CN116478839A - 一种开菲尔直投式发酵剂及其在羊奶粉中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种开菲尔直投式发酵剂及其在羊奶粉中的应用，以质量份数计，将15％的酿酒酵母6Y6、22.2％的乳酸乳球菌2C6、32.7％瑞士乳杆菌6171和30.1％的植物乳杆菌4M2复配得到开菲尔直投式发酵剂，实现开菲尔发酵剂和开菲尔的工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体属于一种开菲尔直投式发酵剂及其在羊奶粉中的应用。
背景技术
开菲尔是一种由牛羊乳中加入开菲尔粒发酵而成的，含有少量乙醇和二氧化碳的低热量发酵乳制品。开菲尔不同于其他发酵乳制品，它不仅是乳酸菌代谢活动的结果，其独特的风味归功于乳酸和酒精发酵的共同作用。开菲尔含有维生素B1、B2、B5和维生素C，并且开菲尔的维生素含量受牛奶和菌群的影响。除此之外开菲尔还含有维生素A、K和胡萝卜素。在矿物质含量方面，开菲尔是钙、镁、磷的良好来源。磷是人体中含量第二丰富的矿物质，有助于碳水化合物、脂肪和蛋白质的利用，以促进细胞生长、维持和提供能量。
生产开非尔的天然发酵剂是开非尔粒，由多种细菌、醋酸菌和酵母组成。目前，对开菲尔发酵剂的研发还不够成熟，大多数开菲尔的生产依然依赖天然开菲尔粒的发酵。但在工业规模上，由于开菲尔粒生长缓慢、应用复杂、可再生性差、成本高等原因无法扩大生产。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种开菲尔直投式发酵剂及其在羊奶粉中的应用，将酿酒酵母6Y6、乳酸乳球菌2C6、瑞士乳杆菌6171和植物乳杆菌4M2进行复配，优化确定各菌粉配比，获得开菲尔直投式发酵剂，便于工业化生产开菲尔发酵剂，也便于生产开菲尔。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种开菲尔直投式发酵剂，以质量份数计，包括15％～30％的酿酒酵母6Y6、2％～40.8％的乳酸乳球菌2C、65.6％～54.5％瑞士乳杆菌6171和11.4％～62.3％的植物乳杆菌4M2。
一种开菲尔直投式发酵剂的应用，将开菲尔直投式发酵剂和羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合得到发酵型开菲尔羊奶粉。
一种功能性开菲尔直投式发酵剂，以质量分数计，包括50％～70％权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、10％～40％的保加利亚乳杆菌LB6和10％～30％的植物乳杆菌L60。
一种功能性开菲尔直投式发酵剂，以质量分数计，包括55.3％的权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、16.3％的保加利亚乳杆菌LB6、28.4％的植物乳杆菌L60。
一种功能性开菲尔直投式发酵剂的应用，将包含保加利亚乳杆菌LB6和植物乳杆菌L60的功能性开菲尔直投式发酵剂和羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合得到发酵型开菲尔羊奶粉。
一种功能性开菲尔直投式发酵剂，以质量分数计，包括50％～65％权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、10％～30％的罗伊氏乳杆菌L49和10％～30％的发酵乳杆菌B62。
一种功能性开菲尔直投式发酵剂，以质量分数计，包括50.1％权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、25.5％罗伊氏乳杆菌L49、24.4％发酵乳杆菌B62。
一种功能性开菲尔直投式发酵剂的应用，将包含罗伊氏乳杆菌L49和发酵乳杆菌B62的功能性开菲尔直投式发酵剂和羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合得到发酵型开菲尔羊奶粉。
一种发酵型开菲尔羊奶粉，将上述开菲尔直投式发酵剂、包含保加利亚乳杆菌LB6和植物乳杆菌L60的功能性开菲尔直投式发酵剂或包含罗伊氏乳杆菌L49和发酵乳杆菌B62的功能性开菲尔直投式发酵剂与羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合，混合时间为10min～15min，转速为10rpm～16rpm。
一种开菲尔羊乳，将上述发酵型开菲尔羊奶粉按1:6～1:8复水后在24℃～28℃发酵16h～20h得到。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供一种开菲尔直投式发酵剂，将酿酒酵母6Y6、乳酸乳球菌2C6、瑞士乳杆菌6171和植物乳杆菌4M2进行复配，优化确定各菌粉配比，获得开菲尔直投式发酵剂，解决了开菲尔工业化生产的难题，同时将得到的开菲尔直投式发酵剂进一步与产胞外多糖、γ-氨基丁酸、抗氧化肽和ACE抑制肽的乳酸菌复配，得到功能性开菲尔直投式发酵剂。
将上述开菲尔直投式发酵剂添加到羊奶粉中开发了发酵型开菲尔羊奶粉，羊奶粉中添加的乳酸菌和酵母菌可以调节肠道菌群平衡，将其复水后用家用酸奶机发酵即可制得开菲尔羊乳，发酵后乳酸菌和酵母数量增加，同时将羊乳中的乳糖转化为乳酸菌和合成维生素等对人体有益的成分，乳糖含量降低可避免消费者出现乳糖不耐症，同时其富含胞外多糖和γ-氨基丁酸，或富含抗氧肽和ACE抑制肽，具有抗氧化和改善睡眠，或降血压和抗衰老的功效。
附图说明
图1瑞士乳杆菌、乳酸乳球菌和酵母菌菌粉的配比对5个响应值的影响；
图2添加保加利亚乳杆菌LB6和植物乳杆菌L60的功能性开菲尔直投式发酵剂；
图3添加罗伊氏乳杆菌L49和发酵乳杆菌B62的功能性开菲尔直投式发酵剂；
图4各菌株胆盐耐受性结果图；
图5天然开菲尔粒(X1～X6)与本发明制备的产抗氧化肽和ACE抑制肽的直投式发酵剂(DVS)发酵所得羊乳开菲尔的ACE抑制率和DPPH自由基清除率比较。
图6胞外多糖标准曲线；
图7γ-氨基丁酸标准曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
本发明提供一种开菲尔直投式发酵剂，以质量份数计，包括15％～30％的酿酒酵母6Y6、2％～40.8％的乳酸乳球菌2C6、5.6％～54.5％瑞士乳杆菌6171和11.4％～62.3％的植物乳杆菌4M2。
优选的，一种开菲尔直投式发酵剂，以质量份数计，包括15％的酿酒酵母、22.2％的乳酸乳球菌、32.7％瑞士乳杆菌和30.1％的植物乳杆菌；
本发明还提供一种功能性开菲尔直投式发酵剂，以质量分数计，包括50％～70％的开菲尔直投式发酵剂、10％～40％的保加利亚乳杆菌LB6和10％～30％的植物乳杆菌L60；
优选的，以质量分数计，功能性开菲尔直投式发酵剂包括55.3％的开菲尔直投式发酵剂、16.3％的保加利亚乳杆菌LB6、28.4％的植物乳杆菌L60，保加利亚乳杆菌LB6可产生ACE抑制肽实现降血压的功效，植物乳杆菌L60可产生抗氧化肽实现衰老的功效；
本发明还提供一种功能性开菲尔直投式发酵剂，以质量分数计，包括50％～65％开菲尔直投式发酵剂、10％～30％罗伊氏乳杆菌L49和10％～30％发酵乳杆菌B62；
优选的，以质量分数计，功能性开菲尔直投式发酵剂包括50.1％开菲尔直投式发酵剂、25.5％罗伊氏乳杆菌L49、24.4％发酵乳杆菌B62，罗伊氏乳杆菌L49可产生γ-氨基丁酸实现改善的功效，植物乳杆菌L60可产生胞外多糖实现抗氧化的功效；
保加利亚乳杆菌LB6、植物乳杆菌L60、罗伊氏乳杆菌L49和发酵乳杆菌B62均由陕西科技大学1C-419实验室提供。
本发明还提供一种发酵型开菲尔羊奶粉，将上述开菲尔直投式发酵剂或两种功能性开菲尔直投式发酵剂之一与羊奶粉按照质量比1:(100～200)在无菌条件下采用三维混合机混合而成，混合时间为10min～15min，转速为10rpm～16rpm混合得到。
将添加开菲尔直投式发酵剂的发酵型开菲尔羊奶粉按质量比1:6～1:8复水后于24～28℃发酵16h～20h得到开菲尔羊乳，所得开菲尔羊乳的pH值为3.85～4.85，乙醇含量为1167～1622(μg/g)，感官评价为65.21～85.17。
将添加保加利亚乳杆菌LB6和植物乳杆菌L60的功能性开菲尔直投式发酵剂与羊奶粉混合得到发酵型开菲尔羊奶粉，按质量比1:6～1:8复水后后于24～28℃发酵16h～20h得到开菲尔羊乳，所得开菲尔羊乳的pH值为4.39～4.56，ACE抑制率为66.28％～83.81％，DPPH值自由基清除率为71.33～85.33％，总还原力为0.388～0.782，感官评价为65.92～82.05分。
将添加罗伊氏乳杆菌L49和发酵乳杆菌B62的功能性开菲尔直投式发酵剂与羊奶粉混合得到发酵型开菲尔羊奶粉，按质量比1:6～1:8复水后于24℃～28℃发酵16h～20h得到，所得发酵羊乳的酸度为80.45°T～90.25°T，胞外多糖19.84mg/L～25.21mg/L，氨基丁酸为10.84mg/100mL～22.61mg/100mL，感官评价为65.36～83.01分。
1.通过比较发酵特性确定开菲尔直投式发酵剂所用菌株：
采用酿酒酵母、乳酸乳球菌、瑞士乳杆菌、植物乳杆菌复配得到开菲尔直投式发酵剂。
乳酸菌株：植物乳杆菌1C4、4M2、1C5，瑞士乳杆菌1E1、6171，保加利亚乳杆菌2M2、2M5，乳酸乳球菌2C2、2E3、2C6，鼠李糖乳杆菌2E5、3M5，嗜酸乳杆菌3C5，干酪乳杆菌3E3、C1、C2，罗伊氏乳杆菌4171、5E1，发酵乳杆菌5172
植物乳杆菌1C4和4M2分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 6010、6027；植物乳杆菌1C5分离自美国典型培养物保藏中心菌株ATCC 8014，瑞士乳杆菌1E1、6171分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 6024、24940，保加利亚乳杆菌2M2、2M5分离自美国典型培养物保藏中心菌株ATCC 8001、7517，乳酸乳球菌2C2、2E3、2C6分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 6029、6033、22861，鼠李糖乳杆菌2E5分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 20255，鼠李糖乳杆菌3M5分离自美国典型培养物保藏中心菌株ATCC 7649，嗜酸乳杆菌3C5分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 6005，干酪乳杆菌3E3、C1、C2分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 23494、22813、20284，罗伊氏乳杆菌4171、5E1分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 6118、6120，发酵乳杆菌5172分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 22821。
酵母菌株：马克斯克鲁维酵母1Y1、2Y4、2Y5、3Y3，酿酒酵母5Y2、6Y1、6Y6、4Y1
马克斯克鲁维酵母1Y1、2Y4、2Y5、3Y3分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 1783、1953、32414、1911，酿酒酵母5Y2、6Y1、6Y6、4Y1分离自中国工业微生物菌种保藏中心菌株CICC 33384、32409、32415、32431。
将已活化的上述乳酸菌和酵母菌菌悬液以5％的接种量接入灭菌后复原羊乳中发酵，测定乳酸菌发酵羊乳的持水力、蛋白水解度和pH，酵母发酵羊乳的蛋白质水解度，结果分别见表1和表2。
表1乳酸菌发酵羊乳的pH、持水力和蛋白水解度测定结果
持水能力越低说明发酵乳的粘稠度越低，发酵乳的口感和质地也就越差。本试验中发酵乳的持水力范围为9.58％～35.52％之间，其中持水力最高的菌株为3E3，持水力为35.52％。有研究发现胞外多糖的产生可以增加发酵乳的持水力，因为胞外多糖在某些菌株中具有较高的水结合能力。在发酵过程中，随着微生物活性和数量的增加，胞外多糖的产量大幅度增加，因此在发酵后期，当开菲尔粒充分活化时，开菲尔会有较高的持水力。
研究结果表明，开菲尔中的微生物能够水解牛奶中的蛋白质和肽。在初筛过程中菌株4M2的蛋白水解最高，为(71.92±0.46)％。水解后的肽很可能被细胞外的开菲尔微生物蛋白酶进一步水解或被开菲尔微生物吸收。
表2不同酵母菌发酵羊乳的蛋白水解度比较
在酵母菌发酵的过程中，羊乳中的蛋白质被水解，利于人体消化吸收，其中，6Y6的蛋白水解度最高，为(53.78±0.22)％，具有很好的蛋白水解性能，将蛋白水解度＞35的酿酒酵母菌株进一步筛选。
酿酒酵母产醇比较
取0.1mL稀释后的菌悬液涂布于YPD培养基或PDA培养基上，28℃培养48h后倒入TTC培养基将菌落覆盖，继续培养，分别在1h、3h和6h观察并记录培养基颜色变化情况。酵母菌在开菲尔发酵过程中的主要作用是产生乙醇，从而使得开菲尔具有特殊的风味。因此将酵母菌的产醇能力作为一个筛选指标，如表3所示，菌株2Y5、3Y3、6Y6的产醇性能较好。
表3酵母菌产醇试验结果
注：+数量代表颜色程度。+越多，代表颜色越重。
耐酸性
将初筛得到的酵母菌和乳酸菌分别接入调节好pH的肉汤培养基中，在28℃和37℃培养4h后测定活菌数，结果如表4所示。
表4乳酸菌和酵母菌的活菌数测定结果
一般来说，菌株在pH为3的环境中消化3h后的存活情况作为菌株的耐酸指标。如上表所示，所有菌株对酸性环境都有一定的耐受性，不同菌株间的酸耐受性具有显著性差异(p>0.05)；其中菌株2C6、2Y5、3E3、4M2、5E1、6171、6Y6对酸的耐受性相对较好，经过4h的消化之后活菌数均能达到108数量级，菌株1Y1、2Y4、3C5、C2、6Y1对酸的耐受性相对较差，经4h的消化后活菌数只能达到105数量级。
胆盐耐受性
乳酸菌和酵母菌在胆盐环境中的生长速率会受到抑制。人体小肠内部的胆盐浓度较高，因此要筛选耐胆盐的菌株进行后续发酵剂的制备，根据耐酸性筛选获得的乳酸菌和酵母菌的胆盐耐受性结果如图4所示。
由图4可知，菌株2C6、4M2、6171、6Y6表现出较好的胆盐耐受性，在胆盐含量为0.1％、0.2％、0.3％的环境中生长滞后时间均为1h、2h、4h，菌株5E1的滞后时间为3h。
根据以上试验，确定将瑞士乳杆菌6171、植物乳杆菌4M2、乳酸乳球菌2C6、酿酒酵母6Y6用作开菲尔直投式发酵剂菌株。
将筛选出来的发酵性能较好的菌株进行扩大培养后，添加冻干保护剂进行真空冷冻干燥，获得冻干菌粉。经活菌数测定，瑞士乳杆菌6171的活菌数为(3.06±0.13)×1011CFU/g、植物乳杆菌4M2的活菌数为(4.57±0.64)×1011CFU/g、乳酸乳球菌2C6的活菌数为(2.86±0.73)×1011CFU/g、酿酒酵母6Y6的活菌数为(9.84±0.55)×1010CFU/g。
2.开菲尔直投式发酵剂配方优化
利用实验设计软件中的D-Optional法，以乙醇含量、酸度、感官评价、酵母菌数和乳酸菌数为指标，对由四种菌粉(A：酿酒酵母6Y6、B：乳酸乳球菌2C6、C：瑞士乳杆菌6171、D：植物乳杆菌4M2)组成的开菲尔发酵剂配方进行优化。
为了使得开菲尔发酵剂能保持一定的起泡性和乙醇含量，并且可以获得更高的乳酸菌含量和感官评价，将酵母菌菌粉的添加范围设置在0.15～0.3之间，将三种乳酸菌菌粉的添加范围均设置在0～0.8之间。混料试验设计结果见表5所示。
表5开菲尔发酵剂的混料试验设计及结果
利用设计专家软件对表中的响应值进行二次多项式拟合，分别建立5个指标的回归模型，Y1为乙醇含量，Y2为酸度，Y3为感官评价，Y4为酵母菌含量，Y5为乳酸菌含量，各回归模型方程如下：
Y1＝1310.77A+1019.94B+1166.99C+1124.19D+2069.84AB+907.12AC-463.21AD+148.46BC+731.84BD-172.56CD
Y2＝168.43A+92.25B+89.28C+82.41D-233.19AB-217.92AC-185.69AD+22.02B
C+45.24BD+27.71CD
Y3＝1164.54A+55.48B+36.66C+45.38D-1337.02AB-1370.68AC-1204.57AD+93.84BC+45.39BD+131.04CD
Y4＝55.25A+6.67B+4.64C+5.86D+94.81AB+98.49AC+100.06AD+4.31BC-1.85BD-1.15CD
Y5＝25.17A+5.62B+8.13C+7.82D-38.85AB-53.37AC-54.46AD+8.69BC+8.59BD+8.37CD
进行方差分析，响应值乙醇含量、酸度、感官评价、酵母菌数和乳酸菌数的回归方程模型的p值均小于0.05，说明模型显著；失拟项均大于0.05，失拟项不显著，则该模型可用于分析和预测乙醇含量、酸度、感官评价、酵母菌数和乳酸菌数的结果。
由方差分析结果可见，对五个响应值影响较大的分别为酵母菌、乳球菌和瑞士乳杆菌。因此确定植物乳杆菌的添加量后，研究酵母菌、乳酸乳球菌和瑞士乳杆菌菌粉添加量的变化对各响应值的影响，具体变化如图1所示：
在4种菌的添加范围之内，要求感官评价不低于60分，其他指标都在试验所得范围内，根据试验设计软件获得各菌株添加范围为：酿酒酵母15％～30％、乳酸乳球菌2％～40.8％、瑞士乳杆菌5.6％～54.5％、植物乳杆菌11.4％～62.3％。
优选的，要求感官评价和乳酸菌数达到最大值，乙醇含量、酸度和酵母菌数均在目标范围之内，得出开菲尔发酵剂的配方。根据设计实验软件优化得到的最佳配方为：酿酒酵母15％、乳酸乳球菌22.2％、瑞士乳杆菌32.7％、植物乳杆菌30.1％，以此比例复配开菲尔发酵剂的可行性达到96.7％。按照该配方，以5‰的接种量经过25℃发酵22h，预测乙醇含量为1172.54μg/mL、酸度为97.79°T、感官评价76.14、酵母菌数为5.17×107CFU/mL、乳酸菌数为1.017×109CFU/mL。基于混料实验结果设计验证试验，共进行3组实验。经检测得到羊乳开菲尔中乙醇含量为1171.08±0.71μg/mL，酸度为96.73±0.67°T，感官评价75.21±0.55，酵母菌数为(5.21±0.43)×107CFU/mL，乳酸菌数为(9.48±0.73)×108CFU/mL。验证结果与预测值无显著差异，这表明该混料试验优化的开菲尔发酵剂配方是可用的。
3.产降压肽和抗氧化肽开菲尔直投式发酵剂配方优化
利用实验设计软件中的D-Optional法，以酸度、ACE抑制率、DPPH值自由基清除率、总还原力、感官评价为指标，对A：开菲尔直投式发酵剂、B:保加利亚乳杆菌LB6、C:植物乳杆菌L60组成的开菲尔直投式发酵剂配方进行优化，混料试验设计结果见表6所示:
表6产降压肽和抗氧化肽开菲尔直投式发酵剂的混料试验设计及结果
经方差分析得到，开菲尔直投式发酵剂和LB6之间的交互作用对pH值影响最大；LB6和L60之间的相互作用也会对发酵乳的pH值产生影响；开菲尔直投式发酵剂和L60的交互作用对pH值的影响不明显。
开菲尔直投式发酵剂和L60之间的相互作用对ACE抑制肽的产量影响极大；LB6和L60之间的相互作用也会影响ACE抑制肽的产量。
发酵乳的DPPH值自由基清除率受开菲尔直投式发酵剂和L60交互作用的影响极大；LB6和L60之间的相互作用会影响发酵乳的DPPH值自由基清除率。
发酵乳的感官评价受开菲尔直投式发酵剂和L60交互作用的影响极大；LB6和L60之间的相互作用会对发酵乳风味产生一定影响。
在3种组分的添加范围之内，要求pH值、ACE抑制率、DPPH值自由基清除率、总还原力均在试验结果范围内，感官评价≥65，得到产降压肽和抗氧化肽开菲尔直投式发酵剂配比为：50％～70％的开菲尔直投式发酵剂、10％～40％的保加利亚乳杆菌LB6、10％～30％的植物乳杆菌L60
对其进一步优选，要求pH值达到4.5，ACE抑制率、DPPH值自由基清除率、总还原力和感官评价达到最大值，得出开菲尔直投式发酵剂的配方。利用软件优化得到最优配方，可行度为75.5％，因此选择该组配方进行后续的验证试验。按照优化后的配比(开菲尔直投式发酵剂55.3％、LB61 6.3％、L60 28.4％)将菌粉与羊奶粉以1：100的比例混匀，按照1：8的比例复水后于26℃发酵19h，测定各项指标。试验结果，表明pH值为4.51±0.01，ACE抑制率为(71.91±0.83)％，DPPH值自由基清除率为(77.03±0.63)％，总还原力为(0.67±0.03)，感官评价为(77.54±0.39)，预测值的pH值为4.50，ACE抑制率为72.86％，DPPH值自由基清除率为77.85％，总还原力为0.668，感官评价为76.13，预测值和实际值无显著性差异，因此最终选取开菲尔直投式发酵剂55.3％、LB616.3％、L6028.4％为抗氧化和产降压肽的开菲尔发酵剂的最优配方。
与开菲尔直投式发酵剂制备的开菲尔羊乳中的ACE抑制率和DPPH值自由基清除率相比分别提高29.15％和32.97％，
将6种乳开菲尔粒X1～X6与自制的产降压肽和抗氧化肽开菲尔直投式发酵剂(DVS)结果进行比较，如图5所示，产降压肽和抗氧化肽开菲尔直投式发酵剂与天然开菲尔中最高ACE抑制率和DPPH值自由基清除率相比分别提高了21.03％和31.9％。其中天然开菲尔粒X1购自江苏无锡的升悅晋店铺，X2购自山东德州的西藏林芝天然雪莲菌店铺，X3购自上海的小颖的菌屋店铺，X4购自内蒙古巴彦淖尔的巴盟后生特产店铺，X5购自辽宁抚顺的三餐一席店铺，X6购自辽宁大连的肥皂铺子店铺；
4.产胞外多糖和γ-氨基丁酸开菲尔直投式发酵剂优化
利用实验设计软件中的D-Optional法，以酸度、胞外多糖、氨基丁酸和感官评价为指标，对由三种菌粉(A：开菲尔直投式发酵剂、B：发酵乳杆菌B62、C：罗伊氏乳杆菌L49)组成的菌粉B配方进行优化。为了使得菌粉B，将开菲尔直投式发酵剂的添加范围设置在0.5～0.8之间，将发酵乳杆菌B62和罗伊氏乳杆菌L49的添加范围均设置在0.1～0.4之间，混料试验设计结果见表7所示：
表7产胞外多糖和γ-氨基丁酸开菲尔直投式发酵剂的混料试验设计及结果
各响应值回归方程如下：
Y1＝85.40A+79.69B+86.68C+15.43AB-17.04AC-4.59BC
Y2＝20.32A+21.00B+24.98C-1.52AB+3.03AC+2.86BC
Y3＝10.99A+23.01B+13.03C-6.52AB+2.41AC+3.25BC
Y4＝53.10A+63.85B+64.64C+56.81AB+76.24AC+44.82BC
进行方差分析得到，响应值酸度、胞外多糖、氨基丁酸和感官评价的回归方程模型p值均小于0.05，说明模型显著；失拟项均大于0.05，失拟项不显著，说明该模型可用于分析响应值酸度、胞外多糖、氨基丁酸和感官评价的结果。
对于响应值酸度来说，AB的p值<0.05，说明菌粉A与发酵乳杆菌B62对发酵乳的酸度有影响，AC的p值<0.01，说明菌粉A与罗伊氏乳杆菌L49对功能性发酵乳的酸度有较大影响。对响应值胞外多糖来说，由p检验可知，交互项AC的p值<0.01，说明AC之间的交互作用非常显著，即菌粉A和B62的相互作用对发酵羊乳产胞外多糖的影响较大。BC的p值<0.05，则BC之间的交互作用显著，B62和L49的相互作用对胞外多糖的产量也有一定的影响。于响应值氨基丁酸而言，交互项AB的p值<0.01，说明AB之间的交互作用非常显著，即菌粉A和L49的相互作用对功能性发酵羊乳的氨基丁酸含量有较大影响，其余交互系数均大于0.05，说明它们的交互作用对氨基丁酸的产量影响较小。对响应值感官评价来说，交互项AC的p值<0.01，说明AC之间的交互作用非常显著，交互项AB、BC的p值均小于0.05，说明AB、BC的交互作用显著，即菌粉A和L49、B62和L49的相互作用也会对功能性发酵羊乳感官评价产生影响。
在3种组分的添加范围之内，要求感官评价≥65分，酸度，胞外多糖、氨基丁酸和感官评价在试验所得值的范围内，利用软件优化得到产胞外多糖和γ-氨基丁酸开菲尔直投式发酵剂配方为：50～65％开菲尔直投式发酵剂、10～30％罗伊氏乳杆菌L49和10～30％发酵乳杆菌B62，将其与羊奶粉按照质量比1:200～1:100在无菌条件下采用三维混合机混合，混合时间为10～15min，转速为10～16rpm混合得到开菲尔羊奶粉，再按照1:25g复水到200ml后于24～28℃发酵16～20h得到，所得发酵羊乳的酸度为80.45°T～90.25°T，胞外多糖19.84～25.21mg/L，氨基丁酸为10.84～22.61mg/100mL，感官评价为65.36～83.01分
优化地，要求胞外多糖、氨基丁酸和感官评价均达到最大值，酸度在试验范围内，得到最优配方为：基础发酵剂50.1％、罗伊氏乳杆菌L49 25.5％、B62 24.4％，按照最优配方将菌粉与羊奶粉以1：100的比例混匀，按照1：8的比例复水后于26℃发酵19h，测定各项指标。
结果表明，酸度为(82.08±0.36)°T，胞外多糖(22.98±0.21)mg/L，氨基丁酸为(18.37±0.43)mg/100mL，感官评价为(75.54±0.19)，预测值酸度为81.92°T，胞外多糖23.64mg/L，氨基丁酸为18.99mg/100mL，感官评价为75.42，预测值和实际值无显著性差异，因此最终选取菌粉A50.1％、L49 25.5％、B62 24.4％为产胞外多糖和氨基丁酸的功能性开菲尔发酵剂的最佳配方，其中，γ-氨基丁酸的含量符合国家标准。胞外多糖的含量与开菲尔直投式发酵剂制备的开菲尔羊乳相比，提高了52.39％，配方羊奶粉发酵后的质地比天然开菲尔的质地更加细腻。
5.功能性开菲尔羊奶粉贮存稳定性考察
将优化获得的两种功能性开菲尔发酵剂分别与羊奶粉在无菌条件下混合，即得开菲尔羊奶粉，采用加速试验在45℃、50℃、55℃下测定活菌数，预测样品分别在4℃和25℃的保存时间，其中产降压肽和抗氧化肽开菲尔羊奶粉的初始活菌数为7.76×109CFU/g，各温度下的失活速率常数为：k45＝0.0208(R2＝0.9927)、k50＝0.034(R2＝0.996)、k55＝0.0477(R2＝0.9961)；产胞外多糖和γ-氨基丁酸开菲尔羊奶粉的初始活菌数为6.866×109CFU/g，各温度下的失活速率常数为：k45＝0.0238(R2＝0.9955)、k50＝0.0422(R2＝0.9927)、k55＝0.0546(R2＝0.9919)。
如图2所示，根据Arrhenius方程y＝-3470.3x+9.2455得开菲尔羊奶粉在4℃、25℃下菌体失活速率常数k4值为5.36×10-4，k25值为4.05×10-3，以指标要求的最低活菌数106CFU/g为最终值，以一级动力学反应方程预测产降压肽和抗氧化肽开菲尔羊奶粉的保质期，其在4℃、25℃下保存时间分别为302天和40天。
如图3所示，根据Arrhenius方程y＝-3768.x+10.249得开菲尔羊奶粉在4℃、25℃下菌体失活速率常数k4值为5.84×10-4，k25值为4.21×10-3，以指标要求的最低活菌数106CFU/g为最终值，以一级动力学反应方程预测产胞外多糖和γ-氨基丁酸。
本发明相关参数测定的方法如下：
发酵羊乳pH值测定，采用PH值S-3CpH值计，于室温下测定发酵乳的pH值，每组样品设置3个平行试验。
酸度测定，参照GB5009.239 -2016食品安全国家标准：食品酸度的测定。
DPPH值自由基清除率测定，参照ZENG W C,ZHANG Z,GAO H,etal.Characterization of antioxidant polysaccharides from Auricularia auricularusing microwave-assisted extraction[J].Carbohydrate Polymers,2012,89(2):694-700的方法。
总还原力的测定，参照DAMIEN D H J,OLIVER B,MüBERRA K,et al.Antioxidantproperties of aqueous extracts from selected lamiaceae species grown inTurkey.[J].Journal of agricultural and food chemistry,2004,52(4):762-770的方法。
发酵羊乳ACE抑制活性体外测定，按表8所示进行试验，37℃反应半小时后加入1mol/L HCl，然后向试管中加入1.7mL的乙酸乙酯，充分混合后静置5min，吸取1mL乙酸乙酯层溶液，烘干，再将其重新溶解于去离子水中，于波长228nm处测定吸光度。
表8ACE抑制率检测方法
计算公式如下：
式中：A为a组的吸光度值，表示样品与ACE、HHL同时反应；B为b组的吸光度值，在反应中不加入样品，ACE与HHL完全反应；C为c组的吸光度值，为ACE与HHL反应的空白组。
感官评价，由12名评估员组成的小组进行开菲尔的感官评定。小组成员进行品尝后，根据GB 19302-2010对感官的要求，按照如表9所示感官评价标准进行评分，最终取平均值。
表9羊乳开菲尔感官评价标准表
苯酚-硫酸法测定胞外多糖
苯酚-硫酸法测定总碳水化合物。向1mL样品中加入1mL5％(w/v)苯酚，随后加入5mL浓硫酸(该过程在冰中进行)。在室温下静止20min，于490nm处读取吸光值，绘制标准曲线如图6。
γ-氨基丁酸测定
参考上官文菲的方法进行标准曲线的绘制，标准曲线如图7所示，根据标准曲线计算γ-氨基丁酸的含量。
开菲尔羊奶粉稳定性测定
加速实验测定功能性开菲尔羊奶粉的贮存稳定性。通过测定功能性开菲尔羊奶粉在不同加速温度下的活菌数，来评价功能性开菲尔羊奶粉的贮存稳定性。在45℃、50℃和55℃下，每两小时取样测定一次羊奶粉的活菌数，直至12h。
各产品在不同温度下的失活速率常数k由对数残留定律计算得到，由阿累尼乌斯方程计算得到功能性开菲尔羊奶粉在常温(25℃)和冰箱冷藏(4℃)下的k值，研究稳定性。
酵母菌产醇试验
将活化好的菌悬液稀释到合适梯度，取0.1mL涂布于YPD培养基或者PDA培养基上，28℃培养48h。挑选菌落数在100～300之间的平板，倒入TTC培养基将原菌落覆盖，28℃继续培养，分别在1h、3h和6h观察并记录培养基颜色变化。
耐酸性
将乳酸菌和酵母菌置于pH值为3的液体培养基中分别于37℃和28℃培养4h后将所得菌液适当稀释后进行活菌数检测。
胆盐耐受性
将活化好的菌液接种3％(V/V)于不同浓度的牛胆盐液体培养基中进行培养，测定吸光度(OD620)上升0.3个单位所需要的时间，确定菌株在不同浓度牛胆盐中的生长滞后期，其计算公式如下：
滞后期(h)＝实验组(h2)～对照组(h1)
式中：h2为实验组OD620值上升0.3个单位消耗的时间；
h1为空白组OD620值上升0.3个单位消耗的时间。
冻干菌粉制备
将筛选获得的乳酸菌和酵母菌分别采用MRS肉汤培养基和YPD肉汤培养基于37℃和28℃下分别培养24h和48h，离心收集菌体，添加实验室前期筛选的保护剂进行真空冷冻干燥(冻干条件：-35℃预冻3h，再进行程序升温，每3h为一阶段，真空度为15Pa)。
Claims (10)
1.一种开菲尔直投式发酵剂，其特征在于，以质量份数计，包括15％～30％的酿酒酵母6Y6、2％～40.8％的乳酸乳球菌2C6、5.6％～54.5％瑞士乳杆菌6171和11.4％～62.3％的植物乳杆菌4M2。
2.权利要求1所述的一种开菲尔直投式发酵剂的应用，其特征在于，将开菲尔直投式发酵剂和羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合得到发酵型开菲尔羊奶粉。
3.一种功能性开菲尔直投式发酵剂，其特征在于，以质量分数计，包括50％～70％权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、10％～40％的保加利亚乳杆菌LB6和10％～30％的植物乳杆菌L60。
4.根据权利要求3所述的一种功能性开菲尔直投式发酵剂，其特征在于，以质量分数计，包括55.3％的权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、16.3％的保加利亚乳杆菌LB6、28.4％的植物乳杆菌L60。
5.权利要求3或4所述的一种功能性开菲尔直投式发酵剂的应用，其特征在于，将功能性开菲尔直投式发酵剂和羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合得到发酵型开菲尔羊奶粉。
6.一种功能性开菲尔直投式发酵剂，其特征在于，以质量分数计，包括50％～65％权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、10％～30％的罗伊氏乳杆菌L49和10％～30％的发酵乳杆菌B62。
7.根据权利要求6所述的一种功能性开菲尔直投式发酵剂，其特征在于，以质量分数计，包括50.1％权利要求1所述的开菲尔直投式发酵剂、25.5％罗伊氏乳杆菌L49、24.4％发酵乳杆菌B62。
8.权利要求6或7所述的一种功能性开菲尔直投式发酵剂的应用，其特征在于，将功能性开菲尔直投式发酵剂和羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合得到发酵型开菲尔羊奶粉。
9.一种发酵型开菲尔羊奶粉，其特征在，将权利要求1或权利要求3或权利要求4或权利要求6或权利要求7所述的开菲尔直投式发酵剂与羊奶粉按照质量比1:(100～200)混合，混合时间为10min～15min，转速为10rpm～16rpm。
10.一种开菲尔羊乳，其特征在于，将权利要求9所述的发酵型开菲尔羊奶粉按质量比1:6～1:8复水后在24℃～28℃发酵16h～20h得到。
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|---|---|---|---|---|
| CN117223809A (zh) * | 2023-11-10 | 2023-12-15 | 山东向日葵生物工程有限公司 | 一种消炎利尿的发酵乳杆菌sf-l35发酵饮品及应用 |
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