CN102212592A - 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 - Google Patents
酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102212592A CN102212592A CN2011101087935A CN201110108793A CN102212592A CN 102212592 A CN102212592 A CN 102212592A CN 2011101087935 A CN2011101087935 A CN 2011101087935A CN 201110108793 A CN201110108793 A CN 201110108793A CN 102212592 A CN102212592 A CN 102212592A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lipase
- maltose
- yeast display
- laurate
- organic solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法,包括:将麦芽糖和月桂酸溶于有机溶剂中,加入酵母展示脂肪酶,于50~60℃反应10~14小时,分离、纯化制得麦芽糖月桂酸酯;将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶;本发明通过将脂肪酶展示在细胞外,利用该酶制剂催化合成麦芽糖月桂酸酯,不仅提高了转化效率,而且缩短了反应时间,降低了生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域,尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法。
背景技术
糖酯是一类用可再生资源合成的、无毒、易生物降解的非离子型表面活性剂,并且可以通过调控脂肪酸和糖的种类以及酰化的程度来合成不同HLB值的产物。虽然目前对麦芽糖酯的研究报道不多,但其在食品、化妆品等领域具有广阔的应用潜力。
目前市售的糖酯产品基本上是化学合成的,产物为复杂的混合物,要得到高纯度的产品需进行繁杂的分离工作。而且,酯化反应作用位点难以控制,欲得到指定结构的单一产物十分困难,往往需要冗长的保护和去保护的步骤。脂肪酶是目前糖酯合成中使用最广泛的酶,但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法,可显著降低麦芽糖月桂酸酯生产成本,同时达到较高的酯化反应效率和产率。
一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法,包括:
将麦芽糖和月桂酸溶于有机溶剂中,加入酵母展示脂肪酶,于50~60℃反应10~14小时,分离、纯化制得麦芽糖月桂酸酯。
优选的,所述的有机溶剂为丙酮。
优选的,每升有机溶剂中麦芽糖、月桂酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20~100g、50~100g、1~2g。
所述反应置于水浴摇床中进行,水浴摇床转速为150~200转/分钟。
优选的,在分离纯化前加入分子筛,继续搅拌反应10~12h,锁住水分,促进酯化反应进一步进行。
所述的分离、纯化为:离心取上清液,旋转蒸发除去有机溶剂,水洗后溶于正己烷,重结晶。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备:
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶;
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品,可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司),它存在MFα1信号肽序列(Genbank号:M17301),同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号:Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组,提高表达稳定性。
优选的,所述生物印迹所用配体为油酸,它可以诱导酶结构改变,提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115,毕赤酵母细胞诱导培养后,脂肪酶表达并分泌到胞外,同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展示脂肪酶对酯化反应进行催化,可有效提高操作稳定性、耐热性以及重复性,由于酶反应的特异性该酶能大幅度抑制副反应的发生,酯化转化率在80%以上。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法,合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号:AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164),同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker),连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin,同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点,其中pro-ROL为脂肪酶基因,α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板,利用下述引物对,进行PCR扩增,
上游引物:5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’;
下游引物:5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为:模板DNA为1μl,高保真DNA聚合酶0.5μl,dNTP(50mM)0.4μl,上下游引物各0.5μl,10×PCR缓冲液5μl,加水至50μl。
PCR运行条件为:94℃3分钟,35个循环(94℃30秒,60℃1分钟,72℃30秒),72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒,并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒,通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组,用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中,转入电转杯中,冰浴15min,然后在1500V,400Ω,25uF条件下电击10ms,并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上,筛选阳性转化子,然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上,根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h,离心收集细胞;再将细胞置于含有0.5%(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h,离心收集细胞,用水冲洗后,接种至YGC培养基中30℃培养120h,然后3000g离心分钟收集菌体,蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤,然后与2倍体积油酸混合,-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h,用己烷洗涤除去油酸,再进行再真空干燥去除己烷,即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯
实例1取麦芽糖0.2g、月桂酸0.5g,加入含有10mL丙酮的具塞三角瓶,混合、预热10min,然后加入酵母展示脂肪酶0.01g,置于水浴摇床开始反应,转速为200转/分钟,反应温度保持在50℃,反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm),继续反应12h后,离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛,取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂,水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得麦芽糖月桂酸酯产品,烘干、粉碎即可。
实例2取麦芽糖1g、月桂酸1g,加入含有10mL丙酮的具塞三角瓶,混合、预热10min,然后加入酵母展示脂肪酶0.02g,置于水浴摇床开始反应,转速为180转/分钟,反应温度保持在55℃,反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm),继续反应12h后,离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛,取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂,水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得麦芽糖月桂酸酯产品,烘干、粉碎即可。
实施例3采用传统化学法合成麦芽糖月桂酸酯
取麦芽糖0.2g、月桂酸0.5g,加入含有10mL丙酮的具塞三角瓶,混合、预热10min,置于水浴摇床开始反应,转速为200转/分钟,反应温度保持在50℃,反应12h后加入0.5g分子筛(孔径小于2nm),继续反应12h后,离心沉淀除去分子筛,取上清液进行旋转蒸发除去有机溶剂,水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得麦芽糖月桂酸酯产品,烘干、粉碎即可。
实施例4测定反应转化率
将反应液离心除去酶制剂和分子筛,真空旋转蒸发除去有机溶剂,用甲醇(色谱纯)溶解,经0.45μm滤膜过滤,上样测定。色谱条件:HPLC(Agilent 1100Series,USA),Zorbax SB-C18(5μm,250mm×4.6mmi.d)色谱柱,流动相为甲醇/水=90/10(v/v),流速0.8mL/min,柱温30℃,2420型蒸发光散射检测器,进样量15μL。平行测定三次,取平均值。
酯化转化率计算公式如下:
转化率(%)=(单酯摩尔数/糖摩尔数)×100%
通过上述方法检测计算,实施例2中,实例1合成麦芽糖月桂酸酯的转化率达83.2%,实例2合成麦芽糖月桂酸酯的转化率达82.9%。而实施例3采用传统化学法合成麦芽糖月桂酸酯的转化率仅为50%左右。
Claims (4)
1.一种酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法,包括:
将麦芽糖和月桂酸溶于有机溶剂中,加入酵母展示脂肪酶,于50~60℃反应10~14小时,分离、纯化制得麦芽糖月桂酸酯;
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备:
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115,将所得转化子接种于BMMY培养基中,诱导培养72~144小时后离心收集菌体,菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶;
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,以每升有机溶剂计,麦芽糖、月桂酸和酵母展示脂肪酶的加入量分别为20~100g、50~100g、1~2g。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的有机溶剂为丙酮。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述生物印迹中采用的配体为油酸。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011101087935A CN102212592B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN2011101087935A CN102212592B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102212592A true CN102212592A (zh) | 2011-10-12 |
CN102212592B CN102212592B (zh) | 2013-08-14 |
Family
ID=44744124
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN2011101087935A Expired - Fee Related CN102212592B (zh) | 2011-04-28 | 2011-04-28 | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102212592B (zh) |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1995366A (zh) * | 2006-12-15 | 2007-07-11 | 江南大学 | 一种在有机相中酶催化连续合成麦芽糖月桂酸酯的方法 |
CN101285078A (zh) * | 2008-06-10 | 2008-10-15 | 华南理工大学 | 一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法 |
-
2011
- 2011-04-28 CN CN2011101087935A patent/CN102212592B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1995366A (zh) * | 2006-12-15 | 2007-07-11 | 江南大学 | 一种在有机相中酶催化连续合成麦芽糖月桂酸酯的方法 |
CN101285078A (zh) * | 2008-06-10 | 2008-10-15 | 华南理工大学 | 一种酵母展示脂肪酶催化合成己酸乙酯的方法 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
郑穗平: "毕赤酵母表面展示南极假丝酵母脂肪酶B 全细胞催化合成葡萄糖月桂酸酯", 《生物工程学报》 * |
高旭: "连续式酶反应器中脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的研究", 《食品与生物技术学报》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102212592B (zh) | 2013-08-14 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN105200098A (zh) | 一种利用酿酒酵母酶法制备瑞鲍迪甙m的方法 | |
CN102212601B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素a棕榈酸酯的方法 | |
CN102212592B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖月桂酸酯的方法 | |
CN102212591B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖硬脂酸酯的方法 | |
CN102212580B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖月桂酸酯的方法 | |
CN102212584B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉醋酸酯的方法 | |
CN102212586B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法 | |
CN102212593B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成麦芽糖硬脂酸酯的方法 | |
CN102212579B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成葡萄糖豆蔻酸酯的方法 | |
CN102212572B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸油酸酯的方法 | |
CN102212583B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成辛烯基琥珀酸淀粉酯的方法 | |
CN102212590B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成蔗糖棕榈酸酯的方法 | |
CN102212570B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素c共轭亚油酸酯的方法 | |
CN102212578B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成果糖棕榈酸酯的方法 | |
CN102296101B (zh) | 一种微胶囊包埋的紫菜降血压肽的制备方法 | |
CN102212575B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸棕榈酸酯的方法 | |
CN102226209B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e油酸酯的方法 | |
CN102212577B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e琥珀酸酯的方法 | |
CN102212576B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素e亚油酸酯的方法 | |
CN102321598B (zh) | 一种酵母展示型果胶酶协同超声波破碎紫菜细胞的方法 | |
CN102212588B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸单酯的方法 | |
CN102212585B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法 | |
CN102212602B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成维生素a乳酸酯的方法 | |
CN102212574B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸亚油酸酯的方法 | |
CN102212571B (zh) | 酵母展示脂肪酶催化合成l-抗坏血酸epa酯的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130814 Termination date: 20160428 |