CN108707597A - 一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用。本发明通过克隆苯丙氨酸变位酶基因，构建高效表达的大肠重组菌，大量表达重组酶，采用硫酸铵进一步提纯重组酶，获得工业纯的苯丙氨酸变位酶，将其包埋在多巴胺自组装微囊中，制备成具有较高机械强度的固定化酶催化剂，应用于催化α‑苯丙氨酸合成高纯度的β‑苯丙氨酸。可广泛应用于β‑苯丙氨酸的生产制造领域。

Description

一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用
技术领域
本发明涉及酶工程技术领域，尤其是涉及一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法与应用。
背景技术
β-苯丙氨酸是β-内酯和内酰胺的前体，广泛应用于制药工。β-苯丙氨酸的生产主要是化学合成，由于化学合成路线复杂，反应步骤多，副产物多，导致生产成本高昂。酶学方法由于其专一性高，副产物少，反应条件温和，产率高等优点，是一种绿色生产工艺。苯丙氨酸变位酶(PAM)能催化α-苯丙氨酸(α-phe)的α位氨基异构化至β位，生成β-苯丙氨酸(β-phe)。本发明首先对苯丙氨酸变位酶进行固定化，制备稳定性高，机械强度高的催化剂，用于催化合成β-苯丙氨酸。
传统的固定化酶方法有两种，第一种是采用海藻酸钠、明胶等包裹酶，但是采用海藻酸钠、明胶作为固定化的材料，其酶的活性保存较好，但其机械强度低，不能长时间在反应器中运行，特别是在有搅拌的情况下，酶的重复利用次数较低。第二种是将酶通过共价连接的方式固定在机械强度高的材料上，如二氧化硅、二氧化钛等材料上，但是这种材料需要经过改性嫁接氨基、羟基等活性基团，然后通过戊二醛与酶进行共价交联，这种方法影响酶的结构，对酶的活性伤害较大，酶的活性降低较明显。因而，制备出具有一定机械强度，又不用戊二醛的进行共价交联的包埋方法制备固定化酶具有更好的应用价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种固化的苯丙氨酸变位酶及其固化方法，解决现有苯丙氨酸变位酶的固化方法不能同时保证机械强度和酶活性的问题。
本发明的另一个目的是提供β-苯丙氨酸的合成方法，解决现有化学法合成β-苯丙氨酸，副产物多，转化率低，光学度低的问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种固化的苯丙氨酸变位酶，包括苯丙氨酸变位酶，其特征在于：所述苯丙氨酸变位酶包覆在精蛋白内，所述精蛋白的表面设置有硅酸钠层，所述硅酸钠层的外围包覆有多巴胺。
一种苯丙氨酸变位酶的固化方法，包括以下步骤：
1)将苯丙氨酸变位酶与碳酸钙(CaCO3)溶于聚苯乙烯磺酸钠(PSS)溶液中搅拌反应组装成CaCO3(PSS)PAM微粒；
2)将CaCO3(PSS)PAM微粒置于Tris-Hcl缓冲液中并加入精蛋白进行震荡处理得精蛋白-CaCO3(PSS)PAM微粒；
3)将精蛋白-CaCO3(PSS)PAM微粒加入硅酸钠溶液和Tris-Hcl缓冲液中反应30min得精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球；
4)将精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球和多巴胺一起加入Tris-Hcl缓冲液中反应12小时后得多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球；
5)将多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球和乙二胺四乙酸加入Tris-Hcl缓冲液中震荡处理得多巴胺-精蛋白-氧化硅-PSS-PAM的固定化酶微球，实现苯丙氨酸变位酶的固化。
进一步的，所述苯丙氨酸变位酶是将苯丙氨酸变位酶在大肠杆菌中进行表达后获得的。
所述苯丙氨酸变位酶的获得方法优选将SEQ ID NO.1所示的基因与大肠杆菌表达载体pET28a连接，将连接后的产物转入E.coli BL21中进行表达，得到苯丙氨酸变位酶。
所述的苯丙氨酸变位酶的固化方法还包括对酶进行纯化，具体步骤如下：(1)收集重组菌，破碎菌体后，离心取上清液，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为40％，缓慢搅拌使其完全溶解；(2)调节pH值使酶液的pH保持在8，静置半小时后离心收集上清液，继续加入硫酸铵至饱和度为60％，室温静置4～6小时后，离心收集蛋白沉淀；(3)将沉淀溶解在50mMTris-Hcl缓冲液中透析12小时得纯化后的苯丙氨酸变位酶，中间每隔4小时换一次Tris-Hcl缓冲液；所述Tris-Hcl缓冲液的pH为8。
一种应用固化的苯丙氨酸变位酶合成β-苯丙氨酸的方法，将α-苯丙氨酸、氨水和固定化的苯丙氨酸变位酶加入Tris-Hcl缓冲液中混合反应得β-苯丙氨酸。
进一步的，所述Tris-Hcl缓冲液的PH值为8.5，反应温度为30℃。
本发明的有益效果：本发明通过重组大肠杆菌高效表达苯丙氨酸变位酶，并通过硫酸铵进一步提纯苯丙氨酸变位酶，将其包埋在多巴胺自组装微囊中，从而使苯丙氨酸变位酶即有很高的机械强度，又具备很好的活性。采用本发明制得的固化的苯丙氨酸变位酶合成β-苯丙氨酸，具有得率高，光学纯度高的优点。
以下将结合附图和实施例，对本发明进行较为详细的说明。
附图说明
图1为本发明中菌体的SDS-PAGE检测酶表达结果图。
图2为本发明SDS-PAGE检测制备的工业纯的酶
图3苯丙氨酸变位酶的固定化流程
图4为本发明中微囊的TEM表征结果。
图5为本发明中微囊的FTIR表征结果。
图6为本发明中微囊的孔道结构分析结果。
图7为本发明中HPLC检测反应底物和产物的结果。
具体实施方式
实施例1：构建高效表达苯丙氨酸变位酶工程菌
将来源于Pantone agglomerans的苯丙氨酸变位酶的基因序列(见NCBI公布的收录编号为AY192157.1的序列)，同时在基因序列的5′端和3′端分别加上EcoRⅠ(CGGAATTC)和HindⅢ(CCCAAGCTT)的酶切识别序列，基因序列如SEQ ID NO.1所示，然后提交给上海生工生物工程技术有限公司合成该酶的基因，并命名为pam，将上述该基因pam与克隆载体pUC载体连接，获得克隆载体pUC-pam。将克隆载体pUC-pam和空表达载体pET28a分别用限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ进行双酶切，割胶回收目的基因片段和pET28a载体，然后将双酶切产物于16℃下过夜连接，将连接产物转入大肠杆菌E.coli JM109中，涂布含有50μg/mL的卡那霉素的LB平板上，于37℃培养，挑选单菌落，采用菌落PCR和质粒双酶切进行鉴定阳性克隆，得到重组质粒并命名为pET28a-pam。将测序正确的质粒pET28a-pam转化大肠杆菌E.coliBL21感受态细胞，而后涂布于含Kan抗性(50mg/L)的LB平板上，于37℃条件下培养8h，挑选阳性转化子，即为能够产生如SEQ ID NO：2所示的苯丙氨酸变位酶的宿主细菌。
实施例2苯丙氨酸变位酶的生产
(1)酶的诱导表达
将含有pET28a-pam质粒的E.coli BL21细胞于5mL的LB培养基中37℃培养10h，取1mL培养液至100mL的LB培养基中37℃培养至OD600为0.6时加入诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为0.4mM，24℃下诱导表达12h后离心收集菌体，进行SDS-PAGE检测和酶活性测定如图1所示，从图1中的泳道1和2是含有pET28a-pam质粒在E.coli BL21表达结果，泳道3,4，5是对照，不含有pET28a-pam质粒的E.coli BL21的表达结果，SDS-PAGE结果表明酶成功在大肠菌实现高效的表达。
(2)工业纯酶的制备
将步骤(1)中的重组菌发酵培养扩大至1000mL，24℃下诱导培养12h后离心收集菌体，，菌体用Tris-Hcl缓冲液(25mL，pH8)洗涤2次，洗去残余的培养基，清洗后的菌体采用超声波破碎，10000g离心5min，取上清，向上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为40％，缓慢搅拌使其完全溶解。调节pH值，使酶液的pH保持在8，静置半小时后以15000r/min离心处理20min，收集上清液继续加入硫酸铵至饱和度为60％，室温静置1-2小时后，以15000r/min离心处理20min收集蛋白沉淀。将蛋白沉淀溶解在25mM pH为8的Tris-HCl缓冲液中透析12h，中间每个4h换一次缓冲液，即获得工业纯的苯丙氨酸变位酶，如图2所示。
实施例3固定化酶的制备
苯丙氨酸变位酶的固定化过程如图3所示，需要经过5步反应过程。首先酶与CaCO3在聚苯乙烯磺酸钠(PSS)的作用下组装成微粒(CaCO3(PSS)PAM)，酶被包埋CaCO3微粒中，然后用精蛋白包裹微粒CaCO3(PSS)PAM，加入硅酸钠，硅酸钠在精蛋白的表面进行硅化作用，形成微粒的硅外壳，这层硅外壳主要作用是增加固定化微囊的机械强度，然后多巴胺在硅外壳完成自组装，形成包裹有酶的微囊，最后用乙二胺四乙酸(EDTA)把微囊中的碳酸钙微粒去除，微囊的囊腔中仅仅包埋了酶，完成了酶的固定化，详细的制备过程如下：
(Ⅰ)将100mg聚苯乙烯磺酸钠(PSS)粉末加入到50mL CaCO3(0.5M)和含有20mg酶蛋白(PAM)溶液中搅拌溶解，制得PSS掺杂的碳酸钙包裹PAM的微粒(CaCO3(PSS)PAM)，然后用离心机在3000r/min离心收集，并用去25mM的Tris-Hcl缓冲液(pH8.0)洗涤3次，除去多余的PSS。
(Ⅱ)取10g CaCO3(PSS)PAM微粒分撒于50mL的Tris盐酸缓冲(25mM，pH8.0)，加入10g精蛋白并溶解后震荡(100r/min)30min，用Tris盐酸缓冲(25mM，pH8.0)洗涤3次，除去未吸附的精蛋白，离心分离，弃去上清液，沉淀部分留用。用Tris盐酸缓冲(25mM，pH8.0)配置20mM的硅酸钠溶液，等量加入沉淀部分，摇匀并反应30minmin后低速离心(3000r/min)3-5min，弃上清液，洗涤3次去除未反应的硅硅酸钠，即得精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球。
(Ⅲ)精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球，分散于含有10g多巴胺的Tris盐酸缓冲溶液(50mL，25mM，pH8.0)中，磁力搅拌12h后用Tris盐酸缓冲溶液(50mL，25mM，pH8.0)洗涤3次，离心分离弃上清液得到多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球。
(Ⅳ)多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球用Tris盐酸缓冲溶液(50mL，25mM，pH8.0)中分散，加入0.2M的EDTA震荡(100r/min)30min，使微粒分散均匀，离心收集沉淀部分，用Tris盐酸缓冲溶液(25mM，pH8.0)洗涤3次以至完会去除CaCO3和EDTA，即达到多巴胺-精蛋白-氧化硅-PSS-PAM的固定化酶微球
实施例4固定化酶性质表征
(1)TEM表征结果
透射电子显微镜(TEM)：将微囊悬浮液稀释后滴在铜网上，自然晾干，用TEM表征反应产物的形貌，结果如图4所示，微囊呈现中空结构。杂化微囊具有较高的机械强度，并没有产生塌陷，其直径约为3-5μm。
(2)红外光谱分析(FTIR)
为确认合成的微囊的化学组成，FTIR表征结果，如图5所示，3500cm-1和3000cm-1之间处的吸收峰来源于精蛋白的氨基；1000cm-1和500cm-1之间的峰是Si-O-Si的吸收峰，来源于氧化硅，表明在组装过程中，硅酸钠在精蛋白的诱导下发生硅化作用。2000cm-1到1500cm-1之间为聚多巴胺的苯环振动吸收峰，结果表明合成的微囊是由精蛋白、氧化硅、多巴胺构成。
(3)N吸附
由于本研究中制备的PSi-PDA杂化微囊目的是用于多酶固定化，因此微囊孔道结构直接影响底物和产物的传质，因此通过氮气吸附脱附对微囊的孔道结构进行分析。如图6所示，从孔径分布曲线中可知，孔径约为2.4nm。酶分子的动力学直径一般为5-20nm，因此PSi-PDA杂化微囊可以实现对酶分子的包埋。对于底物产物分子直径小于2.4nm的底物产物可以自由进出微囊。
实施例5β-苯丙氨酸合成工艺
向25mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中添加10mmol的α-苯丙氨酸、4M的氨水，同时用稀盐酸调节pH，保持溶液的pH为8.5。添加25mg上述制备的固定化酶，在温度为30℃的条件下转化合成β-苯丙氨酸，利用高效液相色谱仪(HPLC)监测反应进程。HPLC检测分析用C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)检测β-苯丙氨酸和底物α-苯丙氨酸，流动相为甲醇(0～15min，甲醇体积分数由20％～50％)，进样10μL，流速1mL/min，柱温20℃，检测波长260nm。，检测结果如下图7所示，图7a是10mmol的标准α-苯丙氨酸和β-苯丙氨酸的HPLC图；图7b是在反应体系中添加10mmol的底物α-苯丙氨酸的HPLC图；图7c是10mmol底物在固定化酶催化反应12h后的HPLC图，从图7c中可知，经过12h的反应，未检测到底物，转化率达到96％，光学纯度达到99％。光学纯度达到99％表示HPLC图上未检测到底物，全部是产物β-苯丙氨酸。
以上结合附图对本发明进行了示例性描述。显然，本发明具体实现并不受上述方式的限制。只要是采用了本发明的方法构思和技术方案进行的各种非实质性的改进；或未经改进，将本发明的上述构思和技术方案直接应用于其它场合的，均在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种固化的苯丙氨酸变位酶，包括苯丙氨酸变位酶，其特征在于：所述苯丙氨酸变位酶包覆在精蛋白内，所述精蛋白的表面设置有硅酸钠层，所述硅酸钠层的外围包覆有多巴胺。
2.一种苯丙氨酸变位酶的固化方法，包括以下步骤：
1)将苯丙氨酸变位酶与碳酸钙溶于聚苯乙烯磺酸钠溶液中搅拌反应组装成CaCO3(PSS)PAM微粒；
2)将CaCO3(PSS)PAM微粒置于Tris-Hcl缓冲液中并加入精蛋白进行震荡处理得精蛋白-CaCO3(PSS)PAM微粒；
3)将精蛋白-CaCO3(PSS)PAM微粒加入硅酸钠溶液和Tris-Hcl缓冲液中反应30min得精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球；
4)将精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球和多巴胺一起加入Tris-Hcl缓冲液中反应12小时后得多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球；
5)将多巴胺-精蛋白-氧化硅-CaCO3(PSS)PAM微球和乙二胺四乙酸加入Tris-Hcl缓冲液中震荡处理得多巴胺-精蛋白-氧化硅-PSS-PAM的固定化酶微球，实现苯丙氨酸变位酶的固化。
3.如权利要求2所述的苯丙氨酸变位酶的固化方法，其特征在于：所述苯丙氨酸变位酶是将苯丙氨酸变位酶在大肠杆菌中进行表达后获得的。
4.如权利要求3所述的苯丙氨酸变位酶的固化方法，其特征在于：将SEQ ID NO.1所示的基因与大肠杆菌表达载体pET28a连接，将连接后的产物转入E.coli BL21中进行表达，得到苯丙氨酸变位酶。
5.如权利要求4所述的苯丙氨酸变位酶的固化方法，其特征在于：还包括对酶进行纯化，具体步骤如下：(1)收集重组菌，破碎菌体后，离心取上清液，上清液中加入硫酸铵粉末，至饱和度为40％，缓慢搅拌使其完全溶解；(2)调节pH值使酶液的pH保持在8，静置半小时后离心收集上清液，继续加入硫酸铵至饱和度为60％，室温静置4～6小时后，离心收集蛋白沉淀；(3)将沉淀溶解在50mM Tris-Hcl缓冲液中透析12小时得纯化后的苯丙氨酸变位酶，中间每隔4小时换一次Tris-Hcl缓冲液；所述Tris-Hcl缓冲液的pH为8。
6.一种应用固化的苯丙氨酸变位酶合成β-苯丙氨酸的方法，其特征在于：将α-苯丙氨酸、氨水和固化的苯丙氨酸变位酶加入Tris-Hcl缓冲液中混合反应得β-苯丙氨酸。
7.如权利要求6所述应用固化的苯丙氨酸变位酶合成β-苯丙氨酸的方法，其特征在于：所述Tris-Hcl缓冲液的pH值为8.5，反应温度为30℃。
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