CN102212585A - 酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，包括：将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入NaH2PO4和酵母展示脂肪酶，在55～65℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得淀粉磷酸酯。所述的酵母展示脂肪酶制备方法为：将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶。本发明通过将脂肪酶展现在细胞外，利用该酶制剂催化合成淀粉磷酸酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。

Description

酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法。
背景技术
淀粉磷酸酯是由原淀粉与磷酸盐发生酯化而生成的一种淀粉衍生物，属阴离子变性淀粉，具有透明度高、易糊化、胶粘性强、稳定性好、凝沉性弱的特点，特别是在食品工艺中，作为一种食品添加剂，淀粉磷酸酯是良好的乳化稳定剂，清澈稳定的增稠剂，具有良好的冻结融化稳定性。
目前，淀粉磷酸酯大都是由无机磷酸盐(磷酸二氢钠NaH2PO4、三聚磷酸钠STP：Na5P3O10、三偏磷酸钠：STMP(NaPO3)3等)与淀粉浆在弱碱性条件下经酯化反应生成，存在的主要问题是产物含磷量(即：取代度(DS))不高，产物酯化反应速不够快、反应时间过长，导致副反应的发生以及产物水解，从而影响酯化反应效率，并使淀粉磷酸酯成品中掺杂副反应产物。
相较于化学法合成淀粉磷酸酯，生物酶法可以在较短时间内获得高取代度的反应产物。就相同反应体系而言，生物酶法相比化学法显著提升反应效率和产率，均一度和稳定度也有显著提高。同时，采用生物酶法避免了化学法反应条件苛刻(强酸、碱催化、高温高压)、无特异性、产物复杂、副产物多、分离难、安全性差等弊端。脂肪酶是目前酯化合成中使用最广泛的酶，但是生产成本高、固定化过程繁杂费时大大局限了其商业化应用。
发明内容
本发明提供了一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，该方法可提高淀粉磷酸酯合成的酯化反应效率和产率，降低合成成本。
一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，包括：
将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入NaH2PO4和酵母展示脂肪酶，在55～65℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得淀粉磷酸酯；
以重量份计，反应各原料配比可以如下：水80～100份、谷物淀粉5～10份、NaH2PO41～1.2份、酵母展示脂肪酶1～2份。
优选的，所述的分离、纯化方法为：将反应液pH值调节至7.0，经乙醇将淀粉磷酸酯沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥，得到粉末。
优选的，所述的搅拌速率为200～300转/分钟。
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶。
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
所述的脂肪酶基因可选用Genbank号为AF229435的序列，毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为商业化产品，可从Invitrogen公司购得。它的细胞壁α凝集素基因序列的Genbank号为M28164。
载体pPIC9K为商业化产品(如Invitrogen公司)，它存在MFα1信号肽序列(Genbank号：M17301)，同时该载体内信号肽序列上游存在AOX1启动子(Genbank号：Z46233)。重组质粒线性化处理的目的是为了与胞内基因组发生同源重组，提高表达稳定性。
优选的，所述生物印迹所用配体为油酸，它可以诱导酶结构改变，提高转化率。
本发明通过将脂肪酶基因和细胞壁α凝集素基因导入毕赤酵母细胞GS115，毕赤酵母细胞诱导培养后，脂肪酶表达并分泌到胞外，同时利用细胞壁α凝集素将该脂肪酶固定在细胞表面。利用该酵母展现脂肪酶对酯化反应进行催化，不仅提高了操作稳定性、耐热性以及重复性，反应时间也大大缩短，从原来的12小时下降到1～2小时，另外该酵母展现脂肪酶生物催化剂生产成本低，催化合成转化效率高。
具体实施方式
实施例1制备酵母展示脂肪酶
通过人工合成的方法，合成米根霉(Rhizopus oryzae)的脂肪酶基因(Genbank号：AF229435)和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因(Genbank号为M28164)，同时在脂肪酶基因C端加上连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS(linker)，连接后得到核苷酸序列pro-ROL-linker-α-agglutinin，同时在序列两端添加EcoR I和Not I酶切位点，其中pro-ROL为脂肪酶基因，α-agglutinin为细胞壁α凝集素基因。
以上述人工合成序列为模板，利用下述引物对，进行PCR扩增，
上游引物：5’-AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG-3’；
下游引物：5’-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG-3’
PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，dNTP(50mM)0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl。
PCR运行条件为：94℃3分钟，35个循环(94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒)，72℃10分钟。
用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K-ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒。为使目的基因与毕赤酵母GS115发生His 4单位点置换重组，用Sal I对pPIC9K-ROL质粒进行酶切线性化处理。将酶切线性化处理好的目的基因约15μl加入到事先准备好的毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25μF条件下电击10ms，并加入约1ml预冷的山梨醇。将上述混匀的电转产物约400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株。
将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有0.5％(体积百分比)甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，-80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶。
实施例2酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯
实例1取350g谷物淀粉用水配制成35％淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，冷却后加入1g上述制备的酵母展示脂肪酶，然后分批加入10g NaH2PO4，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在60℃，反应1h后停止搅拌，调节pH值至7.0，经乙醇将淀粉磷酸酯沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥，所得粉末即为成品。
实例2取400g谷物淀粉用水配制成40％淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，冷却后加入2g上述制备的酵母展示脂肪酶，然后分批加入15g NaH2PO4，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为250转/分钟，反应温度保持在62℃，反应1.5h后停止搅拌，调节pH值至7.0，经乙醇将淀粉磷酸酯沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥，所得粉末即为成品。
实施例3采用传统化学法合成淀粉磷酸酯
取350g谷物淀粉用水配制成35％淀粉乳(淀粉干基)、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，然后分批加入10g NaH2PO4，置于85-1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在60℃，反应1h后停止搅拌，调节pH值至7.0，经乙醇将淀粉磷酸酯沉淀，洗涤，抽滤，真空干燥，所得粉末即为成品。
实施例4测定取代度和含磷量
用水洗涤低取代度的淀粉磷酸醋和游离磷(以无机盐存在)后用硫酸/硝酸混合酸处理，使结合磷游离出来，加入钼酸按和抗坏血酸，使之形成磷钼蓝，在波长为825nm上用分光光度计测定吸光度，通过标准曲线查出结合磷含量即可计算出取代度(DS)。
结合磷(％)＝(m1V0/m0V1)×100％
DS＝磷的物质的量/葡萄糖残基的物质的量
＝[结合磷(％)×162/30.974]/[(100-水分(％))-(结合磷-K)]
式中，162为淀粉分子中每个葡萄糖残基相对分子质量；30.974为磷的相对原子质量；K为生成磷酸醋淀粉比原淀粉的增量系数，以磷酸醋淀粉一钠盐计，则换算系数为3.8734；m0为样品的质量(mg)；m1为从标准曲线上查得得样品液的含量(mg)；V0为样品液的定量体积(100mL)；V1为用于测定的样品液的等分体积(25mL)。
取代反应效率＝实际取代度/理论取代度×100％
根据上述方法对制得的淀粉磷酸酯样品进行检测，实施例2中，实例1产品的取代度和反应效率分别为0.043和89％，实例2产品的取代度和反应效率分别为0.041和83％。实施例3利用传统方法合成淀粉磷酸酯的取代度和反应效率仅为0.032和75％。
Figure IDA0000058239790000011
Figure IDA0000058239790000021

Claims (4)

1.一种酵母展示脂肪酶催化合成淀粉磷酸酯的方法，包括：
将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入NaH2PO4和酵母展示脂肪酶，在55～65℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得淀粉磷酸酯；
所述的酵母展示脂肪酶通过如下方法制备：
将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；
所述的重组质粒由原始载体pPIC9K和依次插入原始载体pPIC9K中MFα1信号肽下游的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因组成。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：以重量份计，水80～100份、谷物淀粉5～10份、NaH2PO41～1.2份、酵母展示脂肪酶1～2份。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的搅拌速率为200～300转/分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述生物印迹中所采用的配体为油酸。
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