CN108517347A - 一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用 - Google Patents

一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用，属于微生物领域。该培养基添加了由青霉素、卡那霉素及万古霉素按特定浓度配成的拟杆菌选择性抗生素，可有效抑制其他门类的杂菌生长，以阿拉伯糖作为唯一碳源，降低能利用阿拉伯糖的高丰度拟杆菌的数量，并添加有益于B.cellulosilyticus生长的物质，因此提高了Bacteroides cellulosilyticus的分离效率，更加快速便捷地从菌群样品中分离得到B.cellulosilyticus。

Description

一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用
技术领域
本发明涉及一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用，属于微生物领域。
背景技术
Bacteroides cellulosilyticus从属于拟杆菌属、拟杆菌门，为革兰氏阴性严格厌氧菌，无质粒；对氧气及其敏感，只能在完全无氧的环境中生长良好。可代谢木聚糖等多糖，也可代谢半纤维素、木糖等小分子糖。
Bacteroides cellulosilyticus是人体正常肠道菌之一，但丰度较低。体内实验表明，B.cellulosilyticus的碳水化合物利用系统显著地优于其他拟杆菌种，能够在不同的碳源环境下高质量地存活，这种强大的环境适应力正是微生物学家寻找的新一代益生元、益生菌所必备的特性之一。
然而，目前对于Bacteroides cellulosilyticus的研究除了其强大的糖代谢功能，关于该菌株与人体肠道健康的具体联系尚不明朗。并且，布氏绵羊血培养基作为已知的普通拟杆菌(Bacteroidales)有效筛选手段(《Infection and Immunity》,2011,5,2012-2020)，只能大概率能分离得到肠道内高丰度的拟杆菌种，而较难得到低丰度的B.cellulosilyticus，因而限制了其深入的科学研究。而本发明是为了达到提高从菌群样品中分离得到B.cellulosilyticus的效率，设计特异性培养基，从而为深入研究该菌的生理生化特性及与人体健康的关系提供技术支持。
发明内容
本发明提供了一种用于Bacteroides cellulosilyticus特异性筛选的培养基，该培养基配制方便，成本低，培养基中含有混合抗生素及唯一碳源等物质，能有效富集菌群样品中较低丰度的B.cellulosilyticus，再与常规拟杆菌筛选培养基配合使用后，能提高其从菌群样品中的分离效率。
本发明的第一个目的是提供一种Bacteroides cellulosilyticus特异性筛选培养基，所述培养基包括富集培养基、分离培养基和生长培养基；所述富集培养基中含有青霉素、万古霉素、卡那霉素、唯一碳源以及其他物质。
在本发明的一种实施方式中，所述唯一碳源为阿拉伯糖。
在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基的配方包括如下组分：唯一碳源4-6g/L，胰蛋白胨15-25g/L，酵母提取物4-6g/L，氯化钠4-6g/L，磷酸氢二钾0.04-0.06g/L，磷酸二氢钾0.04-0.06g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K10.001-0.002g/L，青霉素溶液20-40ml/L，卡那霉素硫酸盐溶液4-5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.0-2.5ml/L，余量为无菌水，pH值为6.8-7.0。
在本发明的一种实施方式中，所述分离培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K10.001-0.002g/L，卡那霉素硫酸盐溶液4-5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.0-2.5ml/L，琼脂15-20g/L，余量为无菌水。
在本发明的一种实施方式中，所述生长培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K10.001-0.002g/L，余量为无菌水。
在本发明的一种实施方式中，所述集培养基中的唯一碳源为阿拉伯糖。
在本发明的一种实施方式中，所述富集培养基中的青霉素溶液浓度为0.8-1.2mg/ml。
上述富集培养基和分离培养基中的卡那霉素硫酸盐溶液浓度为15-25mg/ml，万古霉素盐酸盐溶液浓度为2-4mg/ml。
本发明还提供一种配制上文所述用于特异性分离筛选Bacteroidescellulosilyticus的培养基的方法。
所述富集培养基的配制步骤：
(1)按配方比例称量除抗生素外的所有组分，混合溶解，若培养基pH值低于6.8，则用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟。
(2)将青霉素、卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50-55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀。
所述分离培养基的配制步骤：
(1)按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并按配方比例称量其他除抗生素外的所有组分，混合均匀，115-121℃下灭菌15-20分钟。
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50-55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀。
所述生长培养基的配制步骤：按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并按配方比例称量其他所有组分，混合均匀，115-121℃下灭菌15-20分钟。
本发明还提供一种所述培养基在分离筛选菌群样品中Bacteroidescellulosilyticus的方法，所述方法的步骤如下：
(1)富集培养：将菌群样品以1-2％的接种量接种于上述富集培养基中，37℃厌氧恒温培养箱培养4-8小时；
(2)涂布分离：将上述富集培养菌悬液用无菌生理盐水梯度稀释后，取100μl涂布于上述分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(3)一级纯化培养：从菌落数30-300的稀释度平板上，挑取不同形态的单菌落，在新的上述分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(4)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的上述分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(5)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10ml上述生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24-48小时；
(6)菌种保存：将三级菌悬液与40％-50％的无菌甘油溶液均匀混合，使甘油终浓度为20％以上，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用。
(7)菌种鉴定。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的富集时间为4小时。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中用于梯度稀释的生理盐水，其制备方法为：按比例称量氯化钠9g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，均匀溶解于蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中所述的40％-50％的无菌甘油溶液，其制备方法为：按纯甘油与蒸馏水的体积比为1:1-1:1.5混合后，添加半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，115-121℃下灭菌15-20分钟。
在本发明的一种实施方式中，所述步骤(7)中的菌种鉴定的具体方法为：
(7.1)将三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用无菌水等量重悬，作为PCR模板；
(7.2)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；
(7.3)PCR体系为：27F引物溶液1μl，1492R引物溶液1μl，2X Taq Mastermix Dye25μl，无菌水22.5μl及模板0.5μl；
(7.4)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；
(7.5)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对。
在本发明的一种实施方式中，，所述步骤(7.3)中所述的27F引物溶液及1492R引物溶液浓度均为10μM。
本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
本发明提供了一种高效分离筛选Bacteroides cellulosilyticus的培养基及其应用方法。该培养基添加了由卡那霉素及万古霉素按特定浓度配成的拟杆菌选择性抗生素，可有效抑制其他门类的杂菌生长；依据伯杰氏手册，肠道内绝大多数高丰度拟杆菌均能利用阿拉伯糖，而低丰度拟杆菌如B.cellulosilyticus、B.fragilis等不能或只能少量利用阿拉伯糖；而青霉素能抑制细菌细胞壁的合成，因此，青霉素只能消灭正在生长繁殖的细菌，而对休眠状态即未进行分裂生长的细菌无抑制作用；本发明综合上述两点，以阿拉伯糖作为唯一碳源，并添加有一定浓度的青霉素的富集培养基，能大大的降低能利用阿拉伯糖的高丰度拟杆菌的数量，从而达到富集低丰度的B.cellulosilyticus等菌种的目的；配合拟杆菌常规分离培养基，即可提高低丰度的B.cellulosilyticus等菌种的分离效率。所加入的氯化血红素及维生素K1为拟杆菌所需的生长因子，半胱氨酸盐酸盐能有效降低培养基中的氧气含量，从而促进B.cellulosilyticus的生长。
本发明提供的特异性筛选的培养基相比于常规拟杆菌选择性培养基，更有利于富集低丰度的目标菌，提高了Bacteroides cellulosilyticus的分离效率，更加快速便捷地从菌群样品中分离得到B.cellulosilyticus。
具体实施方式
下面结合实施案例对本发明的技术方案作进一步说明
实施案例1：不同青霉素富集时间对特异性筛选Bacteroides cellulosilyticus效率的影响
本实施案例中用于特异性筛选Bacteroides cellulosilyticus的培养基，包括富集培养基、分离培养基和生长培养基。其中：
富集培养基的配方包括如下组分：阿拉伯糖5g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.05g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，1mg/ml青霉素溶液40ml/L，20mg/ml的卡那霉素硫酸盐溶液5ml，3mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液2.5ml，余量为无菌水，pH值为7.0。
分离培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，卡那霉素硫酸盐溶液5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.5ml/L，琼脂20g/L，余量为无菌水。
生长培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，余量为无菌水。
本实施案例中富集培养基的配制步骤：
(1)按配方比例称量除抗生素外的所有组分，混合溶解，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至7.0后，121℃下灭菌15分钟。
(2)将青霉素、卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀。
本实施案例中分离培养基的配制步骤：
(1)按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并添加琼脂15-20g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，混合均匀，121℃下灭菌15分钟。
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀。
本实施案例中生长培养基的配制步骤：按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并添加半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，混合均匀，121℃下灭菌15分钟。
分离筛选的具体步骤如下：
(1)富集培养：从山东泰安取健康老人粪便，以1％的接种量接种于上述富集培养基中，37℃厌氧恒温培养箱分别培养4、8、12、16及20小时；
(2)涂布分离：将上述富集培养菌悬液分别用无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的生理盐水(pH7.0)梯度稀释10-1-10-7后，每个稀释梯度取100μl涂布于分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时。
(3)一级纯化培养：从上述分离培养基中，菌落数为30-300的稀释度平板上，挑取不同形态的单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(4)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(5)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10ml上述生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24小时；
(6)菌种保存：取500μl三级菌悬液与500μl 40％无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的甘油溶液均匀混合，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用。
(7)菌种鉴定：
(i)取1ml三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用1ml无菌水等量重悬，作为PCR模板；
(ii)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；
(iii)PCR体系为：10μM的27F引物溶液1μl，10μM的1492R引物溶液1μl，2X TaqMastermix Dye 25μl，无菌水22.5μl及模板0.5μl；
(iv)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；
(v)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对。测序结果见下表1.
注：分离筛选的操作均必须在无菌操作台及厌氧工作站内执行。
本实施案例结果表明，在青霉素富集高于8小时后，筛到的多为高丰度的拟杆菌如单形拟杆菌(Bacteroides uniformis)、多型拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)等，并且很大程度地提高了耐药菌的分离效率，如在青霉素富集20小时后，筛得的菌株90％都是大肠杆菌。只有在青霉素富集4小时后，所筛得的10个菌落中，有3个鉴定为低丰度的B.cellulosilyticus。因此，在针对B.cellulosilyticus特异性筛选的过程中，以4小时为最佳的青霉素富集时长。
实施案例2：不同青霉素富集浓度对特异性筛选Bacteroides cellulosilyticus效率的影响
本实施案例中用于特异性筛选Bacteroides cellulosilyticus的培养基，包括富集培养基、分离培养基和生长培养基。其中：
为研究不同浓度的青霉素富集对B.cellulosilyticus分离效率的影响，采用添加了不同体积的1mg/ml青霉素溶液(0ml/L、20ml/L、40ml/L)的富集培养基，其余成分为：阿拉伯糖5g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.05g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，20mg/ml的卡那霉素硫酸盐溶液5ml，3mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液2.5ml，余量为无菌水，pH值为7.0。
分离培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，卡那霉素硫酸盐溶液5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.5ml/L，琼脂20g/L，余量为无菌水。
生长培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，余量为无菌水。
本实施案例中富集培养基的配制步骤：
(1)按配方比例称量除抗生素外的所有组分，混合溶解，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至7.0后，121℃下灭菌15分钟。
(2)将青霉素、卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀。
本实施案例中分离培养基的配制步骤：
(1)按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并添加琼脂15-20g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，混合均匀，121℃下灭菌15分钟。
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀。
本实施案例中生长培养基的配制步骤：按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并添加半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，混合均匀，121℃下灭菌15分钟。
分离筛选的具体步骤如下：
(1)富集培养：从山东泰安取健康老人粪便，以1％的接种量分别接种于上述含有不同浓度青霉素的富集培养基中，37℃厌氧恒温培养箱分别培养4小时；
(2)涂布分离：将上述富集培养菌悬液分别用无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的生理盐水(pH7.0)梯度稀释10-1-10-7后，每个稀释梯度取100μl涂布于分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时。
(3)一级纯化培养：从上述分离培养基中，菌落数为30-300的稀释度平板上，挑取不同形态的单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(4)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(5)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10ml上述生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24小时；
(6)菌种保存：取500μl三级菌悬液与500μl 40％无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的甘油溶液均匀混合，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用。
(7)菌种鉴定：
(i)取1ml三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用1ml无菌水等量重悬，作为PCR模板；
(ii)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；
(iii)PCR体系为：10μM的27F引物溶液1μl，10μM的1492R引物溶液1μl，2X TaqMastermix Dye 25μl，无菌水22.5μl及模板0.5μl；
(iv)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；
(v)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)在GeneBank中进行搜索和相似性比对。测序结果见下表2.
注：分离筛选的操作均必须在无菌操作台及厌氧工作站内执行。
表2不同浓度青霉素富集处理后所筛选得到的菌种
本实施案例结果表明，青霉素能显著提高低丰度B.cellulosilyticus的分离效率，且浓度越高，筛得B.cellulosilyticus的概率越大。因此，在针对B.cellulosilyticus特异性筛选的过程中，采用添加了40ml/L的1mg/ml青霉素溶液的培养基富集后，分离效率最佳。
实施案例3：特异性筛选培养基针对拟杆菌混合体系I中Bacteroidescellulosilyticus分离效率的验证
本实施案例中用于特异性筛选Bacteroides cellulosilyticus的培养基，包括富集培养基、分离培养基和生长培养基。其中：
富集培养基的配方包括如下组分：阿拉伯糖5g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.05g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，1mg/ml青霉素溶液40ml/L，20mg/ml的卡那霉素硫酸盐溶液5ml，3mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液2.5ml，余量为无菌水，pH值为6.8。
分离培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，卡那霉素硫酸盐溶液5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.5ml/L，琼脂18g/L，余量为无菌水。
生长培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，余量为无菌水。
富集培养基、分离培养基与生长培养基按如下步骤配制：与实施案例1相同。
为验证上述特异性筛选培养基针对Bacteroides cellulosilyticus的分离效率，本实施案例中采用的对照培养基，包括富集培养基、分离培养基和生长培养基。与特异性培养基相比，富集培养基未添加青霉素，其他成分均相同，配制步骤与实施案例1相同。
样品制备：本实施案例采用的样品为拟杆菌混合液I，将表3中所述不同拟杆菌种的菌悬液培养至稳定前期后，按表3中的比例混合。该操作均必须在无菌操作台及厌氧工作站内执行。
表3拟杆菌混合液I的组成
菌种名 菌落数/cfu 占比％
Bacteroides uniformis 4×108 15.38
Bacteroides thetaiotaomicron 4×108 15.38
Parabacteroides distasonis 4×108 15.38
Parabacteroides merdae 3×108 11.54
Bacteroides ovatus 1×108 3.85
Bacteroides eggerthii 1×108 3.85
Bacteroides xylanisolvens 1×108 3.85
Prevotella copri 2×108 7.69
Bacteroides fragilis 1×108 3.85
Bacteroides cellulosilyticus 2×108 7.69
Bacteroides dorei 2×108 7.69
Bacteroides salyersiae 1×108 3.85
总计 2.6×109 100.00
分离筛选的具体步骤如下：
(1)富集培养：将拟杆菌混合液以1％的接种量分别接种于特异性筛选及对照筛选的富集培养基中，37℃厌氧恒温培养箱分别培养4小时；
(2)涂布分离：将上述富集培养菌悬液分别用无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的生理盐水(pH7.0)梯度稀释10-1-10-7后，每个稀释梯度取100μl涂布于分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时。
(3)一级纯化培养：从上述分离培养基中，菌落数为30-300的稀释度平板上，挑取不同形态的单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(4)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(5)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10ml上述生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24小时；
(6)菌种保存：取500μl三级菌悬液与500μl 40％无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的甘油溶液均匀混合，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用。
菌种鉴定方法同实施案例1，测序结果如表4所示。
表4特异性筛选培养基和对照培养基对Bacteroides cellulosilyticus筛选的结果
本实施案例结果表明，采用对照培养基未筛得B.cellulosilyticus菌落，而从特异性筛选培养基中挑取的10个菌落中含有B.cellulosilyticus菌落3个(占比30％)，相比于对照培养基的针对B.cellulosilyticus的分离效率显著提高了。
实施案例4：特异性筛选培养基针对拟杆菌混合体系II中Bacteroidescellulosilyticus分离效率的验证
本实施案例中用于特异性筛选Bacteroides cellulosilyticus的培养基，包括富集培养基、分离培养基和生长培养基。其中：
富集培养基的配方包括如下组分：阿拉伯糖5g/L，胰蛋白胨20g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠5g/L，磷酸氢二钾0.05g/L，磷酸二氢钾0.05g/L，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，1mg/ml青霉素溶液40ml/L，20mg/ml的卡那霉素硫酸盐溶液5ml，3mg/ml的万古霉素盐酸盐溶液2.5ml，余量为无菌水，pH值为6.8。
分离培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，卡那霉素硫酸盐溶液5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.5ml/L，琼脂18g/L，余量为无菌水。
生长培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，余量为无菌水。
富集培养基、分离培养基与生长培养基按如下步骤配制：与实施案例1相同。
为验证上述特异性筛选培养基针对Bacteroides cellulosilyticus的分离效率，本实施案例中采用的对照筛选采用普通拟杆菌分离筛选方法，包括分离培养基和生长培养基。其中：
分离培养基按如下步骤配制：
(1)按脑心浸液培养基产品配方要求称量，加蒸馏水溶解，加入半胱氨酸盐酸盐1g/L，氯化血红素0.01g/L，维生素K10.002g/L，琼脂20g，混合均匀，121℃下灭菌15分钟。
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按特异性筛选方法的分离培养基中相同浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌。
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀，即配得本实施案例对照筛选的分离培养基。
对照筛选的生长培养基配制方法与特异性筛选相同。
样品制备：本实施案例采用的样品为拟杆菌混合液II，将表5中所述不同拟杆菌种的菌悬液培养至稳定前期后，按表5中的比例混合。该操作均必须在无菌操作台及厌氧工作站内执行。
表5拟杆菌混合液II的组成
菌种名 菌落数/cfu 占比％
Bacteroides uniformis 4×108 14.81
Bacteroides caccae 3×108 11.11
Bacteroides thetaiotaomicron 4×108 14.81
Parabacteroides distasonis 4×108 14.81
Bacteroides ovatus 2×108 7.41
Bacteroides eggerthii 1×108 3.70
Bacteroides xylanisolvens 1×108 3.70
Prevotella copri 2×108 7.41
Bacteroides fragilis 2×108 7.41
Bacteroides cellulosilyticus 2×108 7.41
Odoribacter splanchnicus 1×108 3.70
Bacteroides salyersiae 1×108 3.70
总计 2.7×109 100.00
特异性分离筛选的具体步骤与实施案例3相同，对照分离筛选的具体步骤如下：
(1)涂布分离：将上述拟杆菌混合液用无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的生理盐水(pH7.0)梯度稀释10-1-10-7后，每个稀释梯度取100μl涂布于分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时。
(2)一级纯化培养：从上述分离培养基中，菌落数为30-300的稀释度平板上，挑取不同形态的单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(3)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48小时；
(4)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10ml上述生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24小时；
(5)菌种保存：取500μl三级菌悬液与500μl 40％无菌的添加了1g/L半胱氨酸盐酸盐的甘油溶液均匀混合，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用。
菌种鉴定方法同实施案例1，测序结果如表6所示。
表6特异性筛选培养基和对照培养基对Bacteroides cellulosilyticus筛选的结果
本实施案例结果表明，采用对照培养基未筛得B.cellulosilyticus菌落，而从特异性筛选培养基中挑取的10个菌落中含有B.cellulosilyticus菌落4个(占比40％)，相比于对照培养基的针对B.cellulosilyticus的分离效率显著提高了。
实施案例1-4，仅是本发明的较佳实施案例，并非是对本发明所作的其他形式的限定。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述技术内容作为启示或改性为同等变化的等效实施案例。但凡是未脱离本发明权利要求的技术实质，对以上实施案例所做出的简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明权利要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种Bacteroides cellulosilyticus特异性筛选培养基，其特征在于，所述培养基包括富集培养基、分离培养基和生长培养基；
所述富集培养基中含有青霉素、万古霉素、卡那霉素、唯一碳源以及其他物质；
所述分离培养基中含有青霉素、万古霉素以及其他物质。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述富集培养基的配方包括如下组分：唯一碳源4-6g/L，胰蛋白胨15-25g/L，酵母提取物4-6g/L，氯化钠4-6g/L，磷酸氢二钾0.04-0.06g/L，磷酸二氢钾0.04-0.06g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K1 0.001-0.002g/L，青霉素溶液20-40ml/L，卡那霉素硫酸盐溶液4-5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.0-2.5ml/L，余量为无菌水，pH值为6.8-7.0；所述唯一碳源为阿拉伯糖。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述分离培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K1 0.001-0.002g/L，卡那霉素硫酸盐溶液4-5ml/L，万古霉素盐酸盐溶液2.0-2.5ml/L，琼脂15-20g/L，余量为无菌水。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述生长培养基的配方包括如下组分：脑心浸液液体培养基，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，氯化血红素0.005-0.01g/L，维生素K1 0.001-0.002g/L，余量为无菌水。
5.根据权利要求2或3所述方法，其特征在于，所述青霉素溶液浓度为0.8-1.2mg/ml，所述卡那霉素硫酸盐溶液浓度为15-25mg/ml，所述万古霉素盐酸盐溶液浓度为2-4mg/ml。
6.一种权利要求1-5任一所述培养基的制备方法，其特征在于，所述富集培养基的配制步骤：
(1)按配方比例称量除抗生素外的所有组分，混合溶解，若培养基pH值低于6.8，则用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟；
(2)将青霉素、卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌；
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50-55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀；
所述分离培养基的配制步骤：
(1)按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并按配方比例称量其他除抗生素外的所有组分，混合均匀，115-121℃下灭菌15-20分钟；
(2)将卡那霉素硫酸盐及万古霉素盐酸盐按浓度要求配制溶液，并分别通过0.22μm滤膜过滤除菌；
(3)将步骤(1)灭菌后的培养基降温至50-55℃后，与步骤(2)所得的溶液混匀；
所述生长培养基的配制步骤：按脑心浸液液体培养基产品要求称量培养基粉末，溶解于蒸馏水中，并按配方比例称量其他所有组分，混合均匀，115-121℃下灭菌15-20分钟。
7.一种应用权利要求1-5任一所述培养基分离筛选菌群中Bacteroidescellulosilyticus的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
(1)富集培养：将菌群样品以1-2％的接种量接种于上述富集培养基中，37℃厌氧恒温培养箱培养4-8小时；
(2)涂布分离：将上述富集培养菌悬液用无菌生理盐水梯度稀释后，取100μl涂布于上述分离培养基，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(3)一级纯化培养：从菌落数30-300的稀释度平板上，挑取不同形态的单菌落，在新的上述分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(4)二级纯化培养：挑取一级培养单菌落，在新的上述分离培养基上分区划线，划线结束后，倒置平皿，37℃厌氧恒温培养箱培养48-72小时；
(5)三级纯化培养：挑取二级培养单菌落，接种于5-10ml上述生长培养基的试管中，37℃厌氧恒温培养箱培养24-48小时；
(6)菌种保存：将三级菌悬液与40％-50％的无菌甘油溶液均匀混合，使甘油终浓度为20％以上，将混合溶液分装在已灭菌的冻存管中，冻存于-80℃超低温冰箱内，备用；
(7)菌种鉴定。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中用于梯度稀释的生理盐水，其制备方法为：按比例称量氯化钠9g/L，半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，均匀溶解于蒸馏水中，用氢氧化钠溶液调节培养基pH值至6.8-7.0后，115-121℃下灭菌15-20分钟。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(6)中所述的40％-50％的无菌甘油溶液，其制备方法为：按纯甘油与蒸馏水的体积比为1:1-1:1.5混合后，添加半胱氨酸盐酸盐0.5-1g/L，115-121℃下灭菌15-20分钟。
10.根据权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤(7)中的菌种鉴定的具体方法为：
(7.1)将三级菌悬液于10000rpm离心1分钟，弃上清，菌泥用无菌水等量重悬，作为PCR模板；
(7.2)所用PCR引物为16S rRNA通用引物：27F-AGAGTTTGATCCTGGCCTCA，1492R-GGTTACCTTGTTACGACTT，扩增片段长度为1500-1600bp；
(7.3)PCR体系为：27F引物溶液1μl，1492R引物溶液1μl，2X Taq Mastermix Dye 25μl，无菌水22.5μl及模板0.5μl；
(7.4)PCR体系混合均匀后，进行扩增反应，反应条件为：95℃，5min；30个循环：95℃，30s；55℃，30s；72℃，2min；72℃，10min；
(7.5)所得PCR产物交由生物公司测序，将得到的序列结果使用BLAST在GeneBank中进行搜索和相似性比对。
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