CN101440392A - 一种肠道类杆菌培养方法 - Google Patents
一种肠道类杆菌培养方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101440392A CN101440392A CNA2008101630506A CN200810163050A CN101440392A CN 101440392 A CN101440392 A CN 101440392A CN A2008101630506 A CNA2008101630506 A CN A2008101630506A CN 200810163050 A CN200810163050 A CN 200810163050A CN 101440392 A CN101440392 A CN 101440392A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- dilution
- added
- diluent
- substratum
- bacteroide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 241000606125 Bacteroides Species 0.000 title claims abstract description 8
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 title claims description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 16
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims abstract description 8
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 11
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 11
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 10
- HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenesulfonic acid Chemical compound NC1=CC=C(S(O)(=O)=O)C=C1 HVBSAKJJOYLTQU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 7
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 claims description 7
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 6
- 229950000244 sulfanilic acid Drugs 0.000 claims description 4
- QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N (1-carboxy-2-sulfanylethyl)azanium;chloride;hydrate Chemical compound O.Cl.SCC(N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 claims description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims description 3
- 229960001305 cysteine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 3
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 claims description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 25
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 abstract description 4
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 abstract 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 abstract 1
- 230000000474 nursing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 230000002550 fecal effect Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 208000028804 PERCHING syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种肠道类杆菌培养方法,取新鲜粪便于0.5小时内放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中,在混匀器上混匀3分钟以上,按连续稀释法,释成10-1~10-8个稀释度,将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区,取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中,涂布均匀,平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内,于恒温箱37℃孵育培养72小时;所述培养基为类杆菌选择性培养基,本发明的有益之处在于:本发明的方法较为直观地反映标本中是否有类杆菌,及其数量,且对培养的细菌可以作进一步的研究和分析,生化特性、代谢特性、遗传特性等。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物技术,特别涉及一种肠道类杆菌培养方法。
背景技术
在人体的肠道内栖息着大约1014个约400~500种细菌,是人体细胞总数的10~20倍。肠道内的细菌对人体肠道的生长发育、免疫功能、消化吸收等功能起着重要的作用。为了更好的研究肠道正常菌群的功能以及与机体的相互关系,对肠道内细菌的分离、鉴定和定量非常重要。到目前为止,人们对肠道正常菌群的了解是通过对粪便标本选择性培养计数菌落数而获得的。随着分子生物学的发展以及分子生物学技术在微生态领域的应用,人们对微生态学的研究取得了突破性的进展,如Suau A等用针对16SrRNA的细菌域通用引物采用PCR法对粪便标本的DNA进行特异性扩增,得到284个平均长度500bp的16SrDNA片段,对这些片段进行测序和种系分析发现284个16SrDNA片段对应于82个分子菌种(1);变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一个遗传指纹技术,根据PCR扩增16SrDNA片段的电泳,它能检测微生物的多样性。但这些技术有明显的不足,它们仅仅只提供样本中的细菌种类和数量,而对于每一细菌的特性,如生化特性、代谢特性、遗传特性等则不能反映。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足,提供一种肠道类杆菌培养方法,取新鲜粪便于0.5小时内放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中,在混匀器上混匀3分钟以上,按连续稀释法,释成10-1~10-8个稀释度,将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区,取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中,涂布均匀,平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内,于恒温箱37℃孵育培养72小时;所述培养基为类杆菌选择性培养基,在100mL EG培养基中,加入已用灭菌水溶解的牛磺胺酸0.1g、新霉素20mg、亮绿20mg,再用10% NaOH调至澄清,121℃高压15分钟,冷却至55℃,加入5~8%的羊血。
所述稀释液A的组成及配比为在1000ml水中:KH2PO4 4.5g,Na2HPO4 6g,盐酸半胱氨酸0.5g,吐温-80 0.5g,琼脂1g。
取新鲜粪便2~5克于0.5小时内放入加有玻璃珠的9mL稀释液A的试管中,在混匀器上混匀3~30分钟,按连续稀释法,释成10-1~10-8个稀释度,将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区,取各50μL的以上稀释后的混合液分别加到分区中,涂布均匀,平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内,于恒温箱37℃孵育培养72小时。
本发明具有以下有益效果:本发明的方法较为直观地反映标本中是否有类杆菌,及其数量,且对培养的细菌可以作进一步的研究和分析,生化特性、代谢特性、遗传特性等。目前,虽然分子生物学技术可以快速鉴定类杆菌,但此类技术主要依据细菌的RNA或DNA来鉴定,并不能区分活菌或死菌,也不能反映出细菌的生理状态。
具体实施方式
下面结合附图与具体实施方式对本发明作进一步详细描述:
本技术采用连续稀释法,即留取观察对象新鲜粪便标本2~5g,于0.5小时内送检。称取0.5克粪便样本放入加有玻璃珠的9mL稀释A液的试管中,在混匀器上混匀至少3分钟,按连续稀释法,释成10-1~10-8个稀释度。根据不同细菌的正常菌数范围,选择不同的稀释度进行培养。将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区,取各50μL的以上稀释后的混合液分别加到分区中,涂布均匀;所用平板放入厌氧盒内,于恒温箱37℃孵育培养72小时后,计数培养基上生长的菌落数。用对数值表示其优势菌数量(LogN/g湿便)。
一、培养基配方
类杆菌选择性培养基(即表中的NBGT培养基)
在EG培养基的基础上(每100mL),加入牛磺胺酸0.1g,新霉素20mg,亮绿20mg,10% NaOH适量(在EC加血之前,先用灭菌水溶解牛磺胺酸、亮绿和新霉素,此时液体为混浊,用NaOH调至澄清),121℃高压15分钟,冷却至55℃,加入5~8%的羊血。
稀释液A:
在1000mL中,加入KH2PO4 4.5g,Na2HPO4 6g,盐酸半胱氨酸0.5g,吐温-80 0.5g,琼脂1g,加入1000mL水,将混合液煮沸,按每支试管9mL分装(每8支试管中,有一支加入10粒左右的琉璃珠),在分装后,用氮气将试管的空气部分替换,加上塞子,121℃高压15分钟。
二、菌落形态及细菌镜下形态如下表。
注1:P表示耐氧试验阳性,即细菌未见有生长
三、具体实例
类杆菌培养方法:留取观察对象新鲜粪便标本3g,于0.5小时内送检。称取0.5克粪便样本放入加有玻璃珠的9mL稀释A液的试管中(记作10-1),在混匀器上混匀至少3分钟,用灭菌的移液管取1mL上已混匀液加到另一未加玻璃珠的9mL稀释A液的试管中(记作10-2),在混匀器上混匀,用此法连续稀释至浓度为10-8。将各培养基平皿作四区标志,按上表中的涂布浓度,取各50μL的稀释后的混合液分别加到四区中,用涂布棒将混合液在各自的区内涂布均匀。
把类杆菌平皿放入厌氧盒内,于恒温箱37℃孵育培养72小时后观察结果。计数时,挑取典型细菌菌落,作下菌落形态的文字描述记录,同时将细菌作革兰染色并镜检,观察和记录革兰染色结果。记录各种培养基中细菌的数量,如在浓度为10-7的区域内计数所得57个菌落即记作57×10-7。
菌数量(LogM/g湿便),M=20×N×10n/m(CFU/g)
N为最小稀释浓度的菌落数
n为最小稀释浓度指数的绝对值
m为标本称重的质量
例:如上在浓度为10-7的区域内计数所得57个菌落即记作57×10-7,原标本的称量为0.5g,M=20×57×107/0.5(CFU/g)=22.8×109,那么该细菌在标本中的菌数量(LogM/g湿便)为Log(22.8×109)/g,即10.358。
最后,还需要注意的是,以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然,本发明不限于以上实施例子,还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形,均应认为是本发明的保护范围。
Claims (3)
1、一种肠道类杆菌培养方法,其特征在于:取新鲜粪便于0.5小时内放入加有玻璃珠的稀释液A的试管中,在混匀器上混匀3分钟以上,按连续稀释法,释成10-1~10-8个稀释度,将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区,取各相同量的以上稀释后的混合液分别加到分区中,涂布均匀,平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内,于恒温箱37℃孵育培养72小时;所述培养基为类杆菌选择性培养基,在100mLEG培养基中,加入已用灭菌水溶解的牛磺胺酸0.1g、新霉素20mg、亮绿20mg,再用10%Na0H调至澄清,121℃高压15分钟,冷却至55℃,加入5~8%的羊血。
2、根据权利要求1所述的肠道类杆菌培养方法,其特征在于:所述稀释液A的组成及配比为在1000ml水中:KH2PO4 4.5g,Na2HPO46g,盐酸半胱氨酸0.5g,吐温-80 0.5g,琼脂1g。
3、根据权利要求1所述的肠道类杆菌培养方法,其特征在于:取新鲜粪便2~5克于0.5小时内放入加有玻璃珠的9mL稀释液A的试管中,在混匀器上混匀3~30分钟,按连续稀释法,释成10-1~10-8个稀释度,将培养基平皿根据不同的涂布浓度分区,取各50μL的以上稀释后的混合液分别加到分区中,涂布均匀,平板放入厌氧盒或手套厌氧箱内,于恒温箱37℃孵育培养72小时。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2008101630506A CN101440392A (zh) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | 一种肠道类杆菌培养方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CNA2008101630506A CN101440392A (zh) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | 一种肠道类杆菌培养方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101440392A true CN101440392A (zh) | 2009-05-27 |
Family
ID=40725002
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2008101630506A Pending CN101440392A (zh) | 2008-12-15 | 2008-12-15 | 一种肠道类杆菌培养方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN101440392A (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104122348A (zh) * | 2014-08-06 | 2014-10-29 | 山东蓝星东大化工有限责任公司 | 顶空气相色谱分析外标法定量用大粘度标准溶液配制方法 |
CN104789636A (zh) * | 2015-05-12 | 2015-07-22 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种检测微生物时定量稀释的方法 |
CN108517347A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-11 | 江南大学 | 一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用 |
-
2008
- 2008-12-15 CN CNA2008101630506A patent/CN101440392A/zh active Pending
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN104122348A (zh) * | 2014-08-06 | 2014-10-29 | 山东蓝星东大化工有限责任公司 | 顶空气相色谱分析外标法定量用大粘度标准溶液配制方法 |
CN104789636A (zh) * | 2015-05-12 | 2015-07-22 | 广西壮族自治区梧州食品药品检验所 | 一种检测微生物时定量稀释的方法 |
CN108517347A (zh) * | 2018-04-12 | 2018-09-11 | 江南大学 | 一种Bacteroides cellulosilyticus的筛选培养基及其应用 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101440395A (zh) | 一种肠道细菌培养方法及其培养基 | |
EP2918672B1 (en) | Method for determining the sensitivity of microorganisms to antimicrobial substances | |
Akbari et al. | Aerobic bacterial community of American cockroach Periplaneta americana, a step toward finding suitable paratransgenesis candidates | |
Medeiros et al. | Identification of lactic acid bacteria isolated from artisanal Coalho cheese produced in the Brazilian Northeast | |
CN116004429B (zh) | 一种用于防治苹果腐烂病的生防菌株及其应用 | |
CN113801799B (zh) | 酵母菌sll12及其在制备控制枣果实采后病害的生物防治剂中的应用 | |
Cobo et al. | Microbiological contamination in stem cell cultures | |
JANATININGRUM et al. | Comparative study on the diversity of endophytic actinobacteria communities from Ficus deltoidea using metagenomic and culture-dependent approaches | |
CN105755143B (zh) | 一种用于检测菌的试剂盒及检测方法 | |
CN101440392A (zh) | 一种肠道类杆菌培养方法 | |
CN116590199B (zh) | 一种皮尔瑞俄类芽孢杆菌及其在玉米穗腐病防治中的应用 | |
CN116855416B (zh) | 一种拮抗植物病害病原菌的菌株、菌剂及应用 | |
CN101935688B (zh) | 一种检验和计数活体微生物的方法 | |
CN101440393A (zh) | 一种肠道乳酸杆菌培养方法 | |
Wang et al. | Studying safe storage time of orange peel (Citrus reticulata) using high‐throughput sequencing and conventional pure culture | |
Jyotirmayee et al. | Comparative analysis of rhizospheric bacteria associated with four medicinal plants | |
Shade et al. | The kombucha biofilm: a model system for microbial ecology | |
Lin et al. | The Flora Compositions of Nitrogen‐Fixing Bacteria and the Differential Expression of nifH Gene in Pennisetum giganteum zx lin Roots | |
CN112877448B (zh) | 含有特异性分子靶标的蜡样芽胞杆菌标准菌株及其检测和应用 | |
Hussain et al. | Isolation and characterization of salt tolerant bacteria from Saline areas of Khyber Pakhtunkhwa | |
CN107937577A (zh) | 快速检测原料乳中产耐热脂肪酶的荧光假单胞菌的lamp引物组及方法 | |
CN104212896B (zh) | 一种烟草角斑病菌的分子鉴定引物及鉴定方法 | |
CN101440394A (zh) | 一种肠道双歧杆菌培养方法 | |
Jimenez | Microorganisms in the environment and their relevance to pharmaceutical processes | |
CN117551559B (zh) | 一株纤维素分解菌及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090527 |