CN101665802A - 一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体及构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明主要涉及一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体，该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，产油酵母表达载体含有千年桐SAD基因，或同时含有Sh ble基因；其构建方法步骤如下：1.千年桐SAD基因cDNA编码区全长序列获得；2.SAD正义表达载体构建；3.Zeocin抗性标记基因Sh ble的克隆；4、酵母表达载体构建及农杆菌转化。本发明有益的效果：本发明将从千年桐种子总RNA中分离的SAD基因构建到酵母表达载体pCAMBIA2300上，为产油酵母油酸含量的提高提供基因转移供体。本发明根据毕赤酵母表达载体pPICZ B设计引物分离了Zeocin抗性基因Sh ble，与上述重组载体连接组成新载体，大大简化了产油酵母遗传转化过程，对于筛选具有Zeocin抗性的转SAD基因的产油酵母具有重要作用。

Description

一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体及构建方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，主要涉及一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体及构建方法，具体涉及酵母表达载体重组，新建表达载体产物可用博来霉素筛选转千年桐SAD基因的产油酵母转化子。

背景技术

为应对愈演愈烈的石油危机，世界各国都在积极制定和实施新的能源发展战略，希望通过各种可能途径寻找到新的石油替代品，生物柴油便是其中之一。目前，生产生物柴油的原料主要依赖于油料作物、木本油料人工林、动物脂肪及废弃油脂等。从油料树木中提取油脂，具有占用耕地面积、周期长、成本高等一系列制约因素。发展动物油脂也同样面临一系列制约因素。因此，开辟新的植物源油脂生产途径，特别是工业化生产途径对满足不断增长的生物柴油的需求具有重要意义。

研究发现，除高等植物和动物能生产油脂外，低等的微生物也能产生油脂，大部分微生物油脂的脂肪酸组成和一般植物油相似。通常情况下微生物细胞仅含油2～3％，但在适宜条件下，某些微生物产生并贮存的油脂占其生物总量的20％以上，在已知细菌、酵母、霉菌和藻类中都发现有产油脂的菌株。利用微生物作为生物反应器生产脂肪酸，为生物柴油原料生产开辟了一条新的技术途径。微生物生产油脂时，具有增殖快，生长周期短，适合工厂化生产，投入较少，收获稳定，不受季节、气候等环境条件影响，且不消耗化学肥料和农药，因而对环境污染减轻。但目前微生物存在产油率低，油脂成分组成复杂，与生产优质生物柴油的原料要求仍为较大距离。运用分子生物学技术，将植物脂肪酸合成相关基因特别是控制产脂量和脂肪酸品质的基因导入真菌中，构建优质“基因工程菌株”，使植物脂肪酸合成酶基因在微生物细胞中的高效表达，增加微生物产脂量，提高和控制脂肪酸组成。此种新方式可从根本上解决微生物产脂菌油质差、产油率低的缺陷，又可充分发挥微生物适合于生物反应器发酵以及林源优质脂肪酸合成酶的优点。

Δ9硬脂酰-ACP脱饱和酶(Stearoyl-ACP desaturase，简称：SAD)是目前研究最多、最广泛的Acyl-ACP脱饱和酶。该酶催化的反应是在第9～10碳原子之间形成第一个双键，是不饱和脂肪酸生物合成途径的第一步脱饱和，直接调控膜脂与贮脂中饱和与不饱和脂肪酸的比例，该酶对调节油料作物种子中脂肪酸含量和组分具有非常重要的意义。千年桐是生产生物柴油的理想树种之一，将千年桐的SAD基因构建在酵母表达载体上并整合到产油酵母中高效表达，使产油酵母的饱和脂肪酸向油酸转化，从而大大提高油脂成分中油酸的含量，为酵母产油符合生物柴油的质量要求奠定基础。

目前高效筛选产油酵母转化子的表达载体还鲜见报道。酵母是一种重要的基因表达系统，其中酿酒酵母和毕赤酵母应用最广，但它们的表达载体在产油酵母中没有相应的表达元件，因此不能直接作为产油酵母的表达载体。pCAMBIA系列的表达载体是植物中常用的表达载体，其中pCAMBIA3300被改造后曾被用于转化产甘油的假丝酵母，获得了转基因工程菌。pCAMBIA2300也属于这类表达载体，但它本身所携带的抗性标记基因——新霉素磷酸转移酶基因(NPTII)具有卡那霉素抗性，而产油酵母对卡那霉素不是很敏感，因此也不能直接作为产油酵母的表达载体。新一代的毕赤酵母表达质粒pPICZ A、B、C具有博来霉素(Zeocin)抗性标记基因Sh ble，重组转化子可直接用Zeocin进行筛选。Sh ble基因编码一种13,665Da的蛋白，具有Zeocin抗性的细胞可以避免Zeocin结合和剪切细胞DNA。Zeocin可用于选择哺乳动物细胞系、酵母、昆虫和细菌。在含Zeocin平板上生长的酵母转化子中，100％具有外源基因的整合，大大简化了重组转化酵母的筛选过程。将Sh ble基因从pPICZ A、B、C表达载体上克隆下来连接到常用的表达载体上，使该载体获得Zeocin抗性，有利于产油酵母转化子的筛选。

发明内容

本发明的目的是克服上述技术的不足，而提供一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体及构建方法。

本发明目的通过以下技术方案来实现：

本发明所述的用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体，该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，其所含的Sh ble基因，适用于筛选具有Zeocin抗性的转基因产油酵母；该载体含有千年桐SAD基因，可以改变产油酵母脂肪酸成分从而提高油酸含量。

本发明所述的用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体的构建方法，步骤如下：

1、千年桐SAD基因cDNA编码区全长序列获得

根据在GenBank上登录的SAD基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，以千年桐种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，获得SAD全长cDNA，电泳回收SAD基因cDNA片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-Vesad。

2、SAD正义表达载体构建

结合表达载体pCAMBIA2300的限制性内切酶切位点——Kpn I、Sma I、BamH I、Xba I、Sal I、Pst I，分析SAD基因的限制性内切酶酶切位点，由于SAD基因不含Sal I、Kpn I，因此选用Sal I、Kpn I两个限制性内切酶来作为插入SAD基因的酶切位点。设计正义引物带KpnI、反义引物带Sal I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应。将扩增产物与表达载体pCAM2300分别用Sal I和Kpn I双酶切。电泳后回收扩增产物和pCAMBIA2300的酶切产物，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为pCAM2300-sad。

3、Zeocin抗性标记基因Sh ble的克隆

根据pCAM2300-sad酶切位点特征，选择作为Sh ble基因的插入位点，设计包含Sh ble基因TEF1、EM7双启动子引物，两端含HindIII酶切位点，以毕赤酵母表达载体pPICZ B为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pGEM T-Easy载体上，转化大肠杆菌E.coli DH 5α，测序。命名该克隆载体为pGEM-T-Z。

4、酵母表达载体构建及农杆菌转化

用HindIII分别酶切pCAM2300-sad和pGEM-T-Z，回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞。提取质粒进行酶切鉴定。表达载体命名为pCAM2300-sad-z。

本发明有益的效果：

1、本发明将从千年桐种子总RNA中分离的SAD基因构建到酵母表达载体pCAMBIA2300上，为产油酵母油酸含量的提高提供基因转移供体。

2、本发明根据毕赤酵母表达载体pPICZ B设计引物分离了Zeocin抗性基因Sh ble，与上述重组载体连接组成新载体，大大简化了产油酵母遗传转化过程，对于筛选具有Zeocin抗性的转SAD基因的产油酵母具有重要作用。

附图说明

图1：千年桐sad全长cDNA的RT-PCR结果，其中M是分子量标准DL2000，1为扩增得到的目的基因片段。

图2：重组质粒载体pCAM2300-sad酶切电泳图，其中，2为重组质粒，1.3.4为表达载体酶切产物。

图3：重组质粒载体pCAM2300-sad-z酶切电泳图，其中M为分子量标准DL2000，1为非重组质粒，2，3，4为重组质粒HindIII酶切产物

图4：质粒pCAM2300-sad-z表达载体构建过程。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的内容并不局限于此。

1实验材料

1.1植物材料

2006年8月25日至9月10日，从中国林业科学研究院亚热带林业研究所树木园采取千年桐发育中的果实，将种子剥出在液氮中速冻后-80℃冰箱保存备用。

1.2菌株与质粒

大肠杆菌E.coli DH5α、根癌农杆菌EHA 105为本实验室保存。质粒pCAMBIA2300为本实验室保存，克隆载体pGEM-T Easy购自Promega公司。

1.3主要生化试剂

RNA提取试剂盒购自天泽基因工程有限公司(四川绵阳)；cDNA合成试剂盒、IPTG、X-gal、购自上海生工生物工程技术有限公司；质粒提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司；高保真DNA聚合酶PrimeSTAR^TM HS DNAPolymerase、大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞、T₄连接酶、限制性内切酶EcoR I、BamH I、Xbal I、Sal I、Kpn I均购自宝生物工程(大连)有限公司。引物合成及菌液测序分别由上海生工生物工程技术有限公司和上海联合基因公司完成。

2实验方法

2.1千年桐发育中种子总RNA提取

(1)液氮研磨破碎细胞，取约100mg左右的细粉至新离心管中；

(2)加入1mL溶液A振荡混合30s；

(3)加入0.3mL溶液B和0.2mL氯仿，振荡混匀；

(4)室温离心13000g，5min，取上清(约0.8mL)移至新离心管中；

(5)加入0.5mL溶液C和0.2mL氯仿，振荡混匀；

(6)室温离心13000g，3min，取上清(约950mL)移至新管中；

(7)加1/2体积的溶液D，振荡混匀；

(8)室温离心13000g，5min，形成白色沉淀；

(9)加1mL75％乙醇振荡混匀，离心13000g，3min，弃上清；

(10)重复步骤9，吹干后溶于30uL DEPC处理的纯水中。

(11)取2uL在1.0％的琼脂糖凝胶中快速电泳检测总RNA的完整性。于-80℃保存待用。

2.2反转录

运用(上海生工)AMV第一链cDNA合成试剂盒，以总RNA为模板，合成cDNA第一链。具体方法如下：

(1)冰浴中加：

总RNA                3uL

下游特异性引物       1uL

无RNA酶去离子水      3uL

总体积               7uL

(2)混匀离心3～5s，70℃5min，冰浴30s

(3)冰浴加入：

5×Reaction Buffer   4uL

RNA酶抑制剂(20U/uL)  1uL

dNTP(10mM)           2uL

(4)混匀离心，37℃5min，加入1uLM-MLV RT(20U/uL)，混匀。

(5)37℃60min；最后70℃保温10min。

2.3  PCR扩增SAD基因cDNA编码区全长

根据在GenBank上登录的SAD基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，引物序列如下：

VesadF1：AAC AAT ggC NNT NAA gNT CAA

VesadR1：TgCACTNANAgC TNCACTTCT

其中N为A、T、C、G为四碱基兼并。以2.2合成的cDNA为模板，以Vesad F1、VesadR1为引物，PCR扩增千年桐SAD基因cDNA编码区。扩增条件为：94℃预变性4min，94℃30S、58℃30S、72℃1min，30个循环，72℃延伸10min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。结果如图1。

2.4博来霉素(Zeocin)抗性基因Sh ble的克隆

根据pCAM2300酶切位点特征，即含有HindIII，设计包含Sh ble基因、TEF1、EM7双启动子引物：

Z1：gCg AAT TCA CgC ACT CAA gCT

Z2：ggT CTA gAT TAC AgC TgC ACT TCT CTT T

以毕赤酵母表达载体pPICZ B为模板，以Z1、Z2为引物，扩增Sh ble基因。扩增条件为：98℃预变性5min，98℃10S、57℃15S、72℃1min10s，30个循环，72℃延伸7min。扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

2.5扩增产物的克隆和测序

2.5.1PCR产物的回收

将SAD cDNA和Sh ble基因用B型小量DNA片断快速胶回收试剂盒(博大泰克)进行特异性扩增产物的回收纯化，操作步骤如下：

(1)在1.0％的琼脂糖凝胶中电泳，使扩增产物分离形成特异带；

(2)切下目的条带置离心管中；

(3)加700uL溶胶液，55℃溶胶，其间偶尔摇动；装柱，12000rpm，离心30s；去掉废液；

(4)加入500uL漂洗液(wash buffer)漂洗，12000rpm离心30s。重复漂洗一次。倒掉废液后再于12000rpm离心2min；

(5)加入45uL的洗脱缓冲液(Elution buffer)或水，室温放置2min，12000rpm离心。管底溶液即为回收的目的片断。

2.5.2回收产物的连接和转化

回收产物连接到pGEM T-Easy载体上，按照Promega公司pGEM-T Easy连接试剂盒说明书进行操作。转化按照宝生物E.coli DH 5α感受态转化方法进行。

(1)将回收纯化的PCR产物连接到pGEM-T Easy载体上，在离心管中分别加入下列成分：回收产物4uL；T载体1uL；2×T₄Buffer 5uL；T₄DNA连接酶(3U/uL)1uL；轻轻混匀后离心收集到管底，16℃过夜连接。

(2)从-80℃冰箱中取100uL感受态细胞，室温下解冻后立即置冰上；

(3)加入5uL连接产物，混匀，冰浴30min；

(4)42℃水浴热击90s，迅速置于冰上冷却3～5min；

(5)向管中加入1mL LB液体培养基(不含Amp)，混匀后37℃振荡培养1h，使菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Amp^r)；

(6)将上述菌液摇匀后取200uL加入40uL X-gal及4uL IPTG混合均匀，涂布于含Amp的筛选平板上。37℃倒置过夜培养。

(7)白色菌落为重组子。

2.5.3质粒DNA提取

将5mL含Amp(50mg/L)LB液体培养基加入到50mL小三角瓶中，挑取白色单菌落37℃振荡过夜。质粒提取按照博大泰克公司试剂盒描述的方法进行。

(1)取1-3mL在LB培养基中过夜培养的菌液，12000rpm离心30s，弃尽上清。

(2)用250uL已加入RNaseA的溶液I均匀悬浮细菌沉淀，室温放置5min；

(3)加入250uL溶液II，温和上下翻转4-6次混匀，使菌体充分裂解；

(4)加入350uL溶液III，上下翻转6-8次混匀，12000rpm离心10min；

(5)吸取离心上清并转移到DNA制备管中，12000rpm离心1min；

(6)将制备管放回离心管，加入500uL的Buffer W1，12000rpm离心1min；弃滤液；

(7)将制备管放回离心管，加入700uL的Buffer W2，12000rpm离心1min；弃滤液；重复洗涤一次。

(8)将制备管移入新的离心管中，在膜正中央加40-60uL水，室温静置1min；12000rpm离心1min。将收获的重组质粒于-20℃保存。

2.5.4质粒的酶切鉴定及测序

根据pGEM T-Easy载体的图谱，选用EcoR I限制性内切酶对提取的质粒进行鉴定。将酶切鉴定的阳性克隆对应的菌液，送往上海联合基因集团公司联众基因科技研究院测序部进行测序。命名该载体为pGEM-T-Vesad，全长4206bp，其特征在于所含SAD基因可作为构建其它表达载体的供体，在添加Amp的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌E.coli DH 5α然后提取质粒就能大量生产该载体。

2.6含SAD基因的表达载体构建

根据测序结果进行酶切位点分析，结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点图谱，选用Sal I、Kpn I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点。

设计带Sal I、KpnI酶切位点的引物：

Vesad F2：gAT gTC gAC ATg NCN NTC AAg NT

Vesad R2：gAC ggT ACC TNANAg CTN CAN TT

以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应。将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I双酶切。分别回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞。将菌液涂布在含Kan的LB平板上，37℃倒置培养过夜。碱法提取质粒DNA，双酶切质粒来验证目的片段插入是否正确，结果如图2。表达载体命名为pCAM2300-sad，全长9933bp，其特征在于所含SAD基因能在植物、真菌中表达，在添加Kan的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌E.coli DH 5α然后提取质粒就能大量生产该载体。

2.7含SAD、Sh ble双基因的酵母表达载体构建

根据pCAM2300-sad上的限制性酶切位点图谱，选用HindIII作为插入片段的酶切位点。以pPICZ B为模板扩增的Sh ble基因两端已包含HindIII酶切位点，将扩增产物与pCAM2300-sad一起用HindIII酶切，分别回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞。将菌液涂布在含相应抗生素的LB平板上，37℃倒置培养过夜。提取质粒，由于Sh ble基因自带TEF1、EM7双启动子及CYC1终止子，因此不用验证其插入方向，直接用HindIII酶切，结果如图3。表达载体命名为pCAM2300-sad-z。该载体全长11122bp，其特征在于所含SAD基因能在植物、真菌中表达，在添加Zeocin的液体LB培养基中繁殖含该载体的大肠杆菌E.coli DH 5α然后提取质粒就能大量生产该载体。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (3)

1、一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体，其特征在于：该载体以pCAMBIA2300为基本骨架，产油酵母表达载体含有千年桐SAD基因。

2、根据权利要求1所述的用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体，其特征在于：所述产油酵母表达载体同时含有Sh ble基因。

3、一种构建如权利要求1所一种用Zeocin筛选千年桐SAD基因的产油酵母表达载体的方法，其特征在于：该方法包括步骤如下：

(1)千年桐SAD基因cDNA编码区全长序列获得

根据在GenBank上登录的SAD基因核苷酸和氨基酸序列设计兼并引物，以千年桐种子总RNA为模板，经RT-PCR扩增，获得SAD全长cDNA，电泳回收目的片段，克隆到pGEM T-Easy载体，转化大肠杆菌DH5α，测序，命名该载体为pGEM-T-Vesad；

(2)SAD正义表达载体构建

根据测序结果进行酶切位点分析，结合表达载体pCAMBIA2300的限制性酶切位点图谱，选用Sal I、Kpn I两个位置来作为插入目的片段的酶切位点；设计带Sal I、Kpn I酶切位点的引物，以克隆载体质粒pGEM-T-Vesad为模板进行PCR反应；将扩增产物与表达载体pCAM2300一起均用Sal I和Kpn I双酶切；分别回收相应的片段，用T₄DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞；提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为pCAM2300-sad；

(3)博来霉素(Zeocin)抗性标记基因Sh ble的克隆

根据pCAM2300-sad酶切位点特征，选择作为Sh ble基因的插入位点，设计包含Sh ble基因TEF1、EM7双启动子引物，两端含HindIII酶切位点，以毕赤酵母表达载体pPICZ B为模板，用高保真DNA聚合酶进行PCR扩增，电泳回收目的片段，克隆到pGEM T-Easy载体上，转化大肠杆菌E.coli DH 5α，测序，命名该克隆载体为pGEM-T-Z；

(4)酵母表达载体构建及农杆菌转化

用HindIII分别酶切pCAM2300-sad和pGEM-T-Z，回收相应的片段，用T4DNA连接酶进行连接，转化E.coli DH 5α感受态细胞，提取质粒进行酶切鉴定，表达载体命名为pCAM2300-sad-z。

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