CN105087437A - 一株3-羟基丙醛高产菌株及其在防治哺乳动物皮肤感染中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明一株3-羟基丙醛高产菌株及其在防治哺乳动物皮肤感染中的应用，涉及一种微生物及其组合物，特别是涉及一种用于防治哺乳动物皮肤感染的微生物及其组合物。其目的是为了提供一种生长周期短、益生菌素产量高的罗伊氏乳杆菌，及其在防治哺乳动物皮肤感染中的应用。本发明的3-羟基丙醛高产菌株为罗伊氏乳杆菌RS01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.9971，保藏日期为2014年11月14日。本发明的3-羟基丙醛高产菌株易于培养、目标产物产量高、其发酵液安全无毒副作用、具有广谱的抗菌作用。本发明用于防治哺乳动物皮肤感染领域。

Description

一株3-羟基丙醛高产菌株及其在防治哺乳动物皮肤感染中的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物及其组合物，特别是涉及一种用于防治哺乳动物皮肤感染的微生物及其组合物。

背景技术

益生菌素3-羟基丙醛(3-HPA)，CAS：2134-29—4，分子式C₃H₆O₂，可溶于乙醇、乙醚、丙酮，极易溶于水，易聚合，属于羟醛类化合物，性质比较活泼，无异味。益生菌素3-羟基丙醛在水溶液中主要呈现3-羟基丙醛单体、水合物和环化二聚体三种状态。3-羟基丙醛具有醛基和羟基，易发生羟基和醛基相关的反应，容易缩合。

益生菌素3-羟基丙醛可由定殖于人及动物肠道内的细菌代谢甘油产生，其在生物灭菌剂、抗感染治疗剂、生物交联剂、新型生物材料的前体等方面有着广泛的潜在用途。

罗伊氏素的主要成分是3-羟基丙醛的单体、水合物和环化二聚体。研究表明，15-30μg/ml的罗伊氏素就能抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母、真菌和病原虫等的生长。由于罗伊氏素既具广谱抗菌特性，又对人和动物无害，其用途正逐步被广泛开发，如作为生物防腐剂，用于延长香肠、冷冻食品等的货价期；作为生物灭菌剂，用于不能高温灭菌的食品牛奶、生物材料的灭菌；作为口香糖添加剂，用于杀死口腔病原菌预防龋齿；作为抗感染治疗剂，替代抗生素用于动物病原虫引发疾病的治疗。

益生菌素3-羟基丙醛单体是一个三碳的醇醛类化合物，可以和蛋白质中的胺基反应形成交联。在酸性条件下，三个益生菌素3-羟基丙醛单体形成乙缩醛，可与自由胺基进行双醛基交联反应；而在碱性条件下，可能发生类似于甲醛的单醛基交联反应。因此可以作为新型交联剂，交联后生物组织的变性温度、交联指数、抗酶解能力和机械性能等与戊二醛(glutaraldehyde)交联的生物组织相当，但其细胞毒性更低。因此可以取代化学合成的戊二醛和环氧化合物作为新型的生物交联剂，从而克服化学交联剂处理生物组织所遇到的组织硬化、钙化、细胞毒性过高及免疫反应过强等问题。

此外，益生菌素3-羟基丙醛还可作为多种新兴化学品如丙烯醛、丙烯酸、1,3-丙二醇等的前体，用于制备新型聚合物材料。

皮肤感染，是细菌和真菌感染性皮肤病，病情患者有轻有重，轻的易治疗，严重的不易治疗。目前，治疗皮肤病的药物有多种，多数为西药。但是西药中多数含有激素，用药后残留在人体内，会引起一些毒副作用；另外治疗效果也不理想。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种生长周期短、益生菌素产量高的罗伊氏乳杆菌，及其在防治哺乳动物皮肤感染中的应用。

本发明一株3-羟基丙醛(益生菌素)高产菌株，其特征在于：其为罗伊氏乳杆菌(Lactobacillusreuteri)RS01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.9971，保藏日期为2014年11月14日。

进一步，本发明的3-羟基丙醛高产菌株，所述罗伊氏乳杆菌RS01的细胞壁染色呈革兰氏阳性，无芽孢，菌体呈现短棒状，分布为单个或呈连接状。

进一步，本发明的3-羟基丙醛高产菌株，所述罗伊氏乳杆菌RS01菌体长1.5-3um、宽0.6-0.9um。

进一步，本发明的3-羟基丙醛高产菌株，所述罗伊氏乳杆菌RS01的菌落光滑细腻，边缘整齐，菌落大小均匀一致，乳白色、湿润、不透明。

本发明一种利用罗伊氏乳杆菌RS01生产3-羟基丙醛的方法，包括以下步骤：

一、制备培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐温801ml、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、L-半胱氨酸0.5g、硫乙醇酸钠0.05g、VB120.005g、甘油3.68g加水定容至1L，调节pH值为6.8；

二、将上述罗伊氏乳杆菌RS01接入步骤一中制备的培养基中，37℃、溶氧量为0的条件下，厌氧发酵5h；

三、分离：第一次分离采用板框分离，收集菌体快速而且不易造成菌体死亡；然后将分离的菌体接入新的培养基中，在37℃、溶氧量为0的条件下，培养4h；第二次分离采用高速管式离心机，可以使目的产物与菌体有效分离；

四、合并两次分离得到的发酵液。

本发明中对上述菌种采用了同一菌种两次发酵的方法，得到高浓度的3-HPA。

本发明一种3-羟基丙醛高产菌株在防治哺乳动物皮肤感染中的应用，其特征在于：用于制备各种预防和治疗皮肤感染的药物。

本发明一株益生菌素高产菌株及其在防治哺乳动物皮肤感染中的应用与现有技术不同之处在于：

1、易于培养：本发明采用了厌氧发酵，控制发酵过程中的氧气浓度；即可通过两次发酵转化3-HPA，到高浓度的3-HPA。

2、产量高：本发明中的罗伊氏乳杆菌RS01经过诱变筛选后，菌种生长周期缩短一半，目标产物(3-HPA)产量由原本几乎为0提升至2.5-2.8g/L。

3、节能：本发明中的罗伊氏乳杆菌RS01经过诱变筛选后，由于生长周期的缩短一半以上，从而大大降低了生产成本，节约了水、电、汽等能源。

4、安全、无毒副作用：采用本发明的罗伊氏乳杆菌RS01的发酵液对SD系大鼠进行灌胃验证其无毒副作用。

5、抗菌谱广：本发明的益生菌素高产菌株代谢产物对细菌、真菌、原虫引起的皮肤炎均有很好的治疗效果，证明其具有广谱的抗菌作用，可用于预防或治疗哺乳动物的皮肤感染。

附图说明

图1为本发明罗伊氏乳杆菌RS01的镜检图；

图2为本发明罗伊氏乳杆菌RS01的菌落图；

图3为本发明罗伊氏乳杆菌RS01的抑白色念珠菌图；

图4为本发明罗伊氏乳杆菌RS01的抑金黄色葡萄球菌图；

图5为本发明罗伊氏乳杆菌RS01的抑大肠杆菌图。

具体实施方式

结合以下实施例与验证试验对本发明的一株益生菌素高产菌株及其在防治哺乳动物皮肤感染中的应用作进一步的说明。

本发明的罗伊氏乳杆菌RS01为太空诱变筛选出的正向突变菌株。在高能粒子辐射、微重力、交变磁场的条件下，罗伊氏乳杆菌发生多种具有不同程度代谢产生3-羟基丙醛能力的菌株，通过对致病菌群进行不同梯度的杀菌试验，筛选获得60min内杀菌率在90％以上的菌株，即本发明中的益生菌素(3-羟基丙醛)高产菌株。

图1为本发明罗伊氏乳杆菌RS01的镜检图；图2为本发明罗伊氏乳杆菌RS01的菌落图。

实施例1

本发明中益生菌素高产菌株的生产3-羟基丙醛的方法，按以下步骤进行：

一、制备培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐温801ml、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、L-半胱氨酸0.5g、硫乙醇酸钠0.05g、VB120.005g、甘油3.68g加水定容至1L，调节pH值为6.8；

二、将本发明的罗伊氏乳杆菌RS01接入步骤一中制备的培养基中，37℃厌氧发酵5h；

三、分离：第一次分离采用板框分离，收集菌体快速而且不易造成菌体死亡；然后将分离的菌体接入新的培养基中，在37℃、溶氧量为0的条件下，培养4h；第二次分离采用高速管式离心机，可以使目的产物与菌体有效分离；

四、合并两次分离得到的发酵液。

根据3-羟基丙醛在强酸条件下加热脱水形成丙烯醛，而色氨酸在浓盐酸的存在下，与丙烯醛反应生成紫色物质，在560nm下有吸收峰。因此，通过显色反应来检测所得3-羟基丙醛的产量。经测定，突变前的罗伊氏乳杆菌发酵产3-羟基丙醛的量几乎为0，采用本申请中的罗伊氏乳杆菌RS01结合上述发酵方法，所得3-羟基丙醛的产量为2.5-2.8g/L；而菌种的生长周期由原来的12-20h缩短至现在的5h，大大降低了生产成本，节约了水、电、汽等能源。

抑菌试验

将实施例1中分离得到的发酵液稀释到四倍体积，按照以下步骤对发酵液的抑/杀菌(白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌)能力进行测定：

一、配制培养基：配制营养琼脂培养基；

二、灭菌：将步骤一配制的培养基、培养皿、牛津杯、移液枪枪头等放入灭菌锅中灭菌；

三、取适量活化好的致病菌接入冷却至40℃的培养基中，制得菌悬液；

四、将步骤三中的菌悬液倒入培养皿中，待培养基凝固；

五、在培养皿中放入牛津杯(每个平皿放3个)，再于牛津杯中加入0.24ml待测样品；

六、将步骤五中的培养皿放入培养箱中培养12h；

七、观察抑菌圈大小。

抑菌效果根据抑菌圈大小来判断，标准如表1所示，所得结果见图3-5。

表1抑菌效果判定标准

抑菌试验结果显示，本发明的发酵液抑制白色念珠菌所形成的抑菌圈直径为26.3mm、抑制金黄色葡萄球菌所形成的抑菌圈直径为27.8mm、抑制大肠杆菌所形成的抑菌圈直径为31.2mm，结果均显著高于高度敏感的标准，采用以上方法验证稀释80倍体积的发酵液的抑菌效果，发现发酵液稀释至80倍仍有抑菌效果，说明本发明的益生菌素高产菌株的发酵液对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有很强的杀灭作用。

安全性试验

为验证本发明益生菌素高产菌株的安全性，采用本发明的发酵液对SD系大鼠进行灌胃，来研究本发明的益生菌素高产菌株代谢生产物对其血生化指标的影响。

取体重为200g±20g的雌性SD系大鼠40只，将其分为三组，阴性对照组10只，空白对照组10只，实验组10只。实验组用1mL实施例1制得的提取液灌胃，1次/d，共21d。

所得结果如下：

1、实验组的血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、血清肌酐(CREA)、血清尿酸(uA)、血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)、血清球蛋白(GLOB)均不高于正常对照组的指标。

2、组织检查结果为，肝肾组织石蜡切片，HE染色，显微镜观察，未见变形浸润、红肿、炎症。

药效实验

1、皮肤抑菌试验

建立皮肤癣菌豚鼠感染模型，观察本发明的发酵液抗真菌作用，并体外研究其对皮肤常见真菌的抑制作用；建立豚鼠皮肤细菌感染模型，观察本发明的发酵液抗细菌作用，并研究其体外抗细菌作用。本发明的发酵液取实施例1中制得的提取液。

通过以上试验，得出本发明的发酵液能提高须癣毛癣菌和白色念珠菌感染所致的豚鼠体癣模型的真菌镜检转阴率，显示其对豚鼠皮肤局部真菌感染病灶有明显的治疗作用；体外试验中本发明发酵液对白色念珠菌、须癣毛癣菌、犬小孢子菌、红色毛癣菌均有一定的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌作用最强，结果如表2所示。

表2体外抑菌效果的最低浓度

本制剂不同剂量皮肤给药对真菌所致的豚鼠皮肤感染均具有较好的治疗作用；对四种真菌有不同的抑制作用，其中对金黄色葡萄球菌作用最强。本制剂对金黄色葡萄球菌引起的皮肤感染有较好的治疗效果，优于阳性对照组。综上所述，本制剂具有较好的抑制细菌和多种真菌的作用。

2、抗炎实验

采用小鼠耳肿胀法和大鼠足跖肿胀法，观察本发明发酵提取液的抗炎作用，其中将本发明实施例1制得的发酵液稀释2倍为高剂量组，稀释4倍为中剂量组，稀释8倍为低剂量组。

本发明发酵提取液各剂量组对二甲苯所致的小鼠耳肿胀均有不同程度的抑制作用，中、高剂量组与正常组比较，具有显著性差异(P＜0.01)；本发明发酵提取液各剂量组于致炎后0.5-6h，均可不同程度地抑制大鼠蛋清性足跖肿胀，与正常组比较有显著性差异(P＜0.05)，低、中、高剂量组之间虽呈量效趋势，但无统计学差异。因此，本发明发酵提取液具有较好的抗炎作用。

3、抗过敏实验

采用本发明实施例1制得的发酵提取液进行验证，稀释2倍为高剂量组，稀释4倍为中剂量组，稀释8倍为低剂量组。

结果显示本发明发酵提取液高剂量组对小鼠迟发型超敏所致的耳廓肿胀有一定的抑制作用(P＜0.05)；与正常组相比较，高、中剂量组对迟发型超敏小鼠的胸腺、脾脏呈现一定的抑制趋势，但无统计学意义(P＞0.05)(见表3)。本发明发酵提取液各剂量组与对照组均能减轻致敏皮肤蓝斑的程度，降低过敏皮肤的通透性，与正常组相比，高、中剂量组有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)，对照组及低剂量组虽呈抑制趋势，但无统计学意义(P＞0.05)(见表4)。

通过以上结果可知，本发明发酵提取液对小鼠迟发型超敏反应和异种被动皮肤的过敏反应均有显著的抑制作用，从而减轻过敏反应，说明本发明发酵提取液具有较好的抗过敏作用。

表3提取液对小鼠迟发型超敏耳廓肿胀、脾脏、胸腺的影响

表4提取液对小鼠同种被动皮肤过敏反应的影响

4、止痒实验

建立磷酸组织胺豚鼠致痒模型，采用本发明实施例1制得的发酵提取液进行验证，其中稀释2倍为高剂量组，稀释4倍为中剂量组，稀释8倍为低剂量组，观察本发明发酵提取液的止痒作用。结果表明，本发明发酵提取液中、高剂量组均能提高豚鼠的致痒阈(P＜0.05，P＜0.01)，低剂量组有提高致痒阈的趋势，但无统计学意义。因此，本发明发酵提取液具有较好的止痒作用。

临床试验

对患有手足癣、体癣、花斑癣、股癣、湿疹、虫咬所致皮炎等症状的患者进行治疗观察，治疗方法为直接使用提取液擦拭，3次/d，连续5d，具体临床疗效如表5所示。

表5临床疗效

疗效标准：

治愈：连续使用1-3周后，皮损改善：糜烂渗出、脱屑消失，瘙痒消失。显效：连续使用1-3周后，皮损改善(糜烂渗出减轻、脱屑减少)60％以上，瘙痒明显减轻。好转：：连续使用1-3周后，皮损改善(糜烂渗出减轻、脱屑减少)60％-20％以上，瘙痒减轻。无效：连续使用1-3周后，病情无变化。

结果表明采用本发明的益生菌素高产菌株代谢产物对多种皮肤感染进行治疗，均具有显著的治疗效果，并验证了其广谱的抗菌作用，因此可用于预防或治疗哺乳动物的皮肤感染。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (6)

1.一株3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：其为罗伊氏乳杆菌RS01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.9971，保藏日期为2014年11月14日。

2.根据权利要求1所述的3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌RS01的细胞壁染色呈革兰氏阳性，无芽孢，菌体呈现短棒状，分布为单个或呈连接状。

3.根据权利要求1所述的3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌RS01菌体长1.5-3um、宽0.6-0.9um。

4.根据权利要求1所述的3-羟基丙醛高产菌株，其特征在于：所述罗伊氏乳杆菌RS01的菌落光滑细腻，边缘整齐，菌落大小均匀一致，乳白色、湿润、不透明。

5.一种利用权利要求1中所述罗伊氏乳杆菌RS01生产3-羟基丙醛的方法，其特征在于包括以下步骤：

一、制备培养基：蛋白胨10g、牛肉膏10g、葡萄糖20g、酵母浸膏5g、吐温801ml、磷酸氢二钾2g、柠檬酸三铵2g、乙酸钠5g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.2g、L-半胱氨酸0.5g、硫乙醇酸钠0.05g、VB120.005g、甘油3.68g加水定容至1L，调节pH值为6.8；

二、将权利要求1所述罗伊氏乳杆菌RS01接入步骤一中制备的培养基中，37℃、溶氧量为0的条件下，培养5h；

三、分离：第一次分离采用板框分离；然后将分离的菌体接入新的培养基中，37℃、溶氧量为0的条件下，培养4h；第二次分离采用高速管式离心机；

四、合并两次分离得到的发酵液。

6.一种3-羟基丙醛高产菌株在防治哺乳动物皮肤感染中的应用，其特征在于：用于制备各种预防和治疗皮肤感染的药物。