CN102816707B - 一株产朊假丝酵母菌株及其在制备富硒酵母产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产朊假丝酵母菌株及其在制备富硒酵母产品中的应用。本发明提供的产朊假丝酵母（Candida utilis）S1204，其保藏编号为CCTCC NO:M2012216。上述产朊假丝酵母S1204在生产富硒酵母产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明的实验证明，选育的出一株新的产朊假丝酵母（Candida utilis）S1204，该菌株在进行高生物量发酵的同时具有较高的转硒富硒能力，可制备富硒酵母产品。

Description

一株产朊假丝酵母菌株及其在制备富硒酵母产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株产朊假丝酵母菌株及其在制备富硒酵母产品中的应用。

背景技术

1817年瑞典化学家Berzeliu首次发现元素硒(selenium)后，人们一直把硒作为有毒元素来研究，直到1957年美国科学家Sehwarz等发现硒的营养功效，使人们又从一个崭新的角度来研究硒。1972年Roetueh证实硒是谷肤甘肤过氧化物酶(GPX)活性成分，于是，硒被公认为是生命所必需的微量元素。1973年，世界卫生组织宣布硒是人类必需的微量元素。中国营养学会也于1988年把硒列为必需的营养微量元素。

硒作为人和动物一种必需的营养微量元素，参与组成多种酶的活性结构，在过氧化物的分解和自由基的清除、机体免疫力的调节、有毒元素的拮抗等方面发挥着重要作用

虽然无机硒也能参与肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶的合成，对缺硒引起的疾病起预防和治疗作用，但人体对于无机硒的吸收效果并不理想，过多的无机硒会对机体带来一定的损害。研究表明，有机硒较无机硒毒性小，机体吸收率高。有机硒可克服无机硒的过氧化作用，其生物活性较高，能够有效地在机体内同化，有利于在动物体内吸收利用。目前，人们获得有机硒的主要途径是生物转化，由于微生物具有生长迅速、繁殖快、代谢能力强、适应性强等特点，因此利用微生物进行硒的生物转化不受季节和气候的影响，且生产周期短，近些年来，用微生物作为载体富集人和动物所必需的微量元素，以获得有机态及成本低廉的微量元素添加剂日益引起了各国的关注。

酵母菌具有富集多种微量元素的能力，又是发酵工业中最常用的菌种之一，发酵工艺成熟，生产周期短，是作为元素载体可能性最大的菌种，具有高度的富集硒能力和将无机硒转化为有机硒的能力。因此，开发成本低廉、生物学利用价值高的酵母硒成为近来研究的热点，而且包括硒酵母在内的微量元素载体酵母具有丰富而全面的营养成份,将作为酵母工业的新品种,对酵母工业的发展也会起促进作用。

硒酵母既能提供人体必需的营养元素硒,又能补充人体丰富的蛋白质和多种维生素。其中富硒酵母中的硒多为有机态的硒，其利用率高、毒性低、对环境污染小，很适宜作为补硒的一种营养添加剂。

我国相当一部分地区是缺硒地区,尤其是中国黑龙江地区表现出的急性缺硒而引起的克山病等,如果使用安全的硒酵母,能短期治愈克山病。小剂量服用硒酵母,可以增强肌体免疫力,保护心脏,防癌和延缓衰老。

通过微生物生命活动将无机硒转化为有机硒，是生产富硒食品的一种安全有效的方法。富硒酵母的生产是迄今最常用、最简便的一种生物富硒途径。近年来，对于富硒酵母的研究比较多，但大多数的研究课题中，其菌株的富硒能力都较弱一般含硒量在500-1500mg/kg之间，生物量也很低，很难达到一个大生产需要的高密度的量，而且重现性差。另外，其酵母中硒的形态也主要是吸附在细胞表面或是与细胞混合而成的无机硒形态，硒的有机形态，特别是硒蛋氨酸的含量极低，营养价值有限。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株产朊假丝酵母菌株。

本发明提供的产朊假丝酵母（Candida utilis）S1204，其保藏编号为CCTCC NO:M 2012216。

上述产朊假丝酵母S1204在生产富硒酵母产品中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的另一个目的是提供一种富硒酵母产品。

本发明提供的富硒酵母产品，其活性成分为上述产朊假丝酵母S1204的发酵物。

上述富硒酵母产品中的有机硒含量为4000-10000mg/kg，所述有机硒转化率为98.8%。

上述产品中，所述发酵产物按照如下方法制备：在含无机硒的发酵培养基中发酵上述产朊假丝酵母S1204，得到发酵产物；该方法还可以包括将发酵产物过滤，收集固体过滤产物。

上述产品中，所述含无机硒的发酵培养基中的无机硒为亚硒酸钠，所述亚硒酸钠在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度具体为50-100mg/l。

上述发酵包括如下步骤：

1）在所述含无机硒的发酵培养基发酵上述产朊假丝酵母S1204，得到发酵产物；

2）再向所述发酵产物中添加亚硒酸钠继续发酵，所述亚硒酸钠在所述发酵产物中的终浓度为200mg/L；

所述发酵和所述继续发酵的温度具体均为28℃，所述发酵的时间具体为12h，所述继续发酵的时间具体为22h-28h；

所述发酵和所述继续发酵的溶氧量具体均为50-70%；所述发酵和所述继续发酵的含糖量具体均为1.0-2.0g/100mL，所述发酵和所述继续发酵的pH值具体均为5.5-6.0。

上述含无机硒的发酵培养基按照如下方法制备：将含糖量9-11%（质量百分含量）的麦芽汁、蛋白胨、酵母膏和亚硒酸钠混合得到含无机硒的发酵培养基，所述蛋白胨在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度为15g/L，所述酵母膏在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度为8g/L，所述亚硒酸钠在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度为100mg/L。

本发明的第三个目的是提供一种制备上述富硒酵母产品的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：在含无机硒的发酵培养基中发酵上述产朊假丝酵母S1204，收集发酵产物，即得到富硒酵母产品。

上述方法中，所述含无机硒的发酵培养基中的无机硒为亚硒酸钠，所述亚硒酸钠在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度具体为50-100mg/l。

上述方法中，所述发酵包括如下步骤：

1）在所述含无机硒的发酵培养基发酵上述产朊假丝酵母S1204，得到发酵产物；

2）再向所述发酵产物中添加亚硒酸钠继续发酵，所述亚硒酸钠在所述发酵产物中的终浓度为200mg/L。

上述方法中，所述发酵和所述继续发酵的温度均为28℃，所述发酵的时间为12h，所述继续发酵的时间为22h-28h；

所述发酵和所述继续发酵的溶氧量均为50-70%；所述发酵和所述继续发酵的含糖量均为1.0-2.0g/100mL，所述发酵和所述继续发酵的pH值均为5.5-6.0；

在所述收集发酵产物后还包括如下步骤：过滤所述发酵产物、收集固体过滤产物、干燥所述固体过滤产物，得到富硒酵母产品。

上述含无机硒的发酵培养基按照如下方法制备：将含糖量9-11%（质量百分含量）的麦芽汁、蛋白胨、酵母膏和亚硒酸钠混合得到含无机硒的发酵培养基，所述蛋白胨在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度为15g/L，所述酵母膏在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度为8g/L，所述亚硒酸钠在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度为100mg/L。

上述方法中，在所述发酵前，还包括如下步骤：

1）将上述产朊假丝酵母S1204 CCTCC NO:M2012216接种在斜面培养基28℃培养16h，得到斜面菌株；

2）将上述斜面菌株接种在80mL的种子培养基中28℃、220r/min、振荡培养16h，得到一级种子培养液；

2）将所述一级种子培养液接种在20L的种子培养基中28℃、220r/min、振荡培养16h，得到二级种子液；

3）将所述二级种子培养液接种在250L的种子培养基中28℃、220r/min、振荡培养16h，得到三级种子液。

斜面培养基按照如下方法制备：将葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、琼脂、亚硒酸钠和水混合，得到斜面培养基，其中葡萄糖的终浓度为20g/L,蛋白胨的终浓度为20g/L,酵母膏的终浓度为10g/L,琼脂的终浓度为20g/L,亚硒酸钠的终浓度为30ug/mL。

种子培养基按照如下方法制备：将含糖量9%（质量百分含量）的麦芽汁、蛋白胨、酵母膏和亚硒酸钠混合得到种子培养基，蛋白胨在种子培养基中的浓度为15g/L，酵母膏在种子培养基中的浓度为8g/L，亚硒酸钠在种子培养基中的浓度为50mg/L。初始pH值为5.5。

上述的富硒酵母产品在作为渔业养殖和/或牲畜养殖的饲料添加剂中的应用也是本发明保护的范围。

上述产朊假丝酵母（Candida utilis）S1204，已于2012年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072），保藏编号为CCTCC NO:M2012216，分类命名为产朊假丝酵母菌株S1204（Candidautilis S1204）。

本发明的实验证明，本发明利用分子生物学手段对出发菌株进行乙醇发酵途径的削弱得到的，减少菌株产乙醇的量，提高菌株的好氧生长能力，再结合多次的物理-化学复合诱变，利用高通量的筛选手段，选育的出一株新的产朊假丝酵母（Candidautilis）S1204。该菌株具有高浓度亚硒酸钠耐受性及乙硫氨酸抗性，其在进行高生物量发酵的同时具有较高的转硒富硒能力，该菌株为高效富硒的酵母菌株，可以用来制备富硒产品，该产品中有机硒含量高达9880mg/kg，且99%的硒为有机硒形态，其中硒蛋氨酸占富硒酵母产品有机硒含量的70%。本菌株发酵生产富硒产品的原料来源广泛、操作简便、发酵周期短，而且酵母中的有机硒含量高，尤以活性的硒蛋氨酸为主，其对于饲料添加方面，安全无毒、无副作用，可显著改善动物肉质营养，提高肉质品质，同时促进动物健康发育，提高机体免疫力，具有重大的经济和社会效益。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

产朊假丝酵母菌株（Candida utilis）获自中国工业微生物菌种保藏管理中心(www.china-cicc.org/，简称CICC），CICC编号为1268，简称产朊假丝酵母1268。

麦芽汁制备：大麦芽若干，粉碎后，加入4倍于麦芽重量的水，搅拌均匀，在60℃保温箱内糖化4h，取出过滤，得麦芽汁，测量此麦芽汁的体积和浓度后，分装于已灭菌的三角瓶中，0.6kg/cm²灭菌40min备用，用时将滤液稀释至所需糖度。

实施例1、菌株S1204的获得和保藏

以菌株产朊假丝酵母1268为出发菌（购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，CICC编号为1268），通过多次的物理-化学复合诱变育种和高通量的筛选方法选育高生物量和高转硒的酵母菌种S1204，具体方法如下：

一、菌株的UV（紫外）诱变和NTG（亚硝基胍）的复合诱变处理

取生长对数期的产朊假丝酵母1268菌液5mL以4800r/min离心5min,用无菌水洗涤2次,加入pH7.2磷酸缓冲液,制成菌悬液。取制备好的菌悬液全量置于直径为9cm的无菌平皿内，放入无菌磁力搅拌棒，置磁力搅拌器上，紫外灯预热20min，使光波稳定。菌悬液平皿距15W紫外灯25cm处照射45s，紫外照射后，将处理后的菌悬液加入含有终浓度为0.5%NTG的灭菌试管中（18×180mm），28℃,150r/min，避光振荡处理60min,加入终体积6%硫代硫酸钠溶液终止反应,离心收集菌体，并用无菌生理盐水清洗4次，进行终止NTG诱变反应以及。加入5mL YPD,培养12小时。

二、诱变菌株的亚硒酸钠抗性平板和乙硫氨酸抗性平板的筛选

诱变处理后的过夜培养的菌液，再次离心收集菌体,并用生理盐水洗涤2次。先进行稀释10⁵涂布含亚硒酸钠的抗性平板。将在亚硒酸钠抗性平板长出的菌落进行影印至含有乙硫氨酸的抗性平板上。

经过多次的诱变和筛选过程，获得耐受高浓度亚硒酸钠（200mg/L）以及高乙硫氨酸（4g/L）抗性的酵母菌株，而且其发酵生物量在同等条件下较出发菌株提高了近一倍。获得的高生物量、高耐硒转硒的产朊假丝酵母菌株，编号S1204。

将上述获得的产朊假丝酵母菌株（Candida utilis）S1204，简称富硒酵母S1204，于2012年6月11日保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072），保藏编号为CCTCC NO:M2012216，分类命名为产朊假丝酵母菌株S1204（Candida utilis S1204）。

实施例2、富硒酵母S1204 CCTCC NO:M2012216在富硒中的应用

一、培养基配方的优化

培养基中，麦芽汁为培养基中的主要碳源，添加的糖度为90g/L-110g/L时可得到最高生物量与硒含量；蛋白胨和酵母膏为培养基中的氮源；亚硒酸钠为培养基中的无机硒源选择，种子培养基的初始添加量为50mg/L，发酵培养基的初始添加量为100mg/L,流加补硒的亚硒酸钠浓度为10g/L。

优化培养基具体配方如下：

种子培养基按照如下方法制备：将含糖量90g/L的麦芽汁、蛋白胨、酵母膏和无水亚硒酸钠混合得到种子培养基，蛋白胨在种子培养基中的浓度为15g/L，酵母膏在种子培养基中的浓度为8g/L，亚硒酸钠在种子培养基中的初始添加浓度为50mg/L，该种子培养基初始pH值为5.5。

发酵培养基按照如下方法制备：将含糖量110g/L的麦芽汁、蛋白胨、酵母膏和无水亚硒酸钠混合得到种子培养基，蛋白胨在发酵培养基中的浓度为15g/L，酵母膏在发酵培养基中的浓度为8g/L，亚硒酸钠在发酵培养基中的初始添加浓度为100mg/L，该发酵培养基初始pH值为6。

二、获得富硒酵母产品

1、发酵

（1）斜面菌株培养

将富硒酵母S1204 CCTCC NO:M2012216接种于含葡萄糖20g/L,蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,琼脂20g/L,亚硒酸钠30ug/mL的斜面培养基（18*180mm试管）。28℃，培养16h。

（2）摇瓶一级种子培养

吸取6mL无菌水至18*180mm的试管斜面，洗脱斜面菌株制成菌悬液（3×10⁷个/ml），然后再按2%的接种量接种至含有80mL的种子培养基的500mL摇瓶中，8层纱布封口，28℃振荡培养(220r/min)16h，得到一级种子培养液（种子液的OD_600nm=50）。

（3）二级种子培养

将一级种子培养液按1%（体积百分含量）的接种量移种至含20L种子培养基的50L全自动发酵罐，28℃，pH5.5培养16h，得到摇瓶二级种子培养液（种子液的OD_600nm=70）

（4）三级种子培养

将二级种子培养液按5%（体积百分含量）的接种量移种至含250L种子培养基的500L全自动发酵罐，培养温度28℃，pH6.0，培养16h，得到摇瓶三级种子培养液（种子液的OD_600nm=75）。

（5）发酵培养

将三级种子培养液按12%（体积百分含量）的接种量移种至5M3发酵罐（装液量为45%）28℃，溶氧控制50-70%，含糖量控制1.0-2.0g/100mL，pH维持5.5-6.0，发酵12h后在发酵产物中补加终浓度为200mg/L的亚硒酸钠，再发酵培养22h，发酵菌浓达到OD_600nm=135，收集发酵产物。

2、富硒能力测定

1）收集

将上述发酵产物进行板框过滤，收集富硒酵母细胞，并用清水进行洗涤两次，65℃风干至水分为7%；然后对风干的富硒酵母进行粉碎，最后根据需要进行包装，得到富硒酵母产品。

二、富硒能力的测定

1、有机硒含量检测

准确称取1.000g富硒酵母产品,置于烧瓶中,加入5ml消化液，接上冷凝装置，回流冷凝消化至样液呈无色透明为止；冷却后，消化液转入200ml的烧杯，用大约20ml的蒸馏水洗净；然后用90%的甲酸调节pH至2-3，加入4ml、40%的盐酸羟胺还原过剩的氧化成分,最后将溶液用蒸馏水定溶到50ml，此即为消化好的待测样品。根据亚甲蓝还原法检测待测溶液的显色程度。

亚甲蓝还原法检测原理：在酸性条件下，亚硒酸根可与3,3`-二氨基联苯胺（DAB）作用，生成黄色络合物(Se-DAB)，在一定pH时，使用有机溶剂萃取，根据有机层显色的程度，可进行分光光度法测定富硒酵母产品中的有机硒硒含量。

上述消化液：称取10g钼酸钠,加150ml蒸馏水溶解,缓慢添加150ml浓硫酸,冷却,加入200ml浓度为72%的高氯酸；用饱和的NaOH调节pH在7.0左右。

无水亚硒酸钠、钼酸钠、3,3`-二氨基联苯胺，甲酸、浓硫酸、高氯酸、甲苯等均购自于阿拉丁（上海）试剂有限公司，试剂均为分析纯。

具体方法如下（依次进行以下操作）：

（1）取5支125ml的分液漏斗，分别加入2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml的亚硒酸钠水溶液(1mg/L)，然后均加蒸馏水至40ml；

（2）每支漏斗加入2ml 0.2mol/L的EDTA-2Na水溶液以掩盖干扰离子，用甲酸调节pH至3；

（3）每支漏斗加入4ml 5g/L的DAB水溶液，摇匀，黑暗条件下60℃反应20min；

（4）用浓NaOH调节pH至7.0，然后每支漏斗加入4ml甲苯，充分摇匀，静置4min分层；

（5）将有机层通过脱脂棉滤到1cm的比色皿中，于420nm处测定溶液的吸光度(甲苯作为空白对照)。以吸光值A为横坐标，以硒浓度Y（单位为mg/L）为纵坐标绘制标准曲线。

制备的待测溶液代替亚硒酸钠水溶液进行以上步骤（1）至（5）的实验，将吸光值代入标准曲线Y=0.0126X+0.00151(R²=0.99994)，得到的结果即为富硒酵母产品中的有机硒浓度。

富硒能力(有机硒转化率)=(富硒酵母产品中的有机硒含量/发酵培养基的总的无机硒含量)×100%。

结果为：富硒酵母产品中的有机硒浓度（有机硒含量）达9880mg/kg，而发酵培养基的总的无机硒浓度为10000mg/kg，菌株的富硒能力达98.8%，有机硒含量可适用于多种不同硒需求的饲料的配置。

2、硒蛋氨酸的测定

采用高效液相色谱（HPLC）的方法进行硒蛋氨酸的检测，具体方法如下：

称取0.1g富硒酵母产品粉末于三角瓶中，加入5mL的0.05%的DTT(W/V)、0.05mol/L的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液（ph=7.4）以及50mg的蛋白酶K，50℃水浴震荡8h，反应结束后，冷却至室温（25℃），加入1mg/mL的亚铁氰化钾、0.2mL 1.5g/mL的乙酸钠，充分混匀后于6000转/分钟，离心10min，收集上清液。

取200uL的上述上清液，加入2mL的Na₂CO₃缓冲液（ph=8.5），0.5mL 1g/L的丹磺酰氯衍生溶液，于50℃水浴加入4h，加入0.1mL 20mg/mL的盐酸羟胺溶液终止反应，于避光处静置30min，得到衍生后的酶解液。

衍生后的酶解液经0.22um过滤膜过滤后进行测定，采用外标法计算硒蛋氨酸的含量。高效液相色谱仪采用C18柱（250mm*4.6mm,粒径5um），柱温维持30℃；荧光检测器增益为1，进行量为10ul；洗脱液为32%的10mM磷酸缓冲液和68%的乙腈溶液（比例为体积比）。硒蛋氨酸出峰时间在23min。

其中，硒蛋氨酸（>98%）,梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；丹磺酰氯（>98%）,上海科兴生化试剂有限公司；盐酸羟胺（分析纯）、乙腈（色谱纯）等购自于阿拉丁（上海）试剂有限公司。

测定结果显示：富硒酵母产品中硒蛋氨酸的含量为6970mg/kg,占富硒酵母产品有机硒含量的70%。

Claims (10)

1.产朊假丝酵母（Candida utilis）S1204，其保藏编号为CCTCC NO:M2012216。

2.权利要求1所述产朊假丝酵母S1204在生产富硒酵母产品中的应用。

3.一种富硒酵母产品，其活性成分为权利要求1所述产朊假丝酵母S1204。

4.一种富硒酵母产品，其活性成分为权利要求1所述产朊假丝酵母S1204的发酵产物。

5.根据权利要求4所述的产品，其特征在于：所述发酵产物按照如下方法制备：在含无机硒的发酵培养基中发酵权利要求1所述产朊假丝酵母S1204，得到发酵产物。

6.根据权利要求5所述的产品，其特征在于：

所述含无机硒的发酵培养基中的无机硒为亚硒酸钠，所述亚硒酸钠在所述含无机硒的发酵培养基中的浓度具体为50-100mg/l。

7.一种制备权利要求6所述富硒酵母产品的方法，包括如下步骤：在含无机硒的发酵培养基中发酵权利要求1所述产朊假丝酵母S1204，收集发酵产物，即得到富硒酵母产品。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

所述发酵还包括再向所述发酵产物中添加亚硒酸钠继续发酵的步骤，所述亚硒酸钠在所述发酵产物中的终浓度为200mg/L。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述发酵和所述继续发酵的温度均为28℃，所述发酵的时间为12h，所述继续发酵的时间为22h-28h；

所述发酵和所述继续发酵的溶氧量均为50-70%；所述发酵和所述继续发酵的含糖量均为1.0-2.0g/100mL，所述发酵和所述继续发酵的pH值均为5.5-6.0；

在所述收集发酵产物后还包括如下步骤：过滤所述发酵产物、收集固体过滤产物、干燥所述固体过滤产物，得到富硒酵母产品。

10.权利要求3-6任一所述富硒酵母产品在作为渔业养殖和/或牲畜养殖的饲料添加剂中的应用。