CN108411015A

CN108411015A - 检测牛粪便污染的引物及检测试剂盒

Info

Publication number: CN108411015A
Application number: CN201810489788.5A
Authority: CN
Inventors: 孙达; 张坤; 覃弦; 王媛; 金立波; 林苏娥; 王德仲
Original assignee: Wenzhou University
Current assignee: Wenzhou University
Priority date: 2018-05-21
Filing date: 2018-05-21
Publication date: 2018-08-17

Abstract

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测牛粪便污染的引物及检测试剂盒。本发明提供的检测引物能够特异性地与牛Faecalibacterium菌反应产生条带，而鸡，鸭，人，狗和猪Faecalibacterium菌不能发生反应，在6个物种中，引物特异性达100％。本发明的引物用于牛Faecalibacterium菌检测时，最低检测限(LOQs)为2490拷贝/μl，灵敏度效果极佳；牛粪便样品的同物种检测，阳性率达93.8％(45/48)，稳定性较好。本发明的检测引物及检测试剂盒用于水体污染检测时，能快速判断水体中是否存在牛粪便污染，并定位污染源。

Description

检测牛粪便污染的引物及检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测牛粪便污染的引物及检测试剂盒。

背景技术

牛是世界上分布最为广泛、存栏量最多的大型牲畜之一，且牛肉也是受众群体最大的肉类品种之一。由于国际市场对牛肉的需求量日益增加、牛肉行情持续紧俏等原因，世界活牛饲养数量呈增长趋势，活牛的存栏数量2010年为10.12亿头，2013年已增至10.27亿头。活牛数量的增多带来的是严重的牛粪便污染问题，其粪便造成的饮用水污染对人体的健康以及自然环境带来极大危害。

大部分肠道传染病可通过水环境传染，但是污染源很难确定。现有的技术不能够区分水源中的几种粪便污染，如果能够解决粪便污染来源的示踪问题，将会对水污染治理有重要意义。传统的示踪微生物大肠杆菌(E.coli)、粪肠球菌属(Enterococcus spp.)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、产气荚膜菌(Clostridium perfringens)、普雷沃氏菌(Prevotella)、动物肠道病毒等在水质示踪检测中存在较多局限性，难以准确示踪水体污染程度。水质监测的生物指标无法实时监控水体污染，也无法定位水体污染源。最新的研究表明：Faecalibacterium菌是人和动物肠道中的优势菌群，不同宿主肠道内的Faecalibacterium菌基因上存在显著差异。根据这些基因差异可以区分粪便来源，可极大的弥补传统粪便污染示踪微生物的缺陷。

已有机构利用人类、狗和家禽等肠道内的Faecalibacterium菌16S rRNA基因序列差异性对水中粪便污染来源进行了研究，并确定利用该技术可以区分人源粪便与狗源粪便造成的水污染。然而对于水中可能出现的复杂的粪便污染情况，仅如此区分在水质污染检测中是不够的。

目前，尚无关于牛Faecalibacterium菌的报道，更无针对牛Faecalibacterium菌检测水体中牛粪便污染的方法。

因此开发一种针对牛Faecalibacterium菌检测水体中牛粪便污染的引物对及试剂盒，本发明的引物能够和水体中的牛粪便提取物发生特异结合，实时监测水体污染，并快速准确定水体中的污染源。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种用于牛Faecalibacterium菌检测的引物对，该引物能够和牛Faecalibacterium菌DNA发生特异结合，从而快速判断牛Faecalibacterium菌感染情况。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种用于牛Faecalibacterium菌检测的引物对，其序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

本发明的技术人员采集224份动物粪便样品(鸡，鸭，人，狗，猪，牛)，经高通量测序得到984224条细菌16SrDNA序列。通过将所得序列进行数据库比对，挑选出所有粪便样品中Faecalibacterium菌16SrDNA基因序列，并做物种间的详细对比，设计出两对DNA引物CFY-1和CFY-2，CFY-1序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，CFY-2序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。经PCR检验，引物CFY-1可特异鉴定牛粪便，引物CFY-2不具有特异性。在6个物种(鸡，鸭，人，狗，猪，牛)中，引物CFY-1特异性达100％，实时定量PCR结果显示本发明的引物CFY的最低检测限(LOQs)为2490copies/μl，灵敏度效果极佳，同物种检测，阳性率达93.8％(45/48)，说明引物CFY-1具有较好的稳定性。

因此，本发明的引物对CFY-1可用于牛Faecalibacterium菌的检测，具有特异性强、灵敏度高、稳定性强的优点。

本发明的目的之二在于提供一种目的一的引物对用于检测牛粪便的方法，其能够快速、准确检测样品中是否有牛粪便，对于监测水体污染及确定水体中污染源有重要意义。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种检测牛粪便的方法，包括以下步骤：

1)提取待检样品基因组DNA，得DNA溶液；

2)将步骤1)的DNA溶液和目的一的引物对加入PCR扩增反应液中，进行PCR扩增，得扩增产物；

3)电泳检测步骤2)的扩增产物，观察209bp处是否有条带，有条带则是为阳性。

作为优选的方案，上述PCR扩增反应液包含Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等常用PCR反应试剂，其含量亦为常规。

进一步，上述PCR扩增反应液包含市售通用的2×Taq PCR Master Mix。

作为优选的方案，步骤2)所述PCR扩增过程为：96℃，300s；96℃30s，54℃30s，32个循环。

本发明的目的之三在于提供一种目的一的引物对在检测水中牛粪便污染的应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

本发明的引物CFY-1可特异性扩增牛Faecalibacterium菌的DNA片段，因此可将牛Faecalibacterium菌作为示踪微生物，使用本发明的引物用于检测样品中牛粪便污染情况。

上述检测牛粪便污染对于实时监控水体污染，定位水体污染源有重要意义。

本发明的目的之四在于提供一种目的一的引物对在用于制备牛粪便检测产品的应用。

本发明的引物对牛粪便污染检测特异性高达100％，最低检测限(LOQs)为2490copies/μl，阳性率高达93.8％。采用所述引物对制备的牛粪便检测产品能够快速判定检测样品是否被污染，并定位污染源。

本发明的目的之五在于提供一种实时监测水源中牛粪便的检测试剂盒，其具有组成物易得，成本低，使用简单，检测效率高、准确率高的优点，在水体污染检测中具有重要意义。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

一种牛粪便的检测试剂盒，其包含目的一的引物对CFY-1。

本发明的试剂盒采用高灵敏性的PCR技术来进行牛粪便Faecalibacterium菌的检测，采用目的一的引物对进行PCR扩增，根据扩增情况可分析来判断牛粪便Faecalibacterium菌感染情况。因此，引物对的设计是本发明试剂盒的关键。

作为优选的方案，上述检测试剂盒还包含Faecalibacterium菌通用引物对。通用引物对作为试剂盒的对照引物。

进一步，上述通用引物对为FUP，其序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明的试剂盒采用PCR技术进行检测，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs等的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客户实际需要配置，也可以全部装配入试剂盒。

PCR扩增反应中，引物、Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs均为常见组分，其含量亦为常规。

PCR扩增反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物的通用PCR扩增反应液加入引物对获得。

因而，作为优选的方案，上述试剂盒包含2×Taq PCR Master Mix。

本发明的检测试剂盒还可包含阳性对照或阴性对照。

所述阳性对照含有Faecalibacterium菌保守序列。包括含有Faecalibacterium菌保守序列的质粒或Faecalibacterium菌灭活冻干粉等。

所述阴性对照为不含有Faecalibacterium菌的溶液，如超纯水等。

本发明的目的之六在于提供一种包含目的一特异性引物对的高通量检测芯片。

本发明的有益效果在于：本发明提供的牛粪便检测引物及检测试剂盒将牛Faecalibacterium菌作为示踪微生物，用于牛粪便污染检测具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点，用于水体污染检测时，能快速判断水体中是否存在牛粪便污染，并定位污染源。对于水体污染监测及管理有重要意义。

附图说明

图1为六物种动物粪便验证引物CTF-1特异性。

图2为六物种动物粪便验证引物CTF-2特异性。

图3为引物CTF-1的定量PCR标准曲线。

图4为引物CTF-1阳性率实验部分图。

具体实施方式

以下将(参照附图)对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

实施例1引物设计

采集224份动物粪便样品(鸡，鸭，人，狗，猪，牛)，经高通量测序得到984224条细菌16SrDNA序列。通过将所得序列进行数据库比对，挑选出所有粪便样品中Faecalibacterium菌16SrDNA基因序列，并做物种间的详细对比，设计出两对DNA引物CFY-1和CFY-2，以及通用引物FUP，引物序列如表1所示：

表1引物序列

合成上述引物，引物合成由美吉生物医药科技有限公司完成。

实施例2特异性检测

对鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种的粪便样品进行检测，具体检测步骤如下：

1)提取样品基因组DNA：

取鸡，鸭，人，狗，猪，牛这六个物种共224份的粪便样品，采用MO-BIODNA Isolation kit提取样品基因组DNA；

2)特异性验证：

取步骤1)中的基因组DNA，将同物种的DNA样品进行混合，分别以CFY-1、CFY-2、FUP(通用引物)作为引物，加入Taq PCR Master Mix(2×)7.5微升、正向引物0.5微升、反向引物0.5微升、基因组DNA 1微升；并补加无菌水至15微升；PCR反应，反应温度如下：

①CFY-1：预变性96℃/300s，1次循环；变性96℃/30s，退火54℃/30s，32次循环。

②CFY-2：预变性96℃/300s，1次循环；变性96℃/30s，退火54℃/30s，32次循环。

③FUP：预变性95℃/300s，1次循环；变性94℃/30s，延伸60℃/30s，32次循环。

电泳检测反应产物，结果见图1(CFY-1)和图2(CFY-2)。

如图1所示的引物特异性图，引物CFY-1与牛粪便中Faecalibacterium菌反应产生条带，其它物种无条带说明引物CFY-1与鸡，鸭，人，狗和猪粪便中的Faecalibacterium菌不能发生反应，而FUP有条带，表明无操作误差，说明引物具有特异性。图2表明引物CFY-2无特异性。

因此，本发明的用于检测牛Faecalibacterium菌的引物CFY-1特异性为100％。

实施例3最低检测限

1)绘制定量PCR标准曲线

①目的片段扩增：以CFY-1为引物，使用普通PCR进行扩增，扩增体系为100μl。

②PCR产物纯化：配置1％琼脂糖凝胶电泳，将100ul PCR产物加入到一个大加样孔中，待电泳结束后，紫外观察下切胶回收电泳产物，并使用回收试剂盒对PCR产物进行纯化。

③目的片段与载体连接、转化：将目的片段与pMD 19-T vector相连接，并倒入DH5α大肠杆菌感受态细胞中。

④筛选重组质粒：蓝白斑筛选步骤④中的大肠杆菌，挑选白色单菌落液体培养基扩大培养。

⑤提取重组质粒：使用质粒提取试剂盒提取重组质粒，检测浓度并记录。

⑥稀释重组质粒：用无菌水将重组质粒进行稀释，稀释梯度为10^-1-10^-9。

⑦绘制标准曲线：根据重组质粒浓度、pMD 19-T序列、目的片段序列，计算重组质粒拷贝数，公式如下：

以达到基线时所需的循环数为横坐标，对应的lg(拷贝数)为纵坐标，绘制标准曲线。

2)最低检测限

如图3所示的定量PCR标准曲线，经计算，CFY-1的最低检测限(LOQs)为2490copies/μl，表明本发明的引物具有很高的灵敏度。

实施例4阳性率

48个牛粪便样品，提取DNA作为模板，按照实施例2的PCR反应过程进行PCR扩增。

结果：实验结果部分图见图4。48个DNA样品中有45个样品可以通过引物CFY-1进行PCR扩增并可看到明显条带，其阳性率为93.8％，说明引物CFY-1具有较好的稳定性。

根据以上实验结果，本发明提供的牛粪便检测引物具有特异性强、灵敏度高、稳定性好的优点，用于水体污染检测时，能快速判断水体中是否存在牛粪便污染，并定位污染源。对于水体污染监测及定位有重要意义。并且其可用于制备牛粪便检测试剂盒，使用其检测水质污染更为方便。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

<110> 温州大学

<120>检测牛粪便污染的引物及检测试剂盒

<160> 6

<170> PatentIn version 2.1

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> CFY-1引物对正向引物

<400> 1

TCTGTTATAAAGGAAGAAACAA 22

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> CFY-1引物对反向引物

<400> 2

TCTCCCACACTCAAGCCATC 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> CFY-2引物对正向引物

<400> 3

GGCGGAGCGGCAAGTTGGAG 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> CFY-2引物对反向引物

<400> 4

CCTCTACACCACTCAAGACCG 21

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> FUP引物对正向引物

<400> 5

CTAACTACGTGCCAGCAGCC 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工设计引物

<220>

<223> FUP引物对反向引物

<400> 6

GCCTTCGCCACTGGTGTTCC 20

Claims

1.一种用于牛Faecalibacterium菌检测的引物对，其特征在于，所述引物对序列如SEQID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的引物对检测牛粪便的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待检样品基因组DNA，得DNA溶液；

2)将步骤1)的DNA溶液和权利要求1所述的引物对加入PCR扩增反应液中，进行PCR扩增，得扩增产物；

3)电泳检测步骤2)的扩增产物，观察209bp处是否有条带，如有，则是为阳性。

3.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤2)所述PCR扩增过程为：96℃，300s；96℃30s，54℃30s，32个循环。

4.权利要求1所述的引物对在用于检测水中牛粪便污染的应用。

5.权利要求1所述的引物对在用于制备牛粪便检测产品的应用。

6.一种实时监测水源中牛粪便的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物对。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含Faecalibacterium菌通用引物对。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述通用引物对的序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

9.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含2×Taq PCR MasterMix。

10.一种包含权利要求1所述特异性引物对的高通量检测芯片。