称Pediococcus acidilactici，保藏该生物样本的单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号。
嗜热链球菌ST81保藏编号为CGMCC No.15752，保藏日期为2018年05 月11日；拉丁文名称Streptococcus thermophilus，保藏该生物样本的单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。
德氏乳杆菌保加利亚亚种LB42保藏编号为CGMCC No.15751，保藏日期为2018年05月11日；拉丁文名称Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus，保藏该生物样本的单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
鼠李糖乳杆菌GG ATCC53103分离自丹麦科汉森有限公司的菌粉。
实施例1
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：
将-80℃保藏的植物乳杆菌的菌种在MRS平板上划线，37℃培养48h，挑选平板典型菌落，得到菌株。
(2)将步骤(1)得到的典型菌落经过二级种子培养后进行发酵培养，二级种子培养和发酵培养分别为：
①一级种子培养：将步骤(1)得到的典型菌落接种于装有9mL MRS液体培养基的20mL试管中，38℃培养14h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以2％接种量接种到装有150mL MRS液体培养基的300mL三角瓶，38℃摇床培养10h，得到二级种子液；
③发酵培养：将二级种子液以2％接种量接种到装有3L发酵培养基的5L 发酵罐中，发酵培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养所用的MRS液体培养基，包括以下组分：蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、牛肉膏5g/L、葡萄糖15g/L、柠檬酸三铵2g/L、乙酸钠2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L和吐温-80 1g/L，溶剂为水，pH控制在6.4。
发酵培养基为改良MRS液体培养基，包括以下组分：酪蛋白胨15g/L、酵母浸粉10g/L、葡萄糖5g/L、麦芽糖18g/L、柠檬酸三铵4g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾5g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.1g/L、吐温-80 1g/L、猪胆盐0.015 g/L和氯化钠60g/L，溶剂为水，pH自然。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前控制发酵培养基pH调至5.3，发酵过程控制pH 4.0，发酵温度42℃，搅拌速度80r/min，发酵13h至稳定初期停止发酵，降温至20℃以下。
(3)离心重悬，冷应激处理：
①离心：将步骤(2)得到的发酵液6500rpm离心15min，收集菌体；
②菌体重悬：菌体和缓冲液按照质量1:1的比例混合均匀，制成菌悬液；
③冷应激处理：对菌悬液进行冷应激处理。
所述缓冲液包括以下组分：磷酸氢二钾8g/L、磷酸二氢钠8g/L、过氧化氢 27mg/L和氯化钠80g/L；溶剂为水。
所述的冷应激处理包括以下步骤：将菌悬液在4℃处理60min，-80℃冷冻 3h，然后37℃放置直至菌悬液融化，如此重复4次。
(4)菌体筛选：
将经冷应激处理后的菌悬液经过梯度稀释后，在MRS平板稀释涂布，37℃培养72h，筛选典型菌落，得到菌体。
(5)将步骤(4)得到的菌体重复50次步骤(2)-(4)的操作。
(6)将步骤(5)筛选得到的菌体进行二级种子扩培后发酵培养：
①一级种子培养：将平板单菌落接种至装有9mL MRS液体培养基的20mL 试管中，38℃培养14h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以2％接种量接种到装有150mL MRS液体培养基的300mL三角瓶，38℃培养9h，得到二级种子液；
③发酵培养：将二级种子液以2％接种量接种到装有4L发酵培养基的5L 发酵罐中，38℃培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养采用的MRS液体培养基的成分同步骤 (2)所述；发酵培养采用的发酵培养基的组分同步骤(2)所述。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前培养基pH调至6.6，发酵过程控制pH5.0，发酵温度38℃，搅拌速度80r/min，培养11h至稳定初期，降温至 20℃以下停止发酵。
(7)离心、乳化、冻干：
①离心：将步骤(6)得到的发酵液6500rpm离心15min，收集菌体；
②乳化：菌体与保护剂按照质量比1:1混合均匀，制成乳化液；
所述保护剂按质量百分含量计包括以下组分：海藻糖15％、蔗糖3％、脱脂乳2％、甘油3％、谷氨酸钠2％和抗环血酸0.5％，溶剂为纯水。
③冻干：将乳化液在冻干机中冻干，收集菌粉。
实施例2
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：
将-80℃保藏的植物乳杆菌的菌种在MRS平板上划线，37℃培养48h，挑选平板典型菌落，得到菌株。
(2)将步骤(1)得到的典型菌落经过二级种子培养后进行发酵培养，二级种子培养和发酵培养分别为：
①一级种子培养：将步骤(1)得到的典型菌落接种于装有9mL MRS液体培养基的20mL试管中，37℃培养16h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以4％接种量接种到装有150mL MRS液体培养基的300mL三角瓶，37℃摇床培养14h，得到二级种子液；
③发酵培养：将二级种子液以6％接种量接种到装有3L发酵培养基的5L 发酵罐中，发酵培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养所用的MRS液体培养基，包括以下组分：蛋白胨5g/L、酵母浸粉10g/L、牛肉膏8g/L、葡萄糖18g/L、柠檬酸三铵4g/L、乙酸钠3g/L、磷酸氢二钾3g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.15g/L和吐温-80 1.2g/L，溶剂为水，pH控制在6.4。
发酵培养基为改良MRS液体培养基，包括以下组分：酪蛋白胨13g/L、酵母浸粉14g/L、葡萄糖8g/L、麦芽糖15g/L、柠檬酸三铵7g/L、乙酸钠5.5g/L、磷酸氢二钾7g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.3g/L、吐温-80 1.1g/L、猪胆盐0.02 g/L和氯化钠70g/L，溶剂为水，pH自然。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前控制发酵培养基pH调至5.2，发酵过程控制pH 3.8，发酵温度43℃，搅拌速度70r/min，发酵14h至稳定初期停止发酵，降温至20℃以下。
(3)离心重悬，冷应激处理：
①离心：将步骤(2)得到的发酵液6500rpm离心15min，收集菌体；
②菌体重悬：菌体和缓冲液按照质量1:1.1的比例混合均匀，制成菌悬液；
③冷应激处理：对菌悬液进行冷应激处理。
所述缓冲液包括以下组分：磷酸氢二钾9g/L、磷酸二氢钠8.5g/L、过氧化氢30mg/L和氯化钠85g/L；溶剂为水。
所述的冷应激处理包括以下步骤：将菌悬液在4℃处理70min，-80℃冷冻 3.5h，然后37℃放置直至菌悬液融化，如此重复5次。
(4)菌体筛选：
将经冷应激处理后的菌悬液经过梯度稀释后，在MRS平板稀释涂布，37℃培养72h，筛选典型菌落，得到菌体。
(5)将步骤(4)得到的菌体重复45次步骤(2)-(4)的操作。
(6)将步骤(5)筛选得到的菌体进行二级种子扩培后发酵培养：
①一级种子培养：将平板单菌落接种至装有9mL MRS液体培养基的20mL 试管中，37℃培养16h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以4％接种量接种到装有150mL MRS液体培养基的300mL三角瓶，37℃培养10h，得到二级种子液；
③发酵培养：将二级种子液以4％接种量接种到装有4L发酵培养基的5L 发酵罐中，38℃培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养采用的MRS液体培养基的成分同步骤 (2)所述；发酵培养采用的发酵培养基的组分同步骤(2)所述。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前培养基pH调至6.6，发酵过程控制pH5.1，发酵温度38℃，搅拌速度85r/min，培养11.5h至稳定初期，降温至 20℃以下停止发酵。
(7)离心、乳化、冻干：
①离心：将步骤(6)得到的发酵液6500rpm离心15min，收集菌体；
②乳化：菌体与保护剂按照质量比1:1.2混合均匀，制成乳化液；
所述保护剂按质量百分含量计包括以下组分：海藻糖15％、蔗糖3％、脱脂乳3％、甘油4％、谷氨酸钠3％和抗环血酸1％，溶剂为纯水。
③冻干：将乳化液在冻干机中冻干，收集菌粉。
实施例3
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，所述植物乳杆菌菌粉的制备方法包括以下步骤：
(1)菌种活化：
将-80℃保藏的植物乳杆菌的菌种在MRS平板上划线，37℃培养48h，挑选平板典型菌落，得到菌株。
(2)将步骤(1)得到的典型菌落经过二级种子培养后进行发酵培养，二级种子培养和发酵培养分别为：
①一级种子培养：将步骤(1)得到的典型菌落接种于装有9mL MRS液体培养基的20mL试管中，37℃培养18h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以5％接种量接种到装有150mL MRS液体培养基的300mL三角瓶，38℃摇床培养12h，得到二级种子液；
③发酵培养：将二级种子液以5％接种量接种到装有3L发酵培养基的5L 发酵罐中，发酵培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养所用的MRS液体培养基，包括以下组分：蛋白胨7g/L、酵母浸粉7g/L、牛肉膏7g/L、葡萄糖17g/L、柠檬酸三铵4.5g/L、乙酸钠2.5g/L、磷酸氢二钾4g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.07g/L和吐温-80 0.9 g/L，溶剂为水，pH控制在6.4。
发酵培养基为改良MRS液体培养基，包括以下组分：酪蛋白胨14g/L、酵母浸粉13g/L、葡萄糖7g/L、麦芽糖17g/L、柠檬酸三铵5g/L、乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾6g/L、硫酸镁0.4g/L、硫酸锰0.2g/L、吐温-80 0.9g/L、猪胆盐0.015 g/L和氯化钠75g/L，溶剂为水，pH自然。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前控制发酵培养基pH调至5.3，发酵过程控制pH 3.7，发酵温度44℃，搅拌速度60r/min，发酵15h至稳定初期停止发酵，降温至20℃以下。
(3)离心重悬，冷应激处理：
①离心：将步骤(2)得到的发酵液6500rpm离心15min，收集菌体；
②菌体重悬：菌体和缓冲液按照质量1:1.2的比例混合均匀，制成菌悬液；
③冷应激处理：对菌悬液进行冷应激处理。
所述缓冲液包括以下组分：磷酸氢二钾8g/L、磷酸二氢钠7.5g/L、过氧化氢35mg/L和氯化钠90g/L；溶剂为水。
所述的冷应激处理包括以下步骤：将菌悬液在4℃处理60min，-80℃冷冻 4h，然后37℃放置直至菌悬液融化，如此重复6次。
(4)菌体筛选：
将经冷应激处理后的菌悬液经过梯度稀释后，在MRS平板稀释涂布，37℃培养72h，筛选典型菌落，得到菌体。
(5)将步骤(4)得到的菌体重复48次步骤(2)-(4)的操作。
(6)将步骤(5)筛选得到的菌体进行二级种子扩培后发酵培养：
①一级种子培养：将平板单菌落接种至装有9mL MRS液体培养基的20mL 试管中，37℃培养16h，得到一级种子液；
②二级种子培养：将一级种子液以4％接种量接种到装有150mL MRS液体培养基的300mL三角瓶，39℃培养10h，得到二级种子液；
③发酵培养：将二级种子液以4％接种量接种到装有4L发酵培养基的5L 发酵罐中，38℃培养，得到发酵液；
上述一级种子培养和二级种子培养采用的MRS液体培养基的成分同步骤(2)所述；发酵培养采用的发酵培养基的组分同步骤(2)所述。
上述发酵培养的条件相关控制点：接种前培养基pH调至6.6，发酵过程控制pH5.2，发酵温度38℃，搅拌速度75r/min，培养12h至稳定初期，降温至 20℃以下停止发酵。
(7)离心、乳化、冻干：
①离心：将步骤(6)得到的发酵液6500rpm离心15min，收集菌体；
②乳化：菌体与保护剂按照质量比1:1.3混合均匀，制成乳化液；
所述保护剂按质量百分含量计包括以下组分：海藻糖17％、蔗糖4％、脱脂乳5％、甘油2％、谷氨酸钠4％和抗环血酸0.6％，溶剂为纯水。
③冻干：将乳化液在冻干机中冻干，收集菌粉。
实施例4
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(5)中将步骤(4)得到的菌体重复30次步骤(2)-(4) 的操作，其他步骤同实施例1。
实施例5
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(5)中将步骤(4)得到的菌体重复20次步骤(2)-(4) 的操作，其他步骤同实施例1。
实施例6
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(5)中将步骤(4)得到的菌体重复60次步骤(2)-(4) 的操作，其他步骤同实施例1。
实施例7
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(2)中，发酵培养基中不含有猪胆盐，发酵培养基中其他组分含量保持不变，其他步骤同实施例1。
实施例8
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(2)中，发酵培养基中氯化钠的质量浓度减少至50g/L，发酵培养基中其他组分含量保持不变，其他步骤同实施例1。
实施例9
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(2)中，发酵培养基中氯化钠的质量浓度增加至110g/L，发酵培养基中其他组分含量保持不变，其他步骤同实施例1。
实施例10
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(2)中，发酵过程控制pH为5.0，其他步骤同实施例1。
实施例11
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(2)中，发酵培养中发酵温度38℃，其他步骤同实施例1。
实施例12
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸片球菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(1)中，将植物乳杆菌的菌种替换为乳酸片球菌的菌种，其他步骤同实施例1。
实施例13
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸片球菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(1)中，将植物乳杆菌的菌种替换为乳酸片球菌的菌种，并且步骤(5)中将步骤(4)得到的菌体重复30次步骤(2)-(4)的操作，其他步骤同实施例1。
实施例14
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸片球菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(1)中，将植物乳杆菌的菌种替换为乳酸片球菌的菌种，并且步骤(5)中将步骤(4)得到的菌体重复20次步骤(2)-(4)的操作，其他步骤同实施例1。
实施例15
本实施例提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸片球菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(1)中，将植物乳杆菌的菌种替换为乳酸片球菌的菌种，并且步骤(5)中将步骤(4)得到的菌体重复60次步骤(2)-(4)的操作，其他步骤同实施例1。
对比例1
本对比例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(3)中，缺少冷应激处理的步骤，其他步骤同实施例1。
对比例2
本对比例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，不经过(2)-(5)步骤，步骤(6)采用步骤(1)筛选得到的平板典型单菌落，其他步骤同实施例1。
对比例3
本对比例提供一种具有高抗氧化应激性能的植物乳杆菌菌粉，与实施例1 的区别仅在于，步骤(3)所述缓冲液中不包括过氧化氢，缓冲液中其他组分和和含量同实施例1，其他步骤同实施例1。
对比例4
本对比例提供一种具有高抗氧化应激性能的乳酸片球菌菌粉，与实施例12 的区别仅在于，不经过(2)-(5)步骤，步骤(6)采用步骤(1)筛选得到的平板典型单菌落，其他步骤同实施例1。
测试例1
抗氧化能力测试a
测试样本：实施例1-11和对比例1-3提供的植物乳杆菌的菌粉。
测试方法：将菌粉溶解于生理盐水制成菌悬液，稀释至109CFU/mL，以DPPH 自由基清除率和抗脂质氧化能力来评价抗氧化能力。以LGG菌粉为参照组。
DPPH自由基清除率测试方法：取2mL待测菌悬液，加入2mL DPPH溶液 (用无水乙醇溶解配制DPPH溶液，终浓度为0.4mmol/L)，混合均匀，然后置于室温避光反应30min，然后8000r/min离心10min，取上清部分，测定样品在波长517nm处的吸光度A样品，重复测定3次取平均值。空白组样品以等体积无水乙醇样品代替DPPH无水乙醇溶液，对照组以等体积生理盐水代替样品溶液，并以等体积生理盐水和无水乙醇混合液空白调零。清除率按以下公式计数：其中A对照为对照组吸光度，A样品为样品组吸光度，A空白为空白组吸光度。 DPPH清除率计算公式如下所示：
抗脂质氧化能力测试方法：0.1mL亚油酸和0.2mL吐温混合，纯水稀释至 20mL。0.5mL磷酸盐缓冲液、1mL亚油酸乳状液、0.2mL硫酸亚铁(0.01％， m/v)、0.02mL的抗坏血酸钠(0.01％，m/v)和0.4mL乳酸菌生理盐水菌悬液充分混合，37℃孵育12h，得到反应溶液。2mL上述反应溶液、0.2mL三氯乙酸(4％，m/v)、2mL硫代巴比妥酸(0.8％，m/v)和0.2mL二叔丁基对甲酚 (0.4％，m/v)充分混合，100℃条件下反应30min，然后冰上降温，加入2mL 丁醇进行提取。测定在532nm下测定提取液的吸光值；重复测定3次取平均值，空白组样品以等体积生理盐水代替乳酸菌生理盐水菌悬液。按照以下公式进行计算亚油酸过氧化抑制率：
亚油酸过氧化抑制率(％)＝(1-A样品/A空白)×100。
DPPH清除率测试结果和亚油酸过氧化抑制率测试结果如下表1所示：
表1
由上述表1数据可知，采用本发明提供的制备方法得到的乳酸菌具有优异的DPPH清除和脂质过氧化抑制能力。
通过实施例4和实施例5的对比可知，植物乳杆菌经过30次重复筛选后，菌粉抗氧化能力明显提高，与经过20次重复筛选后的菌粉相比，DPPH清除率和脂质过氧化抑制率分别提高了14％和13％。
通过实施例1和实施例6的对比可知，经过60次重复筛选获得的菌粉，其抗氧化能力与经过50次重复筛选获得的菌粉无明显差异。
通过实施例1和实施例7的对比可知，步骤(2)中，发酵培养基中不含有猪胆盐，会影响乳酸菌的抗氧化效果。
通过实施例1和实施例8-9的对比可知，步骤(2)中，发酵培养基中氯化钠的质量浓度过低或过高，会影响乳酸菌的抗氧化效果。
通过实施例1和实施例10-11的对比可知，步骤(2)发酵培养中不经过酸胁迫和热胁迫，会影响乳酸菌的抗氧化效果。
通过实施例1和对比例1的对比可知，步骤(3)中，缺少冷应激处理的步骤，会影响乳酸菌的抗氧化效果。
通过实施例1和对比例2的对比可知，植物乳杆菌经过50次重复筛选后，菌粉抗氧化能力与对比例1相比明显提高，DPPH清除率和脂质过氧化抑制率分别提高了23％和22％。
通过实施例1和对比例3的对比可知，步骤(3)所述缓冲液中不包括过氧化氢，菌粉抗氧化能力明显降低。
抗氧化能力测试b
测试样本：实施例1、实施例4-6和对比例2提供的植物乳杆菌(步骤(5) 得到植物乳杆菌)。
测试方法：将实施例1、实施例4-6和对比例2筛选出的菌种经过连续培养 50代后制备成菌粉，测定其抗氧化能力，测试方式同抗氧化能力测试a，测试结果如表2所示：
表2
样品 DPPH清除率(％) 亚油酸过氧化抑制率(％)
实施例1 74.23±2.75 69.23±2.7
实施例4 65.27±3.02 61.27±3.02
实施例5 55.03±2.61 52.03±2.61
实施例6 75.16±2.61 71.16±3.25
对比例2 53.12±1.58 50.12±2.04
LGG菌 55.05±2.01 55.15±1.67
；
由表2数据可知，重复筛选20次的菌种经50次传代后，菌种的抗氧化能力下降明显，菌种稳定性出现退化；筛选30、50、60次的抗氧化能力仍然提升明显，菌种具有良好的遗传稳定性。因此，重复筛选次数控制为30～50次，此范围菌种抗氧化能力提升明显且筛选后的种子具有良好的遗传稳定性。
抗氧化能力测试c
测试样本：实施例12-15和对比例4提供的乳酸片球菌的菌粉。
测试方法同抗氧化能力测试a，测试结果如表3所示：
表3
样品 DPPH清除率(％) 亚油酸过氧化抑制率(％)
实施例12 63.15±2.67 63.72±1.76
实施例13 59.30±2.05 60.19±2.12
实施例14 46.24±1.62 51.42±2.51
实施例15 64.02±2.04 64.11±2.03
对比例4 42.54±1.82 45.48±2.18
LGG菌 54.31±1.53 55.23±1.85
由表3数据可知，与对比例4相比，乳酸片球菌经重复筛选20次和30次的抗氧化能力均有提升，筛选30次提升明显，DPPH·清除率和脂质过氧化抑制率分别提高了39％和32％。
通过实施例12和实施例15的对比可知，与筛选50次相比，乳酸片球菌经重复筛选60次抗氧化能力提升不大。
测试例2
抗逆性测试a
测试样本：实施例1(筛选50次)、实施例4(筛选30次)和对比例2提供的植物乳杆菌的菌粉。
测试方法：以LGG菌粉为参照组。对测试样本中菌粉的耐酸、耐胆盐、耐过氧化氢、耐渗透压和耐高温性能进行测定。以下计数方法均参考 GB1789.35-2016，以Log(CFU/mL)表示菌体的数量，每组重复三次，取平均值。
耐酸能力测定：取菌粉溶于生理盐水，调整菌体浓度为109CFU/mL，用HCl 调节pH至2.0、2.5、3.0，37℃静置4h，分别于0、1、2、4h取样计数。菌体存活率如图1所示，在低pH(2.0)条件下经过4h的培养，4组菌的存活率均高于108CFU/mL，经过实施例1和实施例4制备的菌粉菌体存活率与对比例2 相比分别提高了45％和20％。
耐胆盐能力测定：将菌粉溶解于含有胆盐的生理盐水(胆盐质量分数0.05％、0.10％、0.15％)，调整菌体密度为109CFU/mL，37℃静置3h，分别于0、1、2、 3h取样计数。菌体存活率如图2所示，在高胆盐条件(胆盐浓度0.15％)下经过4h的培养，4组菌的存活率均高于107CFU/mL，经过实施例1和实施例4 制备的菌粉菌体存活率与对比例2相比分别提高了25％和10％。
耐过氧化氢能力测定：将菌粉溶解于含有0.8mM/L过氧化氢的生理盐水中，调整菌体密度为109CFU/mL，37℃静置6h，分别于0、2、4、6h取样计数。菌体存活率如图3所示，在0.8mM过氧化氢条件下经过6h的培养，4组菌的存活率均高于108CFU/mL，经过实施例1和实施例4筛选后制备的菌粉菌体存活率与对比例2相比分别提高了31％和19％。
耐渗透压能力测定：取菌粉接种于不同质量浓度的NaCl(20、40、60、80 和100g/L)的MRS液体培养基中，控制初始活菌数在同一水平(2×107CFU/mL)， 37℃培养16h，取培养液计数。菌体存活率如图4所示，在NaCl浓度低于6％时，四组菌体活菌数没有明显差异，当NaCl浓度超过6％时，对比例2和LGG 参照组受到抑制，活菌数下降明显，实施例1和实施例4呈增长趋势，活菌数均高于108CFU/mL。经过实施例1和实施例4筛选后制备的菌粉具有良好的耐高渗透压性能。
抗逆性测试b
测试样本：实施例13(筛选30次)、实施例14(筛选20次)和对比例4 提供的乳酸片球菌的菌粉。
测试方法同抗逆性测试a。
耐酸能力，菌体存活率如图5所示，在低pH条件下(pH2.0)经过4h的培养，4组菌的存活率均高于108CFU/mL，实施例13、实施例14的提供的植物乳酸片球菌的菌粉存活率与对比例4相比分别提高了36％和15％。
耐胆盐能力，菌体存活率如图6所示，在高胆盐条件下(胆盐浓度0.15％) 经过4h的培养，4组菌的存活率均高于107CFU/mL，实施例13、实施例14的提供的植物乳酸片球菌的菌粉存活率与对比例4相比分别提高了23％和9％。
耐过氧化氢能力，菌体存活率如图7所示，在0.8mM过氧化氢条件下经过 6h的培养，4组菌的存活率均高于108CFU/mL，实施例13、实施例14的提供的植物乳酸片球菌的菌粉存活率与对比例4相比分别提高了30％和14％。
耐高渗透压能力，菌体存活率如图8所示，在NaCl浓度低于4％时，四组菌体活菌数没有明显差异，当NaCl浓度超过4％时，对比例4和LGG参照组开始受到抑制，浓度越大，活菌数越低，而实施例13和实施例14呈增长趋势，活菌数均高于108CFU/mL，随着浓度升高活菌数增长减缓。实施例13、实施例 14的提供的植物乳酸片球菌的菌粉具有良好的耐高渗透压性能。
测试例3
酸奶品质和抗氧化能力测试
测试样品：实施例1(筛选50次)提供的植物乳杆菌菌种。
测试方法：将实施例1获得的植物乳杆菌菌种、嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种菌种分别接种至10％脱脂乳试管中，37℃条件下培养10h，转接3 次，作为发酵酸奶的发酵剂。
制备发酵乳的方法如下：在鲜牛乳中加入8％的蔗糖，搅拌均匀，100℃灭菌10min，降温至37℃备用；将准备好的植物乳杆菌、嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的脱脂乳试管，三者之间的比例为0:1:1和1:1:1的接种比例进行接种发酵，总接种量为5％。接种后鲜牛乳在42℃下进行发酵8h，将凝乳后的酸牛乳置于4℃冷藏14h后，得到所述的酸奶。每组重复3次，测定酸奶品质及酸奶抗氧化能力，测试结果见表4。
表4
从上述表4数据可以看出，植物乳杆菌联合嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌发酵酸奶时，凝乳时间略有延长，但仍在6h以内；对酸奶的酸度没有明显的影响，说明加入植物乳杆菌不会增加酸奶的酸度；酸奶的黏度、保水率、乙醛含量都有明显提升。酸奶清液的DPPH·清除率的结果显示，加入植物乳杆菌后酸奶的DPPH·清除率提高了19％，这说明植物乳杆菌的加入能显著提高酸奶的抗氧化能力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (7)

1.一种具有高抗氧化应激性能的乳酸菌的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将经过活化的乳酸菌菌种于培养基中进行培养，得到种子液；
(2)将步骤(1)得到的种子液接种于发酵培养基中进行发酵培养，在发酵稳定初期终止发酵，得到发酵液；
所述发酵培养基按质量浓度计包括以下组分：酪蛋白胨10-15g/L、酵母浸粉10-15g/L、葡萄糖5-10g/L、麦芽糖14-18g/L、柠檬酸三铵4-8g/L、乙酸钠4-6g/L、磷酸氢二钾5-8g/L、硫酸镁0.2-0.6g/L、硫酸锰0.1-0.3g/L、吐温-800.8-1.2g/L、猪胆盐0.01-0.02g/L和氯化钠60-80g/L；
所述发酵培养的条件为：接种前控制发酵培养基pH为4.5-5.5，发酵过程中控制发酵培养基的pH为3.5-4.5，发酵温度40-45℃，发酵过程中搅拌速度为40-80r/min，发酵至稳定初期降温至20℃以下；
(3)将步骤(2)得到的发酵液离心，得到菌体；将菌体和缓冲液混合，得到菌悬液，然后对菌悬液进行冷应激处理，得到冷应激处理后的菌悬液；
其中，所述缓冲液按质量浓度计包括以下组分：磷酸氢二钾6-10g/L、磷酸二氢钠6-10g/L、氯化钠60-100g/L和过氧化氢20-40mg/L；
(4)将步骤(3)得到的冷应激处理后的菌悬液进行梯度稀释，将梯度稀释后得到的稀释菌液涂布在平板上进行培养，筛选典型菌落，得到菌体；
所述冷应激处理包括以下步骤：将菌悬液在2-6℃预处理40-80min，然后在-85～-75℃冷冻2-4h，之后在37±1℃放置直至菌悬液融化，如此往复3～6次；
(5)将步骤(4)得到的菌体重复30-50次步骤(1)-(4)的操作，得到具有高抗氧化应激性能的乳酸菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述培养基包括MRS液体培养基，所述培养的温度为37±1℃。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基按质量浓度计包括以下组分：蛋白胨5-10g/L、酵母浸粉5-10g/L、牛肉膏5-10g/L、葡萄糖15-20g/L、柠檬酸三铵2-5g/L、乙酸钠2-3g/L、磷酸氢二钾2-5g/L、硫酸镁0.2-0.5g/L、硫酸锰0.05-0.2g/L和吐温-80 0.8-1.2g/L。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基的溶剂为水。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述MRS液体培养基的pH为6.4±0.2。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述发酵培养基的溶剂为水，pH自然。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述菌体和缓冲液的质量比为1:(1-2)。
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